CN101981201A - 产油微生物及改良这些微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了涉及可产生不饱和脂肪酸的产油微生物的组合物和方法，所述不饱和脂肪酸可被纯化及使用。本发明还公开了使用以下的脂肪酸生产拮抗剂来改良所述脂肪酸在总脂质组合物中浓度的方法，所述拮抗剂可抑制或刺激被认为存在于产油微生物中的经典脂肪酸生产途径的某些组件。

Description

产油微生物及改良这些微生物的方法
本申请要求以2006年8月1日提交的美国临时申请60/821,084作为优先权基础，该临时申请通过引用的方式全文纳入本文。
背景技术
大量科学证据表明，(n-3)高度不饱和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(DHA)对心血管疾病、慢性炎症和脑障碍有积极作用；而二十碳五烯酸——也是n-3脂肪酸——已经被发现作为二十酸类固醇例如前列腺素、白三烯等的中间代谢产物发挥功能。
目前，这些高度不饱和脂肪酸的主要来源是鱼，已注意到多种深蓝色鱼类(例如沙丁鱼和鲔鱼)体内的EPA和DHA的量分别为约20％和10％。这种脂肪酸分配比例的出现被认为是经过对最佳比率的自然选择以在每种鱼有最适性能。然而，若要使用鱼油作为这些脂质的唯一来源尚存在一些缺点，例如串味、不能稳定利用以及天然鱼油含量存在差异等问题。另外，若想从这些来源获得高度纯化的(n-3)或(n-6)油，优先地分离和纯化会非常困难。
发明内容
所公开的是涉及真核生物破囊壶菌目(thraustochytriales)和破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的组合物和方法，所述真核生物在培养时可产生大量不饱和脂肪酸例如ω3(n-3)和/或ω6(n-6)油，如DHA、EPA和DPA，由于所有这些组合物可被使用，并且由于其生产方式，它们均能被纯化和使用。
所公开的是涉及产油微生物的组合物和方法，所述微生物在被培养时可产生大量不饱和脂肪酸例如ω3(n-3)和/或ω6(n-6)油，如DHA、EPA和DPA，由于所有这些组合物可被使用并且由于其产生方式，它们均能被纯化和使用。
还公开的是使用以下的脂肪酸生产拮抗剂来改良所述脂肪酸在总脂质组合物中浓度的方法，所述拮抗剂可抑制或刺激被认为存在于产油微生物中的经典脂肪酸生产途径的某些组件。
附图说明
被纳入并构成本说明书的一部分的附图阐述了几个实施方案，并与说明书一起对所公开的组合物和方法进行了阐述。
图1示出所公开的产油微生物产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的推定代谢途径。    
图2示出在以下3类不同发酵环境下于含有2g L-1酵母提取物、8g L-1L-谷氨酰胺、6g L-1海盐和60g L-1葡萄糖的培养基中生长的ONC-T18的脂肪酸分配比例：琼脂板(1.5％琼脂，25℃，27天)、烧瓶(250ml烧瓶中装有50ml，120RPM，25℃，3天)和5L生物反应器(4lpm空气，pO2 90％，25℃，3天)。
图3示出在装有培养基的5L生物反应器中维持168h的破囊壶菌属种ONC-T18的典型生物量、总脂肪酸(TFA)、DHA生产情况和葡萄糖利用情况，所述培养基含有60g L-1葡萄糖、2g L-1酵母提取物、8g L-1谷氨酸和6g L-1盐(4lpm空气、pO2 90％、25℃，pH7-9)。
图4示出破囊壶菌属种ONC-T18与几个来源于日本的破囊壶菌(破囊壶菌属种CHN-1、破囊壶菌科菌种MBIC 11093和破囊壶菌科菌种N1-27)以及纹状破囊壶菌株T91-6的基于18S rRNA基因的进化亲缘关系。
图5示出在各种氮源上培养ONC-T18，例如各纯度级酵母提取物、L-谷氨酸、玉米浆等。L-谷氨酸单独不会促进生物量、总脂肪(TFA)或DHA生产。然而，在存在L-谷氨酸的情况下，包括酵母提取物和玉米浆的各种N源比没有L-谷氨酸时产生更好的结果(涉及实施例11表7)。
图6示出在各种碳源上培养ONC-T18，单糖例如葡萄糖等、蔗糖和糖蜜产生较高的生物量、TFA和DHA(涉及表6&7)。
图7示出水溶性的抗氧剂、植物激素或乙酸钠(简单碳(simplecarbon))与单独标准培养基相比没有提高生物量、TFA或DHA产出。
图8示出ONC-T18在18℃和25℃下的发酵之间的差异。与对照培养物相比，所述较低温度(即18℃)导致葡萄糖摄取显著升高，TFA减半，以及同等的生物量和DHA水平。因此已发现，在25℃下发酵比在18℃下更有效。
图9示出用纯油酸培养ONC-T18。ONC-T18(用纯油酸培养)的脂肪酸分配比例表明大多数油酸被转化成DHA，具有比葡萄糖培养的ONC-T18更高水平的EPA。
图10示出甲基苯甲酸对ONC-T18的脂肪酸组成的效应。ONC-T18(用0.2g/L的甲基苯甲酸培养)的脂肪酸分配比例表明，该化合物能够增加所述分配比例中的EPA比例，而降低DPA(n6)的比例。值为将0.2g/L的甲基苯甲酸与对照相比较的4次实验的平均值。
图11示出用示例的脂肪酸产物拮抗物培养的ONC-T18的气相色谱结果。
图12示出添加氟草敏(Norflurazon)对ONC-T18脂肪酸分配比例的效应。图12示出PUFA的比例随添加氟草敏量的量增加而增加。
图13示出在ONC-T18暴露于氟草敏时，类胡萝卜素含量降低，同时DHA增加。
图14示出当将油酸添加至ONC-T18的培养基中时，观察到了更高的DHA含量，特别是当伴随着生长(通过存在高N和低N而表明)时。
图15示出当将浅蓝菌素添加至ONC-T18的培养基中时，虽然没有观察到每种脂肪酸占总脂肪酸含量的％变化，但是当将总脂肪酸浓度与生物量(mg/g)关联考虑时，则记录到了C16:0和DHA的增加。
具体实施方式
在对本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法进行公开和描述之前，应理解的是，除非另外指明，它们不限于特定合成方法或特定生物技术方法，或者除非另外指明，它们不限于具体的试剂，其本身理所当然可有所改变。还应理解的是，本文所使用术语其目的仅在于对具体实施方案进行描述，而无意于限定。
本领域的技术人员将会认识到或仅使用常规实验就能确定，本文所描述方法和组合物的特定实施方案的多种等价方案。这些等价方案旨在被囊括于下面的权利要求书中。
A.定义
本文中所用术语其目的仅在于描述特定实施方案，并不意欲进行限制。
除非上下文明确指出相反，说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，“一种药物载体”包括两种或多种这类载体的混合物等。
本文中范围可以表示为从“大约”一个具体的数值，和/或至“大约”另一个具体的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从所述一个具体数值和/或至所述另一个具体数值。类似地，当通过在前面使用“大约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此处公开了许多数值，且除了数值本身外每一个数值在此还以“大约”该具体数值公开。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“大约10”。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了“小于或等于该数值”，“大于或等于该数值”以及数值间可能的范围，这正如本领域技术人员所恰当理解的。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个本申请中，以多种不同格式提供数据，这些数据代表了端点和起点，以及这些数据点任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，应该理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之间的数值也认为已经被公开。还应理解的是，两个具体单位之间的每个单位也被公开。例如，若公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。
“降低”或其他形式的降低指的是减少某一事件或特征。应理解的是，这通常与某些标准或预期数值相关，换言之它是相对而言的，但是待指代的标准或相关数值通常并不是必需的。例如，“降低总脂质组合物中的脂肪酸浓度”指的是相对于标准或对照，减少产油微生物内总脂质组合物中的脂肪酸浓度的量。应理解的是，除非特别指明，否则某一化合物或组合物或病症可相对于另一化合物或组合物或病症有所降低。
“升高”或其他形式的升高指的是增加某一事件或特征。应理解的是，这通常与某些标准或预期数值相关，换言之它是相对而言的，但是待指代的标准或相关数值通常并不是必需的。例如，“升高总脂质组合物中的脂肪酸浓度”指的是相对于标准或对照增加产油微生物内总脂质组合物中的脂肪酸浓度的量。应理解的是，除非特别指明，否则某一化合物或组合物或病症可相对于另一化合物或组合物或病症有所升高。
“抑制”或其他形式的抑制意味着阻止或限制某一具体特征。应理解的是，这通常与某些标准或预期数值相关，换言之它是相对而言的，但是待指代的标准或相关数值通常并不是必需的。例如“抑制去饱和酶”指的是相对于标准或对照阻止、限制酶的去饱和活性量或导致其无活性。应理解的是，否非特别指明，否则某一化合物或组合物或病症可相对于另一化合物或组合物或病症被抑制。
“阻止”或其他形式的阻止指的是终止某一具体特征或病症。由于阻止通常比例如降低或抑制更为绝对，因此它并不需要与对照进行比较。本文所使用的某些事物可被降低但不能被抑制或阻止，但是某些可被降低的事物也可被抑制或阻止。可以理解的是，当使用降低、抑制或阻止时，若未明确指明，另外两个单词的使用也被明确地公开。因此，若公开了抑制去饱和酶活性，则也公开了降低和阻止去饱和酶的去饱和酶活性。
术语“治疗有效”指的是所使用组合物的量是足以改善某一疾病或障碍的一个或多个病因或症状的量。这种改善仅需降低或改变，而不必消除。
术语“载体”指的是，就使用意图或目的而言，在与某一化合物或组合物混合时，有助于所述化合物或组合物的制备、储存、给药、送递、有效性、选择性或任何其他特征或对其有帮助的化合物、组合物、物质或结构。例如，可对载体进行选择，以将活性成分的任何降解减少到最小并将受试者体内的任何不良副作用减少到最小。
在本说明书的整篇描述和权利要求书中，单词“包括”以及该单词的变化形式如“包含”和“含有”指的是“包括但不限于”，无意于排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。
本文所使用的术语“细胞”还指各个微生物细胞、各个产油微生物细胞或来源于这类细胞的培养物。“培养物”指的是包含相同或不同类型分离细胞的组合物。
术语“代谢产物”指的是在将某一化合物引入生物环境例如患者内时产生的活性衍生物。
在谈及药物组合物和营养组合物时，所使用的术语“稳定”在本领域通常被理解为：在特定储存条件下于指定时期内活性成分的损失少于某一特定量，该量通常为10％。组合物被认为稳定所要求的时间是与每种产品的用途相关的，并由生产该产品、对其进行质量控制和检查、将其输送给批发商或直接输送给消费者(此时在其最终使用之前再次进行保藏)的商业实践规定。包括几个月时间的安全系数在内，药物的最短产品寿命通常为一年，优选18个月以上。本文所使用的术语“稳定”参照了这些市场真实情况以及在容易实现的环境条件(例如2℃至8℃的冷藏条件)下储存和运输该产品的能力。
说明书和文末的权利要求书中所提及的某一组合物或物品中某一具体元件或组分的重量份表示：所述组合物或物品中该元件或组分与任何其他元件或组分之间的表示为重量份的重量关系。因此，在含有2重量份组分X和5重量份组分Y的化合物中，所存在的X和Y的重量比为2∶5，并且不管该化合物中是否还含有其他组分，X和Y均以该比率存在。
除非明确指出相反，否则某一组分的重量百分比以含有该组分的制剂或组合物的总重量为基础。
“分离中”和任何形式例如“分离”指的是某物处于可被操作或被进一步纯化的形式的情形。分离的及其各种同义形式指的是某物当前所处的状态不同于之前所处的状态。例如，若核糖体RNA分子被从生物体取出、被合成或被通过重组方式产生，则它可以是“分离的”。通常，某一事物的“分离”是相对于其他某物而言的。例如，如本文所述可通过如下方式分离本文述及的产油微生物：例如通过培养产油微生物，使得该产油微生物在不存在可测量(可检测)量的其他生物体的情况下存活。可以理解的是，除非特别指明，任何所公开的组合物均可如本文所公开的那样分离。另外，如本文所述由该产油微生物产生的脂质可分离自该产油微生物的全部的或一部分。
“纯化”和任何形式例如“纯化中”指的是某一物质或化合物或组合物所处状态的同质性比之前的状态更高。可以理解的是，如本文所公开的那样，除非另外指明，某物的纯度可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。例如，若某一指定组合物A的纯度为90％，则这意味着该组合物的90％为A，而该组合物的10％为一种或多种事物，例如分子、化合物或其他物质。例如，若一种公开的真核微生物例如产生35％DHA，则这可被进一步“纯化”，使得最终的脂质组合物具有90％以上的DHA。除非另外指明，否则纯度可由组合物中组分的相对“重量”确定。可以理解的是，除非特别指明，否则任一所公开组合物均可如所公开的那样纯化。
“任选的”或“任选地”指的是随后描述的事件或情况出现与否均可，并且该叙述包括其中所述事件或情况出现的情形及其不出现的情形。
“引物”为一小类这样的探针：它们能支持某类酶操作，并且可与靶核酸杂交，从而使酶操作能够发生。引物可由本领域可获得的核酸或者核酸衍生物或类似物的任一不干扰酶操作的组合制备。
术语“ω-3”、“n-3”、“ω-3”、“ωn-3”及“n-3系列”是指一个多不饱和脂肪酸家族，它们在ω-3位置共同具有碳-碳双键。例如，术语“ω-3”表示第一个双键为从碳链末端甲基端(ω)起的第三个碳-碳键。
术语“ω-6”、“n-6”、“ω-6”、“ωn-6”及“n-6系列”是指一个多不饱和脂肪酸家族，它们在ω-6位置共同具有碳-碳双键。例如，ω-6表示第一个双键为从碳链末端甲基端(ω)起的第六个碳-碳键。
术语“ω-9”、“n-9”、“ω-9”、“ωn-9”及“n-9系列”是指一个多不饱和脂肪酸家族，它们在ω-9位置共同具有碳-碳双键。例如，ω-9表示第一个双键为从碳链末端甲基端(ω)起的第九个碳-碳键。所有双键都是顺式构型，即两个氢原子在双键的相同侧。
术语“产油微生物”是指能够产生油作为其生物量的一部分的微生物。“产油微生物”可以是真核生物或原核生物。例如，产油微生物可以是含油生物，即能够积累占它们干生物量20％以上的油和/或脂肪的生物。产油微生物可以是硅藻、微藻、真菌、细菌、原生生物、酵母、植物(陆生和海生)或藻。
术语“含油生物”是指能够产生超过其干生物量20％的脂肪的任何生物。例如，“含油生物”可以是硅藻、微藻、真菌、细菌、原生生物、酵母、植物(陆生和海生)或藻。
术语“酮类胡萝卜素(ketocarotenoid)”是指含有酮基团的类胡萝卜素。
术语“类异戊二烯”或“萜类”是指来自类异戊二烯通路的化合物或任意分子，包括10碳萜类化合物及其衍生物，例如类胡萝卜素类和叶黄素类。
术语“类胡萝卜素”是指由五碳异戊二烯单元缩合而成的多烯主链组成的化合物。类胡萝卜素可以是无环的，或者以一个(单环)或两个(二环)环端基团结尾。术语“类胡萝卜素”可包括胡萝卜素类和叶黄素类。“胡萝卜素”是指烃类胡萝卜素(hydrocarboncarotenoid)。这样的胡萝卜素统称为“叶黄素”，即它们含有一个或多个氧原子，所述氧原子以羟基官能团、甲氧基官能团、氧代官能团、环氧官能团、羧基官能团或醛官能团的形式，或者在糖苷、糖苷酯或硫酸酯中。特别适合于本发明的类胡萝卜素为单环类胡萝卜素和二环类胡萝卜素。
术语“酮基”或“酮基团”可互换使用，是指这样的基团，即其中的一个羰基结合有两个碳原子：R2CO(R均不为H)。
本文使用的术语“脂肪酸生产拮抗剂”是指脂肪酸亚单元和脂肪酸通路的调节物。
本文使用的术语“脂肪酸亚单元”或“脂肪酸亚单元类”是指所公开的产油微生物生产PUFA的代谢途径中涉及的16、18、20、22或24碳脂肪酸。例如，“脂肪酸亚单元类”可以包括如图1中所示的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸。
“脂肪酸亚单元”还可指所公开的产油微生物生产PUFA的代谢途径中涉及的具有1、2、3、4、5或6不饱和度的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸。另外的实施方案可包括有或无不饱和度的奇数碳脂肪酸，例如在海洋生物中发现的15、17、19和21碳脂肪酸。
本文使用的术语“脂肪酸通路调节物”是指能够抑制所公开的产油微生物生产PUFA的代谢途径中涉及的一种或多种酶的化合物。
这份申请通篇中引用了多篇出版物。这些出版物的公开内容通过援引全文纳入本申请中，目的在于更为全面地描述本申请所属的现有技术的状况。所公开参考文献还就其中含有的内容通过援引分别地和具体地纳入本文，所述内容在引用该参考文献的句子中进行了阐述。
公开的不仅是可用于本文公开的方法中的组合物本身，而且是可用于制备所公开组合物的组分。在本文中公开了这些物质和其他物质，并且可以理解的是，在公开这些物质的组合、子集、相互作用、群组等时，尽管这些化合物的每种不同的各个和全部的组合和排列可能并未明确地公开，但每种都在此被特别地考虑和描述。例如，如果公开并讨论了破囊壶菌科某一具体的种，并且讨论了对包括破囊壶菌科的种在内的多种生物体所进行的多种修饰，那么除非特别指明相反，否则破囊壶菌科的这些种和可能的修饰的每种和各种组合和排列均得到特别地考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C，并且还公开了一类分子D、E和F，同时公开了组合分子的实例A-D，则即使没有每个逐一列举，每个也被单独和共同地考虑，有意义的组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E以及C-F被认为公开。同样，这些的任何子集或组合也被公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子群也被认为是公开的。这一概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和应用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果有多个可以实施的其他步骤，应当理解的是，所述其他步骤的每一步都可以与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合一起来进行。
B.组合物
公开了破囊壶菌目的产油微生物，优选具有产生脂质的能力的破囊壶菌属种或裂殖壶菌属(Schizochytrium)种，所述脂质例如脂肪酸，例如不饱和脂肪酸，如ω-3脂肪酸、如ω-6脂肪酸和ω-9脂肪酸，如(n-3)系列的二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳五烯酸(EPA)、(n-6)系列的DPA和(n-9)系列的棕榈酸和硬脂酸。
所公开的产油微生物还可产生抗氧化剂，例如但不限于类胡萝卜素化合物胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)和叶黄素化合物虾青素、玉米黄素、β-隐黄素、角黄素和海胆酮。
还公开了产油微生物的分离和生长条件。例如，分别和共同公开了产生所公开脂质和抗氧化剂的异养生长条件。因此，通过使用所公开的产油微生物，能有效产生(n-3)系列的DHA、EPA和DPA及/或(n-6)系列的DPA及/或类胡萝卜素系列的抗氧化剂化合物及/或叶黄素系列的抗氧化剂化合物，它们可用作或用于营养制品、食品添加剂、药物或工业。
公开了含有产油微生物的组合物，所述产油微生物包括破囊壶菌属种(本文公开的一个实例是ONC-T18菌株，其ATCC保藏编号为PTA-6245)或由其组成。
可以理解的是，还公开了表述为ONC-T18的产油微生物以及分离自所述生物体的任何克隆、经修饰生物体或基因。所公开的产油微生物具有产生不饱和脂肪酸(如含有ω-3系列的DHA、EPA和DPA以及ω-6系列的DPA的脂质)和各种抗氧化剂(如类胡萝卜素、叶黄素和酚类物质)的能力。
还公开了产生含所述化合物的生物菌体的方法。进一步公开了利用产油微生物来制备ω-3、ω-6和类胡萝卜素化合物的方法。还公开了生产微生物来源(或单细胞来源)的油的方法。
另外，公开了由所公开产油微生物和任何子代(经遗传修饰或以其他方式修饰)所产生的脂肪酸和类胡萝卜素，补充有脂质和抗氧化剂的各种饲料、营养制品、药物和食品，以及将这些化合物用作各种饲料和食品的添加剂的方法。
授权给Barclay的美国专利No.5,130,242公开了一种收集和筛选方法，以分离用于产生ω-3脂肪酸并具有如下特征的微生物菌株：1)能异养生长；2)产生高含量的ω-3脂肪酸；3)单细胞的；4)产生低含量的标准和ω-6脂肪酸；5)无着色的、白色或无色的细胞；6)耐热的(如在30℃以上生长的能力)；和7)具有广耐盐性(如在较宽范围盐度但优选在低盐度下生长的能力)。
该‘242专利的公开内容还描述了异养生产具有高浓度ω-3脂肪酸的全细胞或经提取的微生物产物的方法，所述ω-3脂肪酸随后可用于动物食品或者人食品。该方法使用了通过该专利公开的收集和筛选方法鉴定的微生物。将这些微生物——破囊壶菌目——在磨碎的谷物中培养。为提高ω-3脂肪酸的产生，使用低温胁迫(stressing)和高溶解氧，同时添加抗氧化剂、生长因子、维生素和磷。提取得到的产物含有高浓度的ω-3脂肪酸(如C20:5w3、C22:5w3和C22:6w3)和低浓度的ω-6脂肪酸(如C20:4w6和C22:5w6)。具体而言，C20:5w3与C22:6w3脂肪酸的比率为从1∶1至1∶30。C22:5w3与C22:6w3脂肪酸的比率为从1∶12至最低仅为痕量的C22:5w3。同样，该微生物产生以重量计占总脂肪酸的0.6至0.72％的DHA、0至5％的DPA和0至18.9％的EPA。
Barclay的美国专利No.6,451,567公开了一种用于在含有钠盐(如硫酸钠)的无氯培养基(＜3g/L)中培养破囊壶菌和裂殖壶菌的方法。该无氯培养基所得到的细胞团大小小于150μm。所公开方法可生产用于水产养殖用食品的微生物和提取物。该食品的其他组分包括亚麻籽、油菜籽、大豆和鳄梨粉。该微生物每天可产生的ω-3脂肪酸最高为1.08g/L培养基。该‘567的公开内容进一步描述了各种培养基，所述培养基包括海水、葡萄糖(1、3、5或10g/L)、酵母提取物(0.01、0.2、0.4和5g/L)、其他氮源(例如蛋白水解产物(1g/L)、肝脏提取物(1g/L)、谷氨酸(5g/L)、谷氨酸单钠(MSG)(3g/L))和其他盐、痕量维生素和矿物质(如KH2PO4、MgSO4和明胶提取物)。
Yokochi等人的美国专利No.6,582,941公开了裂殖壶菌属种菌株SR21和属于同一个种的另一裂殖壶菌菌株，所述种具有产生含高浓度ω-3 DHA和/或ω-6 DPA和低浓度EPA的脂肪酸组分的能力。同时，公开了培养这类微生物和分离这类脂肪酸的方法。所使用的培养基含有海盐、酵母提取物(0.2、1.0或10g/L)、玉米浆(0.5、1.0或10g/L)、葡萄糖(10-120g/L)和其他盐(例如NH4OAc、磷酸盐)。该脂肪酸组合物含有的DHA以重量计占生物量的约15至20％(以重量计占总脂肪酸的约28％)。该组合物可用于食品(如婴儿牛奶)中。
Bailey等人的美国专利No.6,607,900公开了一种用于培养真核微生物(如裂殖壶菌种ATCC No.20888)的方法，所述真核微生物能产生的多不饱和脂质(尤其是ω-3和-6脂肪酸)占其生物量的至少20％。该方法包括在含碳源和氮源的培养基中培养该微生物。还公开了使用低溶解氧水平(小于3％)和低氯离子水平(小于3g/L)来提高产量。该微生物具有的脂质产量为至少0.5g/L/h。脂质组分为以重量计占生物量的15％至20％(以重量计占总脂肪酸甲酯的约35％)的DHA。
Komazawa等人的美国专利申请公开文本No.2004/0161831公开了具有产生DHA的能力的破囊壶菌菌株(LEF1，日本Institute ofBioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science andTechnology的编号为FERM BP-08568)。通过在常规培养基中培养，该微生物可产生具有以重量计至少50％DHA的油脂。该油脂可由脂肪酶处理，然后分离DHA。该油脂可用于食品或饮品中，或者可水解DHA来产生山酸。
1.脂肪酸
脂肪酸是以末端带有羧基基团的烃链，如果它们含有至少一个碳碳双键则被称为不饱和的，而在它们含有多个这样的键时则被称为多不饱和的。由于这些双键的位置，长链多不饱和脂肪酸(PUFA)或高度不饱和脂肪酸(HUFA)可被分为(n-3)和(n-6)系列。大量科学证据表明，(n-3)高度不饱和脂肪酸例如DHA对心血管疾病、慢性炎症和脑障碍有积极作用。另一方面，(n-6)脂肪酸被认为是二十酸类固醇例如前列腺素、白三烯等的中间代谢产物。
多不饱和脂肪酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳-碳双键和/或碳-碳三键。例如，多不饱和脂肪酸可包含3-8、4-7或5-6个碳-碳双键和/或碳-碳三键。
目前，这些高度不饱和脂肪酸的主要来源是鱼，已注意到多种鱼种类(例如沙丁鱼(sardine)、鳀鱼(anchovy)、沙丁鱼(pilchard)和鲔鱼)体内的EPA和DHA的量分别为约20％和10％。然而，若要使用鱼油作为这些脂质的唯一来源尚存在一些缺点，例如串味、在利用度方面存在不可控的波动、天然鱼油含量存在差异以及如果处理不正确可能累积有害环境污染物等问题。另外，若想从所述来源获得高度纯化的(n-3)或(n-6)油，不通过大量处理而优先分离和纯化所需的油脂是非常困难的。具体而言，高浓度形式DHA在新生儿补品市场上有很好的前景。若鱼油为所述产品的来源，那么不得不优先地从EPA中大量分离DHA。很显然的是，需要这些高度不饱和脂肪酸的高度纯化的且适合生产/或客户的来源的替代来源。一种这样的来源是使用脂肪酸生产拮抗剂，该拮抗剂直接作用于脂质代谢通路或者那些与脂肪酸生产有关的通路，例如类胡萝卜素通路，由于类胡萝卜素在产油微生物中的抗氧化剂性质使得该通路与脂质平行产生。
Shirasaka等人(2005)的Mycoscience 46：358-363使用氰钴胺素(cyanocobalamin)和对甲基苯甲酸来改良裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)SR21的脂肪酸组合物，在氰钴胺素(维生素B12的活性成分)的情况下该改良通过向上调节负责将丙酸转化成琥珀酸的依赖于钴胺素的甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmanoyl-CoA mutase)；以及在添加对甲基苯甲酸的情况下，通过剂量依赖的方式降低ω-6 DPA浓度及升高EPA浓度。
除了鱼油之外，各种微生物(主要是海产的)能产生和/或积累(n-3)系列的二十二碳六烯酸。特别有意义的是这样一个事实：微生物生产不会受制于由外界变化例如季节、天气和食品供应引起的波动。例如，已知以下产油微生物具有产生DHA的能力：来自深海的细菌海产弧菌(Vibrio marinus)(ATCC 15381)、弧菌种(Vibrio sp.)T3615、深海细菌(Photobacterium profundum)SS9、海洋被孢霉(Mortierellamarina)MP-1和Psychromonas kaikoae(ATCC BAA-363T)；微藻种例如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、隐秘小环藻(Cyclotellacryptica)和高山被孢霉(Mortieralla alpina)(1S-4)；以及原生生物破囊壶菌属种(ATCC 20892)、金黄破囊壶菌(Thraustochytriumaureum)(ATCC 34304)和粉红破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)。但是，根据一种利用这些经纯化的生物体的方法，每克生物量/每升产生的花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的量较低，介于10至500mg之间。一些实例和代表性的产生微生物油的生物体示出于图5。
已表明ω3脂肪酸具有有益效果，并且本文所公开的油和组合物可就其以下作用而得以应用：对囊性纤维化病(Cochrane DatabaseSyst Rev.3)、类风湿性关节炎(Drugs 63：845-53)、哮喘(Ann AllergyAsthma Immunol 90：371-7)和血栓形成性中风(Prev Cardiol 6：38-1)、心脏保护方面的消炎作用；以及对动脉粥样硬化和心律失常(Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids.63：351-62)的直接作用；在乳腺癌细胞系和前列腺癌细胞系中癌增殖的抑制和在动物实验中减少癌细胞(Am J Clin Nutr 77：532-43)；对精神分裂症(JNeural Transm Suppl 64：105-17)和其他精神病(Can J Psychiatry48：195-203)的抗紧张作用；可用于正常新生儿发育并用于治疗新生儿感染(Eur J Pediatr 162：122-8)的免疫营养补充剂；并且它可通过直接减弱引起神经性疼痛和炎性疼痛的神经元病变和神经节病变用于治疗病理性疼痛(Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids68：219-24)。
2.破囊壶菌科
a)ONC-T18
产油微生物的一个实例为海洋微生物ONC-T18。本文所公开的海洋微生物ONC-T18是作为产生PUFA的微生物分离群体(trip)的一部分而被收集的，从该群体中分离了60种以上的纯培养物(详见表7)。另外，从加拿大新斯科舍芬迪湾阿德沃基特港地区的盐沼草叶片中也分离到了ONC-T18。通过显微检查、系列培养纯化技术和DNA测序技术，该菌株被发现是属于破囊壶菌属的单体微生物。所有菌株和两个ATCC比较培养物(ATCC 20891&MYA-1381)均在含0.5％葡萄糖、0.2％蛋白胨、0.2％酵母提取物的海水(SW)中生长，并进行气相色谱(脂肪酸甲酯，FAME)分析。
图6示出ONC-T18和盘根足虫目(Labyrinthulida)其他成员之间推定的系统分支树图，该系统分支树图是基于通过使用高度保守18S核糖体RNA基因获得的序列比较结果。
图4示出使用邻接法和重复抽样分析技术形成的系统树，其目的是确定ONC-T18与破囊壶菌科其他成员的关系，该系统树也基于对18S核糖体RNA基因直接测序，并使用相似性矩阵与公众领域中的其他序列比较。
使用经典的松树花粉诱集(pine pollen baiting)技术，然后在选择培养基上培养，最初分离到了ONC-T18。具体而言，制备含有溶于1升0.2μm过滤的海水中的5g L-1葡萄糖、2g L-1蛋白胨、2g L-1酵母提取物的营养培养基。然后使用Bligh和Dyer提取法以及PUFA气相色谱技术确定ONC-T18的脂肪酸分配比例。色谱结果证实了该菌株产生增加量的总脂肪酸(TFA)、DHA，以及显著量的EPA和DPA(包括n-3和n-6脂肪酸)的能力。
所公开的产油微生物(包括ONC-T18)可用于一种制备包含DHA、EPA和DPA的脂质或脂肪的方法中，但所述产油微生物不限于上述ONC-T18或PTA-6245菌株，而是包括所述菌株的任何衍生物，不论该衍生物是否是通过遗传修饰、化学诱变、发酵调节，还是产生所述菌株的突变体的任何其他方式得到，籍此经这些修饰的产物具有本文公开的遗传特征、形态特征和/或功能特征，例如产油微生物。
公开了能产生具有独特脂质类别特征的脂质组合物的产油微生物，并公开了维持这类具有相同的高度功能性及其他价值的脂质的稳定、可靠和经济的来源的难题的解决方案。因此，本文公开了产生更高浓度的(n-3)系列DHA和(n-6)系列DPA的野生型菌株，以及被设计用于产生更高浓度的这些多不饱和脂肪酸的变种和重组菌株。这类变种或重组微生物包括被设计为具有如下特征的变种和重组菌株：在使用相同条件和培养基培养时，它们具有的所述脂质含量较原始野生型菌株产生的那些脂质含量更高。另外，还包括可筛选被设计用于具有如下特征的微生物：它们与相应野生型菌株相比可产生含有相似量的(n-3)系列DHA、EPA和(n-6)系列DPA的脂质，但是所述微生物可有效使用具有更高性价比的底物。
还公开了包含破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中所述产油微生物可产生不饱和脂肪酸。该多不饱和脂肪酸可为例如ω3或ω6脂肪酸，例如DHA和DPA。
还公开了包含一种或多种破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中当所述产油微生物在补充了脂肪酸产物拮抗物的情况下生长时，它(们)可产生特定脂肪酸。
还公开了包含一种或多种破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中通过在标准发酵培养基中添加一种或多种脂肪酸生产拮抗剂，所述产油微生物可产生升高量的特定不饱和脂肪酸，例如ω-脂肪酸，如EPA。在图9及实施例14(c)中阐述了以这种方式使用油酸。
公开了含产油微生物的组合物，其中所述组合物可产生脂质。
还公开了含一种或多种产油微生物的组合物，其中所述组合物可产生脂质，其中所述脂质包括本文公开的脂质。
还公开了包含一种或多种破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中所述产油微生物可产生酮类胡萝卜素。酮类胡萝卜素包括，但不限于胡萝卜素和叶黄素，如β-胡萝卜素和虾青素。
类胡萝卜素是天然存在的脂溶性化合物，从普遍存在的(ubiquitous)C5异戊烯焦磷酸前体及其结构异构体二甲基丙烯焦磷酸(dimethyallyl pyrophosphate)合成。类胡萝卜素组成一个丰富的、高度多样的化合物类组。在该化合物类组中存在两类，即烃类胡萝卜素、胡萝卜素，以及胡萝卜素、叶黄素的氧化衍生物。
类胡萝卜素还是地球上的天然化合物的最丰富和多样的类组之一，是我们居住的世界出现波动的原因。类胡萝卜素通常被用于饲料、食品和营养产业中。它们普遍由光合生物(包括蓝细菌)产生，但也广泛散布至非光合细菌和真菌中(Goodwin，The Biochemistry ofCarotenoids.New York：Chapman and Hall(1980))。虽然类胡萝卜素被分类为次级代谢产物，但是已知它们对植物生长和光合作用是至关重要的。类胡萝卜素也是许多高等生物(包括人)必需的，许多的这些高等生物不能合成这些化合物。因此，对许多生物来说，饮食摄入是类胡萝卜素的唯一来源。其结果是，近年来对类胡萝卜素的饮食来源及实际消费的研究已经受到了广泛关注。在2006年，全球类胡萝卜素市场据估计价值达9.547亿美元，预计到2010年这将升至10.692亿美元(carotenoids：A Global Strategic Business Report，2006)。
饮食中的类胡萝卜素的一个功能是维生素A(视黄素)的前体。显著的维生素A缺乏会导致儿童可预防的失明，而还会增加患严重感染导致的疾病和死亡的风险(WHO)。作为饮食抗氧化剂的类胡萝卜素例如β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素和叶黄素，具有显著的抗癌活性，并且在慢性病的预防中发挥重要功能(Edge，B-Biology 4，41，189-200(1997)；Singh，Oncology-New York，12，1643(1998)；Smith，British Journal of Biomedical Science，55，268-275(1998))。另外，已经将类胡萝卜素消费量的增加与以下疾病发病的减少关联起来了：退行性疾病，例如老年性黄斑变性(老年失明的主要原因)，以及某些癌症和慢性心脏病(Basu，JAOCS，78(7)，665-675(2001)；Mares-Perlmanet al.，J Nutr，132(3)，518S-524S(2002))。
由于类胡萝卜素的共轭双键的主链，它们是有效的生物抗氧化剂，能够吸收施加于类胡萝卜素链上的单线态氧的激发能，引起所述类胡萝卜素分子的降解，但会阻止其他分子或组织受到损伤(Schagerl andMuller，J Plant Physiol 2005)。类胡萝卜素可分成两种结构上不同的类，即胡萝卜素和叶黄素。胡萝卜素具有一个烃主链，而叶黄素包含一个或多个含氧的官能团(Armstrong and Hearst，Faseb J，10(2)，228-3(1996)；Armstrong，Annu Rev Microbiol，51，629-59(1997))。胡萝卜素是多种生物所共有的，具有高度保守的生物合成模式。叶黄素与之不同，仅由一小撮(a small clutch of)生物产生。终产物及合成路线经常是物种特异性的。在类胡萝卜素中，叶黄素获得了最大的关注，特别是β-胡萝卜素、角黄素和虾青素。β-胡萝卜素占领全球市场的最大部分，而角黄素和虾青素分别占据市场的14.92％和21.58％(Carotenoids：A Global Strategic Business Report，2006)。
叶黄素涵盖多种化合物，例如酮类胡萝卜素、海胆酮和角黄素，通过在β-胡萝卜素的β-紫罗兰酮环(β-inone ring)位置4和4’分别添加一个或两个羰基而合成。该反应由统称为β-胡萝卜素酮酶基因的一类基因催化。β-隐黄素(β-crytpoxanthin)和玉米黄素也被分类为叶黄素，它们是通过用羟基直接置换β-胡萝卜素的β-紫罗兰酮环位置3和3’的氢原子而合成(Tian and DellaPenna，Arch Biochem Biophys，430(1)，22-9(2004))。另外，存在大量的结合了酮化和羟基化的类胡萝卜素，例如3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、金盏花黄质(adonixanthin)和金盏花红素(adonirubin)。虽然本文列出的所有化合物本身都是具有重要性质的有价值的化合物，但是值得注意的是，它们构成了生物合成虾青素的重要前体。虾青素是该通路的终产物，在β-胡萝卜素骨架的β-紫罗兰酮环3、3’和4、4’碳被羟基化及酮化(ketolated)。而从β-胡萝卜素到虾青素的实际通路还没有被完全确定，并且可能会被证明是物种特异的(Tao et al.，Metab Eng.(2006))。
还公开了含产油微生物的组合物，其中所述组合物产生抗氧化剂。
还公开了组合物，其中所述产油微生物包含破囊壶菌目的成员。
还公开了组合物，其中所述产油生物具有的18S核糖体RNA基因序列与SEQ ID NO：1具有至少80％的同一性。
还公开了组合物，其中所述产油生物具有的18S核糖体RNA基因序列与GenBank编号为DQ374149的序列具有至少80％的同一性。
可以理解的是，本文所述产油微生物的任何形式的特征，例如产油微生物的遗传学、脂质特征或分类，均可用于表征本文所公开的产油微生物。产油微生物可包括破囊壶菌科的一种或多种微生物，它们的实例为ATCC编号为20888、20889、20890、20891、20892和PTA-6245的微生物。有很多可使用的、与所述生物体以及它们产生的不饱和脂肪酸或类胡萝卜素相关的特征。可以理解的是，例如，这些特征可以任何组合或排列形式被用于限定一个或多个系列的生物体、油或抗氧化剂。例如，一个特征是该生物体自身的类别、该生物体的遗传学身份、该生物体的脂质和抗氧化剂分配比例，以及该生物体的生长条件。
b)类别
可用于本文所述方法中的产油微生物可来自网黏菌门(phylumLabyrinthulomycota)。所述产油微生物可来自网黏菌纲(classLabyrinthulomycetes)。所述产油微生物可来自破囊壶菌亚纲(subclass Thraustochytridae)。所述产油微生物可来自破囊壶菌目(order Thraustochytriales)。所述产油微生物可来自破囊壶菌科(family Thraustochytriaceae)。所述产油微生物可来自破囊壶菌属(genus Thraustochytrium)。所述产油微生物可为破囊壶菌属种。所述产油微生物可为金黄破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)。所述产油微生物可为粉红破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)。所述产油微生物可为纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)。产油微生物可为裂殖壶菌属(genus Schizochytrium)。所述产油微生物可为裂殖壶菌属种。所述产油微生物可为任何上面列出产油微生物的修饰形式。所述产油微生物还可包括所述原核生物纲、亚纲、目、科或属的任何目前未知或分离的成员。产油微生物的组合可为本文公开的任何产油微生物的任何组合，包括一个或多个破囊壶菌属种、裂殖壶菌属种、金黄破囊壶菌、纹状破囊壶菌和粉红破囊壶菌。
来自破囊壶菌科的产油微生物可为任何上文公开的那些产油微生物。产油微生物可包括ATCC编号为PTA-6245的生物。
c)遗传学
产油微生物可具有18S rRNA序列SEQ ID NO：1。产油生物可具有GenBank编号DQ374149中所述的18S rRNA序列。产油微生物可具有与SEQ ID NO：1具有约90％的同源性或本文公开的任何其他同一性的18SrRNA序列。产油微生物可具有在严格条件或本文公开的任何其他条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的一部分杂交的18S rRNA序列。
生物体核酸的序列相似性/同一性和核酸杂交可如本文所述。具体而言，使用BLAST(基本的局部比对搜索工具)算法将SEQ ID NO：1与在基因组数据库GenBank(美国国家生物技术信息中心，美国国家卫生研究所，贝塞斯达，马里兰，美国)中的核酸序列相比较，将SEQID NO：1鉴定为与几个真核破囊壶菌的物种相关(91％相似性)，与破囊壶菌属种(thraustochytrium sp.)CHN-I[AB126669](94.5％相似性)和破囊壶菌科菌种(thraustochytriidae sp.)N1-27[AB073308](95.5％相似性)密切相关，并且与纹状破囊壶菌[AF265338]最为密切相关(97.5％相似性)。
3.植物
脂肪酸生产拮抗剂还可用于影响产油植物中的产油率，所述产油植物包括转基因物种及天然存在的物种，并且包括代表性作物例如油菜籽、亚麻籽、大豆和向日葵。整合所述拮抗剂的方法包括，例如对植物周围区域浇水来经根系整合到植物中，作为活性成分添加到喷雾剂中来直接整合至植物细胞。另外，通过直接浸泡、蒸汽或注射使这些化合物经气孔或皮下进入植物细胞也被认为是有效的方法。
4.(1)序列相似性
可以理解的是，如本文所述，使用术语同源性和同一性是指与相似性具有相同的含义。因此，例如若在两个非天然序列之间使用单词同源性，则可以理解的是，这并不一定指示这两个序列之间的进化关系，而是着眼于其核酸序列之间的相似性或亲缘关系。许多用于确定两个进化相关分子之间的同源性的方法可以通常适用于任何两个或多个核酸或蛋白，目的是测量序列相似性，而不管它们在进化上是否相关。
一般而言，可以理解的是，确定本文所公开基因和蛋白质的任何已知变体和衍生物或可能出现的那些变体和衍生物的一种方法是通过用与特定已知序列的同源性来限定所述变体和衍生物。本文公开的具体序列的这种同一性也在本文其他地方进行了阐述。一般而言，本文公开的核酸和蛋白质的变体通常与指定序列或天然序列具有至少约50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同源性。本领域的技术人员容易理解如何确定两个蛋白或核酸例如基因的同源性。例如，可在将两个序列进行比对之后计算同源性，从而使得同源性处于最高水平。
计算同源性的另一种方法是可通过已公开的算法进行。用于比较的序列的最佳比对可通过如下方法进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482，1981)、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)、这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 SeienceDr.，Madison，WI)或者核查。
核酸的相同类型的同源性可通过用例如在如下文献中公开的算法获得：Zuker，M.Science 244：48-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710，1989，Jaeger et al.MethodsEnzymol.183：281-306，1989，至少就其与核酸比对相关的内容通过引用将这些文献纳入本文。可以理解的是，通常可使用任何方法，并且在某些情况下，这些不同方法的结果可能有所不同，但是本领域的技术人员可以理解，若使用这些方法中的至少一种方法得到了同一性，则认为该序列具有所述同一性，并在本文中被公开。
例如，本文所使用被认为与另一序列具有特定百分比同源性的序列指的是这样一个序列：它具有通过上述任何一种或多种计算方法计算得到的所述同源性。例如，如本文所定义的，如果使用Zuker计算方法计算得到第一个序列与第二个序列具有80％的同源性，那么即便通过任何其他计算方法计算发现所述第一个序列与所述第二个序列并没有80％的同源性，所述第一序列与所述第二序列也具有本文所述80％的同源性。作为另一个实例，如本文所定义的，如果使用Zuker计算方法以及Pearson和Lipman计算方法计算得到第一个序列与第二个序列具有80％的同源性，那么即便通过Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunscn计算方法、Jaeger计算方法或任何其他计算方法计算发现所述第一个序列与所述第二个序列并没有80％的同源性，所述第一个序列也与所述第二个序列具有本文所述80％的同源性。作为又一个实例，如本文所定义的，如果使用每一种计算方法均计算得到第一个序列与第二个序列具有80％的同源性(尽管在实践中不同的计算方法通常会计算得到不同的同源性百分比)，则所述第一个序列与所述第二个序列具有本文所述80％的同源性。
(2)杂交/选择性杂交
术语杂交通常指至少两个核酸分子(例如引物或探针与基因)之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用指的是在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间以核苷酸特异方式出现的相互作用。例如，G与C相互作用或者A与T相互作用就是序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用出现在核苷酸的Watson-Crick界面或Hoogsteen界面。两个核酸的杂交受本领域技术人员所知的多个条件和参数的影响。例如，反应的盐浓度、pH和温度都会影响到两个核酸分子是否会杂交。
两个核酸分子之间选择性杂交的参数为本领域技术人员所熟知。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件可被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格度受控于杂交和/或洗涤步骤的温度和盐浓度两者。例如，实现选择性杂交的杂交条件可包括：在高离子强度溶液(6×SSC或6×SSPE)中于较Tm(解链温度，在此温度下有一半分子与其杂交伴侣解离)低约12-25℃的温度下杂交，然后在选定的温度和盐浓度的组合下洗涤，以使得洗涤温度较Tm低约5-20℃。温度和盐条件容易在预实验中通过经验确定，在该预实验中，固定在滤器上的参照DNA样品与目的标记核酸杂交，并随后在不同严格条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交而言，杂交温度通常较高。如上所述，该条件可用于实现严格度，或者为本领域已知(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989；Kunkelet al.Methods Enzymol.154：367，1987，至少就其与核酸杂交相关的内容通过援引将其纳入本文)。DNA:DNA杂交的优选严格条件为在约68℃(在水溶液中)下于6×SSC或6×SSPE中，然后在68℃下洗涤。如若需要，杂交和洗涤的严格度可随所需互补程度的减少而相应降低，并且还取决于其中进行任何变异性搜索的区域的G-C或A-T的富集度。同样，如若需要，杂交和洗涤的严格度可随所需同源性的增加而相应增高，并且还取决于其中任何需要高度同源性区域的G-C或A-T的富集度，这些均为本领域所知。
定义选择性杂交的另一种方法是通过查看一种核酸与另一种核酸结合的量(百分比)。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是指在至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的限量核酸与不限量核酸结合时的条件。通常，所述不限量引物为例如10、100或1000倍过量。这类分析可在如下条件下进行：其中限量和不限量引物较其Kd低例如10、100或1000倍，或者其中仅一种核酸分子为10、100或1000倍，或者一种或两种核酸分子高于其Kd。
定义选择性杂交的另一种方法是在需要杂交以促进所需酶操作的条件下，查看被酶操作的引物的百分比。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是在至少约50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的引物在促进酶操作的条件下被酶操作时的条件；例如，若酶操作是DNA延伸，那么选择性杂交条件是在至少约50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的引物分子被延伸时的条件。优选的条件还包括制造商所建议的那些条件或者本领域认为适合酶进行操作的那些条件。
正如同源性的情况一样，可以理解的是，本文公开了多种用于确定两个核酸分子之间杂交水平的方法。可以理解的是，这些方法和条件可在两个核酸分子之间产生不同的杂交百分比，但是除非另外指明，否则满足任一方法的参数即可。例如，若需要80％的杂交，并且只要杂交在这些方法的任一个中出现在所需参数范围内，则认为它被本文所公开。
可以理解的是，本领域技术人员明白，若某一组合物或方法一起或单独满足这些确定杂交的标准中的任一标准，则该组合物或方法即为本文所公开。
d)所产生的分子的组合物
可以理解的是，本文所公开产油微生物能产生多种化合物和组合物。这些化合物和组合物可用作识别标志，即一种鉴定产油微生物的方法。例如，表征某一产油微生物的一种方法是通过该产油微生物产生的脂质分配比例。如本文所公开的，因种种理由，这些不同的脂质分配比例既可用于进行纯化、操作和收集，又可用以表征该产油微生物。
(1)脂质
可以理解的是，如本文所公开的那样，每种产油微生物可产生某些不饱和脂肪酸的分配比例。这些分配比例为该产油微生物的特征。下面为该产油微生物的不饱和脂质分配比例和其他脂质分配比例的一些实例。
例如，产油微生物可产生占干细胞生物量至少约4wt％至6wt％(如约5wt％)的脂质或脂肪酸级分，所述脂质或脂肪酸级分包括约0wt％至约2wt％的豆蔻酸(如约1wt％)、约16wt％至约20wt％(如约18wt％)的棕榈酸、约0wt％至约2wt％(如约1wt％)的棕榈油酸、约4wt％至约8wt％(如约6wt％)的硬脂酸、约30wt％至约34wt％(如约32wt％)的油酸、约40wt％至约44wt％(如约42wt％)的亚油酸和约0wt％至约3wt％(如约2wt％)的n-3EPA。
例如，产油微生物还可产生占干细胞生物量至少约1wt％至3wt％(如约1.25wt％)的脂质或脂肪酸级分，所述脂质或脂肪酸级分包括约2wt％至约4wt％(如约3wt％)的豆蔻酸、50wt％至约60wt％(如约55wt％)的棕榈酸、约2wt％至约4wt％(如约3wt％)的棕榈油酸、约16wt％至约20wt％(如约18wt％)的硬脂酸、约9wt％至约13wt％(如约11wt％)的油酸、约1wt％至约3wt％(如约2wt％)的二十碳二烯酸和约6wt％至约10wt％(如约8wt％)的n-3EPA。
真核微生物例如ONC-T18可产生占干细胞生物量至少约30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70％wt％或80wt％(如约80wt％)的脂质组合物。例如，产油微生物可产生脂质组合物，所述脂质组合物包含约25％至约40％的ω-3脂肪酸如n-3DHA(例如以重量计至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％)、约0％至约3％的ω-3脂肪酸EPA(例如以重量计至少1％或2％)和约4％至约12％的ω-6脂肪酸例如n-6DPA(例如以重量计至少4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)。
可以理解的是，可以基于该产油微生物能够繁殖的生长条件，对由产油微生物产生的脂质的组合物进行处理。通过改变本文公开的各个参数可对组合物进行处理，以产生例如更高的DHA、EPA或DPA产率。例如，操作不会产生更多的实际克数，但是该操作可产生更好的DHA或DPA与EPA和其他所需PUFA的比率，从纯化的角度来看，该比率是所需的。本文还讨论了多种可用于增加DHA、EPA或DPA产率的条件。
可以理解的是，基于该产油微生物能够繁殖的生长培养基组合物，可以对由产油微生物产生的脂质的组合物进行操作。通过改变碳源与氮源的比率及类型两者、所使用盐的化学组成，以及通过添加某些影响脂肪酸产生的化合物，可产生与所选择的鱼油的分配比例类似的特异脂肪酸分配比例。例如，操作不会产生更多的实际克数，但是该操作可产生与例如鱼肝油(codliver oil)、鲔鱼油、鲣鱼油(bonito oil)或经典18∶12鱼油的TFA分配比例类似的TFA分配比例。
本文公开了这样的一类方法，即通过在产油微生物能够繁殖的生长培养基组合物中补充一种或多种脂肪酸生产拮抗剂，来改变由该产油微生物产生的脂肪酸比率。可以在改变或不改变该产油微生物的总脂肪酸含量的情况下改变该脂肪酸比率。例如，可以通过在产油微生物的培养基中补充脂肪酸生产拮抗剂来增大ω n-3和/或n-6油与ωn-9油的比率。
还公开了这样的一类方法，即通过在产油微生物能够繁殖的生长培养基组合物中补充一种或多种脂肪酸生产拮抗剂，在不改变该产油微生物的总脂肪酸含量的情况下，改变由该产油微生物产生的脂肪酸比率。
图1示出了由所公开真核微生物产生的各种PUFA的一个代谢途径的实例，这与脂肪酸甲酯代谢产物追踪结果一致。使用例如简并引物研究(Metz et al.(2001)Science 293：290-3和Kaulmann&Hertweck(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：1866-9)，可在本文所公开途径中鉴定的蛋白质为聚酮合酶。使用例如杂交探针以及/或者简并引物或靶引物，还可鉴定延伸酶和去饱和酶。使用例如杂交探针和/或简并引物，还可鉴定脂肪酸合酶。
5.生长和培养
进行了包括碳、氮(肽氮)、磷和硫、渗压剂和pH在内的表型微孔板(phenotypic microplate)研究。
正交阵列(Taguchi)法用于确定最佳培养基组成和氮、碳和盐浓度的变化(Joseph J&Piganatiells JR(1998)IIE Trans，20：247-254)。
在发酵ONC-18的时候，发现若增加搅拌或dO2，则会增加生物菌体产量和TFA，但减少DHA。若减少搅拌或dO2，则会减少细胞生物量(g)，并减少TFA，但增加DHA，而且也会减少C16:0、C16:1和C18:1。
若升高温度，则会增加生物菌体产量和TFA，但减少DHA。若降低温度，则会减少细胞生物菌体(g)，并减少TFA，但增加DHA，而且会减少C16:0、C16:1和C18:1。
来源于所公开产油微生物的细胞生物菌体可通过接种合适的天然或人工海水培养基(含约2％至约100％的海水)获得。该产油微生物能利用该培养基中的各种营养组分。在该培养基中所使用的碳源的实例为糖类例如葡萄糖、果糖、右旋糖(dextrose)、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)，以及糖衍生物如醋酸盐、m-肌醇(来源于玉米浆)、半乳糖醛酸(来源于果胶)、L-岩藻糖(来源于半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸盐(来源于葡萄糖)、纤维二糖(来源于纤维素)、糊精(来源于玉米)和α-环糊精(来源于淀粉)，和多元醇例如麦芽糖醇、赤藻糖醇、侧金盏糖醇，和油酸例如甘油和吐温80(tween 80)，和氨基糖例如N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。而氮源的实例为天然氮源如蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物和鱼粉，或者为有机氮源例如谷氨酸钠，但不限于此。另外，如若必要，磷酸盐例如磷酸钾和磷酸钠、无机盐例如硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰和氯化钙可仅与螯合化合物乙二胺四乙酸一起单独用作微量养分，或者与该螯合剂以及维生素例如盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12一起用作微量养分。在配制好培养基后，使用酸或碱将pH调节至3.0至10.0之间，合适地，调节至例如pH4.0至6.5之间，并且通过例如高压灭菌对培养基进行灭菌。在温度为4至30℃、优选18至28℃下，通过通气振荡培养、振荡培养、静止培养、分批培养、连续培养、滚动分批培养或波动培养等，将培养进行1至30天、1至21天、1至15天、1至12天、1至9天或优选3至5天。
以下的条件是可产生一系列脂质的条件的实例，所述脂质的产量使得它们可用作商品。对ONC-T18的培养条件的研究表明，本文所公开的产油微生物在天然或人工海水或者在含有浓度最低至5％的天然或人工海水的培养基中生长良好。加入该培养基中的碳源和氮源可为上文所述的通常使用的那些碳源和氮源。天然氮源或有机氮源相对而言是等效的，并且该培养基中的总氮浓度保持恒定。将这些碳源或氮源以标准浓度加入培养基中。如本文所公开的那样，若满足这些条件，则对脂质含量、累积的DHA、DPA和EPA的比例或量几乎没有影响。
对于ONC-T18的高浓度发酵而言，能够使用几种方法来增加细胞生物量和脂质产率。这些方法包括分别将培养基中碳和氮两者的浓度(两者的比率为6∶1至15∶1之间，优选6∶1至13∶1之间；温度为4至30℃之间，优选18至28℃之间)从5g L-1至60g L-1升高至100g L-1至160g L-1，和从4g L-1至10g L-1升高至40g L-1至60g L-1。使用这种方法，所产生的生物量和脂质的比例也以相当的比例增加。另外，通过将碳源从5g L-1至60g L-1升高至100g L-1至160g L-1而氮源保持不变，可以增加脂质产量。另外，通过将氮源的量从10gL-1升高至60g L-1而碳源保持不变，可以增加生物菌体产量，同时维持脂质含量。此外，实验表明生物量和脂质产量随搅拌的加快(范围在100至1000rpm之间，更好地在350至600rpm之间，并且最佳地在350至450rpm之间)而大大提高，并且脂质含量仅有最低限度的降低，脂肪酸分配比例没有减少，并且搅拌在异养发酵早期特别有用。实验还表明，在这些微生物的经典补料分批发酵的脂质积聚阶段，培养基中的溶解氧含量介于1至10％之间、最好是在5％时，可得到最适宜的脂质产量(见图8)。最后，将乙酸盐、微量元素、金属和维生素加至所述生产培养基(如上所述)中可增加DHA、EPA和DPA相对于其他脂肪酸的产量，而不降低总脂质值。
通过进行上述异养发酵，能持续产生细胞生物量，所述细胞生物量可产生含(n-3)系列DHA的脂质，所述DHA在培养基的浓度较高，不低于5g/升培养基、更优选不低于20g/升培养基(见图8)。另外，实验表明，在达到最大生物量水平之后，这些脂质中有大部分在培养的对数晚期/过渡期期间累积。然而，在发酵过程中，脂质含量通常不会低于总生物量的25％，通常最大为约80％。可使用常规搅拌发酵罐进行上述条件下的培养。还可使用泡罩塔发酵罐(成批培养或连续培养)或波动发酵罐。
可使用各种常规方法例如离心(如离心式固液分离机(solid-ejecting centrifuge))或过滤(例如交叉流过滤)来在进行脂质分离之前收集细胞生物量，并且所述方法还可能会包括使用用于加速细胞生物量收集的沉淀剂(例如磷酸钠、氯化钙或聚丙烯酰胺(polyacridamide))。
a)脂肪酸生产拮抗剂
用于培养所公开的产油微生物的培养基还可包含脂肪酸产生的拮抗剂。脂肪酸生产拮抗剂可以是脂肪酸亚单元或脂肪酸通路调节剂。例如，脂肪酸生产拮抗剂包括，但不限于油酸、浅蓝菌素、甲基苯甲酸、姜黄素、环丙烯、没食子酸烷基酯、没食子酸丙酯、芝麻油、花生油、菜籽油、哒嗪酮、氟草敏(norxlurazon)、二苯胺、稀禾定(sethoxydim)和辣椒素(capsaicin)。
本文使用的术语“脂肪酸亚单元”或“脂肪酸亚单元类”是指这样的16、18、20、22或24碳脂肪酸，即它们参与所公开的产油微生物的用于产生PUFA的代谢途径。例如，“脂肪酸亚单元”可包括图1中所示的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸。
“脂肪酸亚单元”用于本文中还可指这样的具有1、2、3、4、5或6个不饱和度的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸，即它们参与所公开的产油微生物的用于产生PUFA的代谢途径。另外的实施方案可包括奇数碳的具有或不具有不饱和度的脂肪酸，例如海洋生物中发现的15、17、19和21碳脂肪酸。
脂肪酸途经调节剂可以是这样的化合物，即它们能够抑制参与所公开的产油微生物的用于产生PUFA的代谢途径的一种或多种酶。除非另外指出，参与所公开的产油微生物的用于产生PUFA的代谢途径的一种或多种酶的抑制可以是抑制至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
脂肪酸途经调节剂可以是这样的化合物，即它们能够抑制参与所公开的产油微生物的用于产生PUFA的代谢途径的一种或多种去饱和酶或延长酶。脂肪酸途经调节剂还可以是能够抑制所公开的产油微生物的八氢番茄红素去饱和酶(phytone desaturase)、β-胡萝卜素C4-加氧酶、脂肪酸合酶或乙酰辅酶A羧化酶的化合物。
6.脂质的分离
图2示出所公开的产油微生物的一般脂肪酸分配比例。图5-7示出摇瓶中生物量(g/L)、脂质(TFA)和DHA含量(均mg/g生物量)为以下发酵条件的函数，即单独的或者存在L-谷氨酸或酵母提取物(YE)情况下的各种氮源、碳源(单独地)或补充(即除了本文全文中提及的氮源和碳源之外)各种抗氧剂、植物激素或简单碳源的培养物。所有这些数据均可用于提取所公开的产油微生物的特异特征。
含有(n-3)系列DHA、DPA和EPA以及(n-6)系列DPA的脂肪可通过如下步骤获得：例如通过碾磨、超声处理来破坏或破裂收集到的细胞生物菌体，然后使用溶剂例如氯仿、己烷、甲醇、乙醇或通过超临界流体抽提方式进行提取。所得到的含(n-3)系列DHA和(n-6)系列DPA的脂肪的含量为在每克干细胞生物量优选高于0.25g，更优选高于0.6g。
所公开的产油微生物(包括产油微生物ONC-T18)能产生如上述获得的脂质，该真核微生物的任意变种以及其同种成员之间的任意结合可以产生具有如下分配比例的脂质。中性脂质的百分比以重量计为总脂质的至少95％。例如，ONC-T18产生的中性脂质中脂肪酸的典型组成如下：15％的豆蔻酸、8％的十五酸、35％的棕榈酸、7％的棕榈油酸、1％的硬脂酸、2％的油酸、1％的二十碳五烯酸、6％的二十二碳五烯酸和25％的二十二碳六烯酸。在培养基中补充一种或多种脂肪酸生产拮抗剂时，可增大ωn-3和ωn-6油例(如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸(n-3和n-6两者))与ωn-9油(例如硬脂酸)的总比率。例如，图11示出与培养基中没有添加脂肪酸生产拮抗剂的对照相比，ωn-3和ωn-6油的比率的可能变化。其他实施例可以参见图12-15。
所公开的产油微生物(例如ONC-T18)能产生如上述获得的脂质，该真核微生物的任意变种以及其同种成员之间的任意结合可以产生具有如下分配比例的脂质。ONC-T18的中性脂质级分中甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的百分比分别为0％至约2％、0至约2％和96至约100％。而占脂质级分5％至约10％的极性脂质级分包括与中性脂质结合和未与之结合的磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸(phosphotidic acid)。
可以理解的是，这些脂质可以任何组合或排列存在于这些生物体内。还可以理解的是，这些脂质的浓度可通过改变如上所述的生长条件以及培养基条件和组成来操控。
(1)脂质浓度
所公开的产油微生物可产生含大于等于约4.0g L-1培养基的n-3DHA、EPA和n-6 DPA的脂质级分。所公开的产油微生物可产生含大于等于约20.0g L-1培养基的n-3 DHA、EPA和n-6 DPA的脂质组合物。所公开的产油微生物可产生含大于等于约14.0g L-1培养基的n-3 DHA、EPA和n-6 DPA的脂质组合物。所公开的产油微生物可产生约1.5g L-1至约5.0g L-1(如约4.6g L-1)的n-3 DHA、约0.5g L-1至约1.5gL-1(如约0.22g L-1)的n-3 EPA和约0.5g L-1至约1.5g L-1的n-6DPA。另外，所公开的产油微生物可产生含有介于301.2至360.3mg/g细胞生物量甚至最高达790mgg细胞生物量的如下物质的脂质级分：豆蔻酸、肉豆蔻稀酸、十五酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。所公开的产油微生物还可产生含有如下物质的级分：44.3至57mg g-1的豆蔻酸(等于1134.5至1458.1mg L-1)、0.5至0.65mg g-1的肉豆蔻稀酸(等于13.3至16.63mg L-1)、33.5至34.6mg g-1的十五酸(等于856.9至885.1mg L-1)、121.9至165.1mg g-1的棕榈酸(等于3118.2至4223.3mg L-1)、7.9至28.5mg g-1的棕榈油酸(等于202.1至729mg L-1)、4.38至5.9mg g-1的硬脂酸(等于112至151mg L-1)、6.94至9.9mg g-1的油酸(等于177.5至253.2mg L-1)、0.4至1.3mg g-1的亚油酸(等于11.26至33.3mgL-1)、0.5至1.0mg g-1的二十碳二烯酸(等于12.8至25.6mg L-1)、0.4至0.5mg g-1的花生四烯酸(等于10.2至13mg L-1)、75至100mgg-1的二十二碳六烯酸(等于1918至2560mg L-1)、1.9至6mg g-1的二十碳五烯酸(等于48.6至153.5mg L-1)和17.1至33.7mg g-1的二十二碳五烯酸(等于437.4至862.1mg L-1)，细胞生物量内总脂肪酸含量介于301至790mg g-1之间(等于7700至20,209mg L-1)。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂稀禾定的存在可改变脂肪酸组成，例如11.27％至10.97％豆蔻酸、0.23％至0.03％肉豆蔻稀酸、3.92％至5.5％十五酸、0.43％至0.53％顺十五碳烯酸(pentadecenoic acid)、45.57％至40.52％棕榈酸、11.63％至9.18％棕榈油酸、1.16％至1.49％十七烷酸、1.84％至1.45％硬脂酸、0.00％至0.18％油酸、2.89％至2.48％异油酸、0.36％至0.2％花生酸、0.12％至0.00％二十碳烯酸、0.38％至0.14％二十碳二烯酸、0.14％至0.10％高-γ-亚麻酸、0.13％至0.20％花生四烯酸、余量0.00％二十碳三烯酸、0.26％至0.37％二十碳四烯酸、0.38％至0.78％二十碳五烯酸、余量0.00％山酸、1.12％至1.09％二十一碳五烯酸、0.20％至0.00％二十二碳二烯酸、0.16％至0.00％肾上腺酸、3.88％至5.26％二十二碳五烯酸n-6、0.35％至0.24％二十二碳五烯酸n-3、余量0.00％木蜡酸、13.54％至19.31％二十二碳六烯酸、余量0.00％神经酸以及0.27％至0.20％二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂浅蓝菌素的存在可改变脂肪酸组成，例如11.10％至11.03％豆蔻酸、余量0.00％肉豆蔻稀酸、3.84％至3.23％十五酸、0.11％至0.10％顺十五碳烯酸、50.52％至48.98％棕榈酸、1.93％至2.22％棕榈油酸、0.85％至0.74％十七烷酸、1.55％至1.86％硬脂酸、0.13％至0.29％油酸、0.93％至1.24％异油酸、0.38％至0.41％花生酸、0.00％至0.19％二十碳烯酸、余量0.17％二十碳二烯酸、0.15％至0.20％高-γ-亚麻酸、0.16％至0.30％花生四烯酸、余量0.00％二十碳三烯酸、0.34％至0.36％二十碳四烯酸、0.72％至1.17％二十碳五烯酸、0.10％至0.11％山酸、1.27％至1.24％二十一碳五烯酸、0.13％至0.14％二十二碳二烯酸、余量0.00％肾上腺酸、5.47％至5.83％二十二碳五烯酸n-6、0.16％至0.23％二十二碳五烯酸n-3、余量0.00％木蜡酸、19.98％至19.97％二十二碳六烯酸、余量0.00％神经酸以及0.16％至0.23％二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂油酸的存在可改变脂肪酸组成，例如24.46％至1.38％豆蔻酸、0.03％至0.00％肉豆蔻稀酸、2.43％至0.49％十五酸、余量0.00％顺十五碳烯酸、42.82％至16.67％棕榈酸、0.46％至1.06％棕榈油酸、0.31％至0.28％十七烷酸、1.26％至1.56％硬脂酸、0.15％至25.36％油酸、0.26％至2.68％异油酸、0.36％至0.00％花生酸、余量0.00％二十碳烯酸、0.06％至0.51％二十碳二烯酸、0.13％至0.61％高-γ-亚麻酸、0.22％至0.72％花生四烯酸、余量0.00％二十碳三烯酸、0.27％至0.00％二十碳四烯酸、0.62％至5.47％二十碳五烯酸、0.10％至0.00％山酸、1.01％至0.20％二十一碳五烯酸、0.14％至0.68％二十二碳二烯酸、0.14％至0.60％肾上腺酸、5.85％至7.58％二十二碳五烯酸n-6、0.14％至0.39％二十二碳五烯酸n-3、余量0.00％木蜡酸、18.77％至33.16％二十二碳六烯酸、余量0.00％神经酸以及余量0.00％二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂油酸与葡萄糖酶(glucoase)的存在可改变脂肪酸组成，例如24.46％至8.04％豆蔻酸、0.03％至0.00％肉豆蔻稀酸、2.43％至0.73％十五酸、余量0.00％顺十五碳烯酸、42.82％至33.18％棕榈酸、0.46％至4.22％棕榈油酸、0.31％至0.17％十七烷酸、1.26％至1.60％硬脂酸、0.15％至9.49％油酸、0.26％至4.45％异油酸、0.36％至0.34％花生酸、0.00％至0.30％二十碳烯酸、0.06％至0.36％二十碳二烯酸、0.13％至0.30％高-γ-亚麻酸、0.22％至0.46％花生四烯酸、余量0.00％二十碳三烯酸、0.27％至0.24％二十碳四烯酸、0.62％至2.60％二十碳五烯酸、0.10％至0.00％山酸、1.01％至0.79％二十一碳五烯酸、0.14％至0.43％二十二碳二烯酸、0.14％至0.28％肾上腺酸、5.85％至6.46％二十二碳五烯酸n-6、0.14％至0.39％二十二碳五烯酸n-3、余量0.00％木蜡酸、18.77％至24.65％二十二碳六烯酸、余量0.00％神经酸以及0.00％二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂辣椒素的存在可改变脂肪酸组成，例如9.7％至21.86％豆蔻酸、0.00％至0.28％肉豆蔻稀酸、9.83％至0.91％十五酸、0.11％至0.23％顺十五碳烯酸、43.48％至24.19％棕榈酸、1.52％至17.98％棕榈油酸、2.29％至0.19％十七烷酸、1.59％至1.60％硬脂酸、0.10％至0.00％油酸、1.27％至6.67％异油酸、0.26％至0.20％花生酸、余量0.00％二十碳烯酸、0.03％至0.23％二十碳二烯酸、0.25％至0.22％高-γ-亚麻酸、0.17％至0.78％花生四烯酸、余量0.00％二十碳三烯酸、0.30％至0.27％二十碳四烯酸、0.48％至1.38％二十碳五烯酸、0.08％至0.00％山酸、0.00％至0.00％二十一碳五烯酸、0.13％至0.17％二十二碳二烯酸、0.07％至0.46％肾上腺酸、6.53％至5.19％二十二碳五烯酸n-6、0.22％至0.31％二十二碳五烯酸n-3、余量0.00％木蜡酸、21.48％至16.86％二十二碳六烯酸、余量0.00％神经酸以及余量0.00％二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂甲基苯甲酸的存在可改变脂肪酸组成，例如8.95％至11.19％豆蔻酸、余量0.00％肉豆蔻稀酸、9.79％至14.93％十五酸、0.13％至0.27％顺十五碳烯酸、32.80％至26.90％棕榈酸、1.94％至2.36％棕榈油酸、1.89％至2.69％十七烷酸、1.28％至1.59％硬脂酸、0.10％至0.11％油酸、1.64％至3.68％异油酸、0.22％至0.23％花生酸、0.01％至0.14％二十碳烯酸、0.20％至0.79％二十碳二烯酸、0.12％至0.17％高-γ-亚麻酸、0.38％至0.90％花生四烯酸、0.08％至0.03％二十碳三烯酸、0.38％至0.36％二十碳四烯酸、1.16％至2.95％二十碳五烯酸、余量0.00％山酸、0.43％至0.39％二十一碳五烯酸、0.09％至0.06％二十二碳二烯酸、0.19％至0.46％肾上腺酸、9.43％至5.95％二十二碳五烯酸n-6、0.27％至0.54％二十二碳五烯酸n-3、0.07％至0.03％木蜡酸、28.48％至23.03％二十二碳六烯酸、0.03％至0.18％神经酸以及余量0.00％二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质：脂肪酸生产拮抗剂氟草敏的存在可改变脂肪酸组成，例如12.36％至11.08％豆蔻酸、余量0.12％肉豆蔻稀酸、2.71％至3.16％十五酸、0.35％至0.33％顺十五碳烯酸、43.24％至40.61％棕榈酸、15.54％至10.65％棕榈油酸、0.80％至1.03％十七烷酸、1.61％至1.52％硬脂酸、0.04％至0.00％油酸、3.22％至3.53％异油酸、0.23％至0.16％花生酸、0.00％至0.02％二十碳烯酸、0.15％至0.13％二十碳二烯酸、0.11％至0.18％高-γ-亚麻酸、0.14％至0.19％花生四烯酸、余量0.00％二十碳三烯酸、0.13％至0.24％二十碳四烯酸、0.52％至0.76％二十碳五烯酸、0.07％至0.05％山酸、余量0.00％二十一碳五烯酸、0.11％至0.03％二十二碳二烯酸、0.23％至0.17％肾上腺酸、3.98％至5.23％二十二碳五烯酸n-6、0.13％至0.19％二十二碳五烯酸n-3、0.09％至0.00％木蜡酸、14.13％至20.61％二十二碳六烯酸、余量0.00％神经酸以及余量0.00％二十六烷酸。
(2)其他分子
所公开的产油微生物可进一步产生类胡萝卜素和叶黄素。这类类胡萝卜素和叶黄素的实例包括β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素、芬尼黄质、玉米黄素、海胆酮、β-隐黄素、辣椒红、黄体素(lutin)、胭脂树橙、β-脱辅基-8-胡萝卜素醛和β-脱辅基-8-胡萝卜素醛-酯。
由所公开的产油微生物产生的叶黄素可与同样由所述所公开的产油微生物产生的各种PUFA相缀合。
(a)抗氧化剂
通常，抗氧化剂为与氧反应并通常被氧所消耗的化合物。由于抗氧化剂通常与氧反应，所以抗氧化剂还通常与自由基生成物和自由基反应(“The Antioxidants-The Nutrients that Guard Your Body”byRichard A.Passwater，Ph.D.，1985，Keats Publishing Inc.，至少就其与抗氧化剂相关的内容通过援引纳入本文)。所述组合物可包含任何抗氧化剂，非限制性实例可包括但不限于：可直接清除自由基的非类黄酮抗氧化剂和营养物，包括综合胡萝卜素(multi-carotene)、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、黄体素和玉米黄素、硒、维生素E(包括α-、β-和γ-生育酚，特别是α-生育酚等)、维生素E的琥珀酸酯和trolox(一种可溶的维生素E类似物)维生素C(抗坏血酸)和Niacin(维生素B3、烟酸和烟酰胺)、维生素A、13-顺式视黄酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸钠、吡咯烷-二硫代-氨基甲酸酯和辅酶Q10；催化破坏自由基的酶类，包括过氧化物酶例如作用于H2O2和例如有机过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)，包括作用于H2O2的过氧化氢酶(CAT)、岐化O2H2O2的超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽转移酶(GSHTx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)以及它们的模拟物、类似物和聚合物(抗氧化酶例如SOD的类似物和聚合物描述于例如美国专利系列号No.5,171,680，至少就其与抗氧化剂和抗氧化酶相关的内容通过援引将其纳入本文)；谷胱甘肽；血浆铜蓝蛋白；半胱氨酸和半胱胺(β-巯基乙胺)，以及类黄酮和类黄酮样分子例如叶酸和叶酸盐。抗氧化酶及其模拟物和抗氧化营养物的综述可参见Kumar et al，Pharmac.Ther.39：301，1988和Machlin L.J.and Bendich，FASEBJournal 1：441-445，1987，就其与抗氧化剂相关的内容通过援引将这两篇文献纳入本文。
类黄酮也称为“苯并色酮”，为天然存在的、具有抗氧化性的水溶性化合物。类黄酮广泛分布于维管植物中，并存在于大量蔬菜、水果和饮料如茶和酒(特别是红酒)中。类黄酮为共轭的芳香族化合物。存在最为广泛的类黄酮是黄酮和黄酮醇(例如杨梅黄酮(3，5，7，3’，4’，5’，-六羟黄酮)、栎皮黄酮(3，5，7，3’，4’-五羟黄酮)、山奈黄素(3，5，7，4’-四羟黄酮)、黄酮芹菜苷配基(5，7，4’-三羟黄酮)、毛地黄黄酮(5，7，3’，4’-四羟黄酮)及其糖苷和栎皮黄酮)。
类胡萝卜素是由多种微生物和植物所产生的重要天然色素，通常为红色、橙色或黄色。在过去类胡萝卜素已被用于饲料、食品和营养制品产业。已知它们是植物生长和光合作用所必需的，并且为人体内维生素A的主要膳食来源。膳食性抗氧化剂例如类胡萝卜素(β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素、玉米黄素、辣椒红、黄体素、胭脂树橙、β-脱辅基-8-胡萝卜素醛和β-脱辅基-8-胡萝卜素醛-酯)展现出显著的抗癌活性，并且在慢性疾病的预防中起着重要作用。类胡萝卜素为有效的生物学抗氧化剂，所述类胡萝卜素可将单线态氧上的激发能吸收到类胡萝卜素链上，从而导致类胡萝卜素分子的降解，但是可防止其他分子或组织被损害。
氧是代谢功能所必需的，但是它也会攻击细胞。人体具有多种从其细胞中除去氧产生的分子的代谢酶和抗氧化剂。氧化应激被认为是诸多病症的影响因素，所述病症例如类风湿性关节炎、缺血性心脏病和中风、阿尔茨海默痴呆、癌症和衰老。因此，抗氧化剂具有预防多种疾病的潜能。已从海洋微生物来源中分离了几种抗氧化剂化合物；这些抗氧化剂化合物包括虾青素、β-胡萝卜素和其他类胡萝卜素。
类胡萝卜素是一组分布广泛的天然存在的色素，有700种以上的主要由微藻、大藻、细菌和真菌种产生的天然脂溶性色素，并且虾青素及其衍生物在商业上受到特别关注。虾青素是极其有效的抗氧化保护剂。然而，与β-胡萝卜素不同，虾青素容易穿过血脑屏障/血视网膜屏障，因此还具有预防脑病和眼病的潜能。临床前研究证明了服用虾青素的各种有益效果，例如：(i)抑制膀胱、结肠、肝脏、乳腺和口腔中的癌形成和生长；(ii)使眼睛的视网膜免受氧化损伤，因此具有抵抗老年黄斑疾病的作用；(iii)促进免疫活性提高；(iv)提供免于紫外线损伤的保护；以及(v)提供更好的肌耐力。
b)微生物的分离
公开了通过以下方法所获得的来自破囊壶菌科的微生物，所述方法包括：在盐水(天然海水或人工盐水)中用花粉粒诱集营养体(vegetative)样品并进行培养；分离花粉粒并将其转移至异养培养基中并进行培养；鉴定产生脂肪酸的分离株，从鉴定得到的分离株分离来自破囊壶菌科的微生物。其他形式的分离包括添加了合适抗生素的培养基以及通过如上所述的显微方法或通过使用18S rRNA基因引物或探针进行的鉴定。异养培养基可如下文所述。
5.由真核微生物产生的脂质和其他分子    
公开了脂质组合物，所述脂质组合物包含约25wt％至约40wt％的n-3 DHA，约6wt％至约10wt％的n-6 DPA和约0wt％至约10wt％的n-3 EPA。
脂质组合物可进一步包含约11wt％至约15wt％(如约13wt％)的豆蔻酸、约7wt％至约11wt％(如约9wt％)的十五酸、约37wt％至约41wt％(如约39wt％)的棕榈酸、约3wt％至约7wt％(如约5wt％)的棕榈油酸、约0至约3wt％(如约1wt％)的硬脂酸或约1wt％至约4wt％(如约2wt％)的油酸。
脂质组合物可含有浓度大于约400mg生物量的n-3 DHA，浓度大于100mg生物量的n-6 DPA。
脂质组合物还可含有类胡萝卜素。这类类胡萝卜素的实例包括β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、玉米黄素、角黄素、海胆酮、芬尼黄质、辣椒红、黄体素、胭脂树橙、β-脱辅基-8-胡萝卜素醛和β-脱辅基-8-胡萝卜素醛-酯。
在一方面，该组合物可含有至少约24wt％的n-3 DHA、约1wt％的n-3 DPA、约6wt％的n-6 DPA和约1wt％的n-3 EPA。
7.含有由真核微生物产生的分子的组合物
人和动物(包括海生动物)用的食物、补充剂、药物组合物可包含该组合物(脂质、含抗氧化剂的脂质和抗氧化剂自身)。
还公开了包含该组合物(脂质、含抗氧化剂的脂质和抗氧化剂自身)的婴儿配方。
C.方法
1.脂质制备方法
公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：培养包括来自破囊壶菌科的一种或多种微生物在内的产油微生物，并分离所述脂质组合物。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，还包括分离所述脂质组合物。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，其中所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率增大。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，其中如图11中所示，所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率与对照相比有变化。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，其中所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率增大，其中所述总脂肪酸含量没有变化。
还公开了这样的方法，通过该方法可改良所述生物的脂肪酸分配比例以增大例如EPA浓度，该方法的实现是通过将直接作用于ONC-18的代谢途径的营养补充剂、化学刺激物或抑制剂补充至发酵培养基或这种用于发酵并产生ω-3和ω-6脂肪酸的化学组合物中。这些酶可具体被描述为具有延长酶、去饱和酶或脂肪酸合酶活性。据本发明人所知，以下情况首次被发现，即明确鉴定——当其与发酵培养基结合时(在整个发酵过程中或在特定的时间点)——可改变脂肪酸分配比例的化合物。这种化合物的实例包括存在于该具体微生物的脂质生物合成途径中的脂肪酸中间体，例如油酸(见图14)，当将这种脂肪酸中间体添加至发酵培养基中时会导致细胞中EPA含量的提高。
与Metz等人(2001)的其中记录了油酸整合进入裂殖壶菌属种的实验数据相反，没有发现发生该产物向多不饱和脂肪酸的转化。在该例中，通过使用13C标记的油酸，发现了来源自所述富集油酸的13C存在于继后的多不饱和脂肪酸中并且构成了其余的EPA浓度升高。这证明了，将中间体脂肪酸整合至培养基中不仅可成功地整合进入细胞内，而且可成功地整合进入活性去饱和酶、延长酶和脂肪酸合酶脂质合成系统。
可采用多种方法来回收在多种培养基中发酵得到的细胞生物菌体，例如通过过滤或离心。然后细胞经洗涤、冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥，并在无氧环境下储存以消除氧的存在，然后将其掺入经加工的食品或饲料产品中。
含有(n-3)DHA、EPA和(n-6)DPA等PUFA的细胞脂质还可通过诸如超临界流体抽提等方法，或通过采用溶剂例如氯仿、己烷、二氯甲烷或甲醇的抽提法从所述细胞生物菌体中提取，并且将所得到的提取物在负压条件下蒸发，以产生经浓缩的脂质物质样品。所述ω-3和ω-6PUFA可通过如下步骤进一步浓缩：水解所述脂质，并通过采用常规方法例如尿素包合法(urea adduction)或分馏、柱色谱法或通过超临界流体分级分离法浓缩高度不饱和级分。还可破裂或裂解细胞并将脂质抽提至植物油或动物油(如鱼油)中。抽提得到的油可通过通常用于提炼植物油的公知方法(例如通过化学提炼或物理提炼)来提炼。在抽提得到的油作为食用油使用或出售前，这些提炼方法可将杂质从其中除去。提炼之后，该油可直接用作饲料或食品添加剂以产生富含ω-3和/或ω-6的产品。或者，该油可按如下所述进一步加工和纯化，然后用于以上应用，并且还可用于制药。
在产生经富集的(浓缩的)ω-3或ω-6油的另一种方法中，所收集得到的细胞生物菌体(新鲜的或经干燥的)可通过公知技术例如超声波处理、液体切力破裂方法、玻珠研磨、高压挤压、冻融或细胞壁的酶消化来破裂或渗裂。破裂细胞中的脂质可使用某种溶剂(例如己烷、氯仿、乙醚或甲醇)或溶剂的混合物来萃取。除去溶剂，并通过使用任何公知的将甘油三酯转化为游离脂肪酸或脂肪酸的酯的方法(包括碱性水解、酸性水解或酶法水解)来水解脂质。水解完成之后，将不能皂化的化合物萃取至溶剂例如乙醚、己烷或氯仿中并除去。然后通过加入酸将剩下的溶液酸化，并将游离脂肪酸萃取至溶剂例如己烷、乙醚或氯仿中。然后将含有该游离脂肪酸的溶剂溶液冷却至低到足以使非PUFA化合物结晶的温度，随后所述非PUFA化合物可通过过滤、离心或沉淀来除去。结果是剩下的PUFA化合物得到了浓缩并被用作人的营养补充剂、用作食品添加剂或用于药物应用。
同时，公开了通过上文公开方法制备的脂质组合物。
来自破囊壶菌科的微生物可为上文所公开的任何微生物。
a)培养基
异养培养基可包含(人工的或天然的)海盐、一种或多种碳源和一种或多种氮源。该海盐存在的量可为约2.0至约40.0g L-1。标准培养条件(并非针对高浓度发酵，而是针对低成本发酵)下所使用的碳源和氮源的浓度范围分别是5g L-1至60g L-1和4g L-1至10g L-1。对于高浓度发酵而言，标准培养条件下所使用的碳源和氮源的浓度范围分别是分别是100g L-1至160g L-1和40g L-1至60g L-1。油脂积累的趋势是：产油微生物在(如上所述的那些)培养基中生长，其中在约24至约48小时之后氮的供应受到了限制，而碳的供应依然很富裕。该产油微生物继续吸收碳(单糖形式)，但是由于缺乏用于形成相关蛋白质和核酸的氮而不再进行细胞分裂。结果是这些糖被转化成储备油脂，这与Ratledge C.(Lipid Tech.16：34-39，2004)所描述的方式非常相似，图1给出这些生物体所特有的这一现象。
氮源可为蛋白胨、酵母提取物、麦精和谷氨酸钠中的一种或多种。氮源还可为玉米浆或棉籽提取物。氮源可含有酵母提取物和/或蛋白胨或谷氨酸单钠。例如，氮源可包括但不限于EMDTM YE-MSG、EMDTM YE、EMDTM Peptone-MSG、SigmaTM YE-MSG、SigmaTM YE、FermtechTM YE-MSG、FermtechTM YE或鱼粉(Fish meal)(62％蛋白质)。酵母提取物所存在的量可为约2g L-1。谷氨酸单钠存在的量可为约8g L-1。
碳源可为如下物质中的一种或多种：D-海藻糖、甘油、D-葡糖酸、L-乳酸、D，L-苹果酸、D-核糖、吐温20、D-果糖、乙酸酯、乙酸、α-D-葡萄糖、麦芽糖、胸苷、L-天冬酰胺、D-木糖、吐温40、α-酮基-戊二酸、蔗糖、L-谷氨酰胺、吐温80、β-甲基-D-葡糖苷、麦芽三糖、腺苷、延胡索酸、溴代琥珀酸、L-丝氨酸、D-纤维二糖、L-丙氨酰基-甘氨酸、丙酮酸甲酯、L-苹果酸、甘氨酰基-L-脯氨酸、D-palcose、L-来苏糖、丙酮酸、α-D-乳糖、糊精、D-阿拉伯糖、2-脱氧-D-核糖、明胶、右旋糖、淀粉、3-0-β-D-吡喃半乳糖基-D-阿拉伯糖、D-塔格糖、5-酮基-D-葡糖酸、草酰苹果酸(oxalomalic acid)、山梨酸、L-鸟氨酸和二羟基乙酸酯。在一方面，碳源可为D，L-苹果酸、D-果糖、D-木糖、延胡索酸、D-纤维二糖、5-酮基-D-葡糖酸、丙酮酸、α-D-乳糖、玉米糊精、明胶、玉米淀粉或小麦淀粉。碳源存在的量可为约1g L-1至60g L-1并且上限至约200g L-1。
在一个实例中，培养基含有约5g D-葡萄糖、约2g蛋白胨和约2g酵母提取物/升盐水(天然的或人工的)。在另一实例中，所述培养基含有约60g D-葡萄糖、约10g酵母提取物/升盐水(天然的或人工的)。在另一实例中，培养基可含有约8g酵母提取物、32g MSG、24g海盐(天然的和人工的)和300g D-葡萄糖/升。
所述培养基可进一步含有磷酸盐(如磷酸钾和磷酸钠)。所述培养基可进一步含有无机盐(如硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化镁)。所述培养基可进一步含有螯合化合物(如EDTA)。所述培养基可进一步含有维生素(例如盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12)。培养基的pH为约4.0至约6.5。
培养可进行约1至约9天(如约3天至约5天)。培养可在约18至约30℃(如约18-25℃)下进行。图8示出，当将ONC-T18按分批补料方案在发酵罐中于18和25℃下培养88小时的时候，生物菌体生产、细胞的TFA和DHA含量以及葡萄糖摄取速率的差异。在该实例中，葡萄糖(或碳代谢)与TFA产生量的比例从8.1变化至3.0。这意味着，在18℃下产生1g TFA需要8.1g葡萄糖，而在25℃下仅需要3.0g葡萄糖。培养可进一步包括振荡或通气。
分离脂质的过程可包括将该微生物与萃取溶剂相接触。该溶剂可包括选自氯仿、己烷、甲醇或乙醇或者超临界CO2的一种或多种溶剂。
该方法可产生本文所公开的任何组合物。
在大于等于约20g L-1培养基中，该产油微生物可产生含n-3 DHA的脂质组合物。在大于等于40g L-1培养基中，该产油微生物可产生含n-3 DHA的脂质组合物。在大于等于80g L-1培养基中，该产油微生物可产生含n-3 DHA的脂质组合物。
2.筛选和鉴定方法
本文所公开的产油微生物可产生含(n-3)系列二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸以及(n-6)系列DPA的脂质。这些产油微生物可使用例如以下的筛选方法筛选。可(已经)将营养体样品置于装有10mL无菌(0.2μm过滤)天然海水(含有浓度分别为300和500mg L-1的青霉素和链霉素)的20mL小瓶中。然后用无菌花粉粒诱集小瓶，并在18至25℃下培养48小时。然后将花粉粒转移至含抗生素(如上所述)的琼脂板上，并在相同条件下培养。挑选由球形或蛞蝓形细胞构成的单个无规则透明集落和非典型的酵母或细菌集落，并在与上文相同的培养基上和相同的条件下传代培养。然后使用营养液体培养基就生长情况和脂肪酸产生情况对这些分离株进行筛选，所述营养液体培养基由含5g L-1葡萄糖、2g L-1蛋白胨和2g L-1酵母提取物的经0.2μm过滤的天然海水制备，通过离心或沉淀收集液体培养基中所得的细胞生物菌体。可使用常规方法直接对脂肪酸进行酯交换，并且可通过气相色谱分析所述脂肪酸甲酯组合物，筛选产生恰当量n-3系列DHA和n-6系列DPA的菌株用于进一步研究中。
公开了鉴定产油微生物的方法，所述方法包括：用花粉粒诱集海水(天然海水或人工海水)中的营养体样品并进行培养；将该花粉粒转移至异养培养基中并进行培养；并鉴定产生脂肪酸的分离株。
还公开了由上面鉴定得到的产油微生物所产生的脂质组合物。
还公开了由使用所公开产油微生物的方法和本文公开的方法产生的脂质组合物。
还公开了美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection)编号为PTA-6245的产油微生物。
还公开了属于破囊壶菌目的产油微生物(ONC-T18)，它们具有例如SEQ ID NO：1所示的18S rRNA，并被鉴定为破囊壶菌属种。
还公开了属于破囊壶菌目的产油微生物(ONC-T18)，它们具有例如GenBank编号DQ374149的18S rRNA序列，并被鉴定为破囊壶菌属种。
还公开了能产生浓度分别高于400mg L-1和100mg L-1的DHA和DPA的产油微生物——破囊壶菌属种。
还公开了能通过上述异养发酵产生范围在50至1250mg kg-1的类胡萝卜素以及能产生范围分别在1至20mg kg-1的虾青素、0.25至10mg kg-1的玉米黄素、1至20mg kg-1的角质素、1至20mg kg-1的海胆酮和1至200mg kg-1的β-胡萝卜素的产油微生物——破囊壶菌属种。
还公开了用于培养产油微生物的方法，该方法包括：在某种条件下培养产油微生物，其中所述条件包括含有如下组成的培养基：人工海盐(营养性海水)形式、2.0至15.0g L-1的氯化钠；酵母提取物形式和谷氨酸单钠形式、浓度分别为2.0和8.0g L-1的氮源；以及葡萄糖形式、上限至130g L-1的碳。还公开了用于培养产油微生物的方法，该方法包括：在某种条件下培养产油微生物，其中所述条件包括含有如下组成的培养基：人工海盐(营养性海水)形式、2.0至15.0gL-1的氯化钠；酵母提取物形式和谷氨酸单钠形式、浓度分别为2.0和8.0g L-1的氮源；以及葡萄糖形式、上限至130g L-1的碳，还含有一种或多种脂肪酸生产拮抗剂。
所公开的方法可培养例如ONC-T18，使得总脂肪酸的至少24重量％为DHA、至少6重量％为DPA，并且至少1重量％为EPA。
所公开的培养方法还可培养例如ONC-T18，从而使得以重量计至少1％为类胡萝卜素物质，其中以重量计1至2％并且至少1.2％为虾青素，0.25至1％并且至少0.45％为玉米黄素，5至16％并且至少9％为角质素，1至2％并且至少1.2％为海胆酮以及12至16％并且至少14％为β-胡萝卜素。
3.核酸
存在多种基于核酸的本文公开的分子，包括例如编码例如rRNA以及任何其他本文公开的蛋白质的核酸，以及各种功能性核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物构成。这些和其他分子的非限制性实例在本文中有述。可以理解的是，例如将载体在细胞中表达时，所表达的mRNA通常由A、C、G和U/T构成。同样可以理解的是，例如若将反义分子通过例如外源送递引入细胞或细胞环境内，则有利的是，所述反义分子由可减少所述反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物构成。
a)核苷酸和相关分子
核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通过其磷酸部分和糖部分形成核苷间键合而连接在一起。核苷酸的碱基部分可为腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分为核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分为五价磷酸。核苷酸的非限制性实例为3’-AMP(3’-单磷酸腺苷)或5’-GMP(5’-单磷酸鸟苷)。
核苷酸类似物为含有对碱基、糖或磷酸部分作出某些类修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰为本领域所熟知的，包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤，以及在糖或磷酸部分作出的修饰。
核苷酸替代物为与核苷酸具有相似功能性但不含磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物为以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸、但通过非磷酸部分的部分连接在一起的分子。核苷酸替代物在与恰当的靶核酸相互作用时也能形成双螺旋型结构。
还能将其他形式的分子(缀合物)与核苷酸或核苷酸类似物连接起来以增强例如细胞摄入。缀合物可通过化学方式连接核苷酸或核苷酸类似物。这类缀合物包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6553-6556，1989)。
Watson-Crick相互作用为与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick界面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick界面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3和C4位。
Hoogsteen相互作用为发生在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen界面的相互作用，该界面暴露于双螺旋DNA的大沟中。Hoogsteen界面包括嘌呤核苷酸C6位的活性基团(NH2或O)和N7位。
b)序列
有多个序列与例如SEQ ID NO：1以及本文公开的任何其他核酸和蛋白质(可能在Genbank公开)相关，并且这些序列和其他序列以及其中所含有的各个子序列通过援引全部纳入本文。
本文提供了多个序列，并且这些序列和其他序列可参见Genbank(www.pubmed.gov)。本领域的技术人员明白如何分辨序列偏差和差异，并明白如何调整与某一具体序列相关的组合物和方法，使其适应其他相关序列。根据本文所公开信息和本领域已知信息，可设计任何序列的引物和/或探针。
c)引物和探针
公开了包括引物和探针在内的组合物，它们能与本文所公开的基因相互作用。在某些实施方案中，引物用于支持DNA扩增反应。引物通常能以序列特异方式被延长。序列特异方式的引物延长包括任何方法，其中与引物杂交或以其他方式相关的核酸分子的序列和/或组合物指导或影响通过引物延长所产生得到的产物的组合物或序列。因此，序列特异方式的引物延长包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延长、DNA聚合、RNA转录或反转录。优选以序列特异方式扩增引物的技术和条件。在某些方面，引物可用作本文提及的破囊壶菌或杆菌的种特异性或属特异性探针。在这种情况下，引物被可设计为特异性针对所述真核微生物，并在随后进行PCR反应。然后可通过成功形成PCR产物来确定靶标种的存在。在某些方面，所述引物还可用于DNA扩增反应，例如PCR或直接测序。可以理解的是，在某些方面，所述引物还可使用非酶促技术来延长，其中例如可修饰用于延长所述引物的核苷酸或寡核苷酸，从而使得它们可以发生化学反应来以序列特异方式延长所述引物。通常，所公开的引物可与核酸或核酸的某一区域杂交，或者它们可与所述核酸的互补序列或核酸某一区域的互补序列杂交。
d)核酸送递
正如本领域普通技术人员所公知的那样，在包括将外源DNA给予并被摄入受试者的细胞内的上述方法(即基因转导或转染)中，所公开核酸可为裸露DNA或RNA形式，或者所述核酸可存在于用于将所述核酸送递至所述细胞内的载体内，藉此编码抗体的DNA片段受到启动子的转录调节。载体可为商购制剂，例如腺病毒载体(QuantumBiotechnologies，Inc.(Laval，Quebec，Canada))。核酸或载体至细胞内的送递可通过多种机制。作为一个实例，送递可通过脂质体进行，可使用商购脂质体制剂例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，德国)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及根据本领域的方法标准开发出来的其他脂质体。另外，所公开核酸或载体可通过电穿孔(由Genetronics有限公司(San Diego，CA)提供的技术)以及通过SONOPORATION机器(ImaRx PharmaceuticalCorp.，Tucson，AZ)进行体内送递。
作为一个实例，载体送递可通过病毒系统，例如可包装重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统进行(参见例如Pastan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85：4486，1988；Miller et al.，Mol.Cell.Biol.6：2895，1986)。该重组逆转录病毒随后可用于感染细胞，并由此将编码主要中和抗体(或其活性片段)的核酸送递至该感染细胞中。当然，将有所改变的核酸引入哺乳动物细胞的确切方法并不限于使用逆转录病毒。对于该方法，还广泛存在其他技术，包括使用腺病毒载体(Mitani et al.，Hum.Gene Ther.5：941-948，1994)、腺伴随病毒(AAV)载体(Goodman et al.，Blood 84：1492-1500，1994)、慢病毒载体(Naidini et al.，Science 272：263-267，1996)和假型逆转录病毒载体(Agrawal et al.，Exper.Hematol.24：738-747，1996)。还可使用物理转导技术，例如通过脂质体送递和受体介导的送递以及其他胞吞机制进行(参见例如Schwartzenberger et al.，Blood 87：472-478，1996)。该公开的组合物和方法可与任何这些或其他通常使用的基因转移方法一起使用。
4.表达系统
被送递至细胞的核酸通常含有表达调控系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中的插入基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助调控所需基因产物的表达。启动子通常为在距离转录起始位点相对固定的位置时起作用的一个或多个DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子之间发生基本相互作用所必需的核心元件，并且可含有上游元件和应答元件。
可以理解的是，除了下文讨论的通用系统之外，还有多种可用于本文所公开生物体中的转录调控系统。可以理解的是，本文所公开生物体可用本文所阐述的多种基因例(如标记基因)或者具有其他所需属性(例如增强或独特的生长特征)的基因进行转染和转化。
a)病毒启动子和增强子
哺乳动物宿主细胞中控制从载体转录的优选启动子可获自多种来源例如诸如以下的病毒的基因组：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒，并且最优选巨细胞病毒，或者获自异源哺乳动物启动子如β-肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子通常以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性酶切片段的形式获得(Fiers et al.，Nature，273：113，1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子通常以HindIII E限制性酶切片段的形式获得(Greenway，PJ.et al，Gene 18：355-360，1982)。当然，来自宿主细胞或相关种的启动子也可用于本申请。
增强子通常指在距转录起始位点不固定距离起作用的DNA序列，并且可在转录单位的5’端(Laimins，L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78：993，1981)或3’端(Lusky，MX.，et al.，Mol Cell Bio.3：1108，1983)。另外，增强子可位于内含子内(Banerji，J.L.et al.，Cell 33：729，1983)以及编码序列自身内(Osborne，T.F.，et al.，Mol.Cell Bio.4：1293，1984)。它们通常长10至300bp，并且它们以顺式方式起作用。增强子起提高从邻近启动子开始的转录的作用。增强子通常还含有介导转录调节的应答元件。启动子还含有介导转录调节的应答元件。增强子通常对基因表达的调控起决定作用。尽管现在已知很多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)，但是通常会使用来自真核细胞病毒的增强子进行总体表达。优选的实例为复制起点后侧(100-270bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。
启动子和/或增强子可被激发其功能的光或特定化学事件特异性地激活。系统可受诸如四环素和地塞米松的试剂调节。还存在通过暴露于辐照例如γ辐照或烷化化疗药剂来增强病毒载体基因表达的方法。
在某些实施方案中，启动子和/或增强子区域可作为组成型启动子和/或增强子，以最大限度表达待转录的转录单位区域。在某些构建体中，即便启动子和/或增强子区域仅在特定时间在特定类型的细胞中表达，它在所有真核细胞类型中也均是具有活性的。这种类型的优选启动子为CMV启动子(650bp)。其他优选的启动子为SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTE。
已表明，所有特定调节元件均可被克隆并用于构建在特定细胞类型如黑素瘤细胞中选择性表达的表达载体。胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已被用于在胶质来源的细胞中选择性表达基因。
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体还可含有影响mRNA表达的转录终止所必需的序列。这些区域被转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化区段。3’非翻译区域也可包括转录终止位点。优选地，所述转录单位也含有多腺苷酸化区域。该区域的一个优点在于它增加了转录单位如mRNA被加工和运输的几率。表达构建体中多腺苷酸化信号的鉴定和使用已为本领域公知。优选地，将同源多腺苷酸化信号用于转基因构建体中。在某些转录单位中，多腺苷酸化区域来源于SV40早期多腺苷酸化信号，并由约400个碱基组成。还优选地，所述转录单位仅含有其他标准序列或者同时含有上述序列，以提高所述构建体的表达或稳定性。
b)标记物
病毒载体可包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定该基因是否被送递至细胞，并且一旦被送递则被表达。优选的标记基因为大肠杆菌LacZ基因(编码β-半乳糖苷酶)和绿色荧光蛋白。
在某些实施方案中，标记可为选择性标记。合适的用于哺乳动物细胞的选择性标记的实例为二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当这类选择性标记被成功转移至哺乳动物宿主细胞中时，若将经转化的哺乳动物细胞置于选择压力下则它可存活。存在两类广泛使用的不同的选择方案。第一类以细胞代谢和突变细胞系的使用为基础，所述突变细胞系缺乏不依赖补给性培养基而生长的能力。两个实例为CHO DHRF细胞和小鼠LTK细胞。这些细胞缺乏在不添加诸如胸苷或次黄嘌呤营养物的情况下生长的能力。由于这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径所必需的某些基因，因此若没有在补给性培养基中提供所缺少的核苷酸，则它们不能存活。补给培养基的另一途径是将完整的DHFR或TK基因引入缺乏相应基因的细胞中，由此改变其生长需求。未能由DHFR或TK基因转化的各个细胞将在非补给性培养基中不能存活。
第二类为显性选择，所述显性选择指用于任一细胞类型中并且不需要使用突变细胞系的选择方案。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的这些细胞会表达传送药物抗性的蛋白质，并且会在选择中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素(SouthernP.and Berg，P.，J Molec.Appl.Genet.1：327，1982)、麦考酚酸(Mulligan，R.C.and Berg，P.Science 209：1422，1980)或潮霉素(Sugden，B.et al.，Mol.Cell.Biol.5：410-413，1985)。这三个实例采用受真核生物基质控制的细菌基因，以分别赋予对合适的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(麦考酚酸)或潮霉素的抗性。其他实例包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
5.肽类
a)蛋白变体
如本文所述，本文所公开生物体蛋白的多个变体都是已知的并在本文中被考虑。另外，对于功能已知的破囊壶菌目的菌株而言，存在很多同样可用于所公开方法和组合物的破囊壶菌目蛋白的衍生物。蛋白变体和衍生物为本领域的技术人员所熟知，并且可包括氨基酸序列修饰物。例如，氨基酸序列修饰物通常包括以下三类中的一类或多类：置换变体、插入变体或缺失变体。插入包括氨基端和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。插入通常是比氨基端或羧基端融合的那些插入更小的插入，例如数量级为一至四个残基的插入。免疫原性融合蛋白衍生物——例如那些在实施例中描述的免疫原性融合蛋白衍生物——可通过如下方法制备得到：通过体外交联或通过用编码融合物的DNA转化的的重组细胞培养物，将大到足以赋予免疫原性的多肽与靶序列融合在一起。缺失的特征在于将一个或多个氨基酸残基从蛋白序列中除去。通常，蛋白分子内任一位置有不超过约2至6个的残基缺失。这些变体通常可通过编码蛋白质的DNA中核苷酸的位点特异性诱变制备得到，由此产生编码所述变体的DNA，并在随后于重组细胞培养物中表达DNA。在序列已知的DNA中的预定位点进行置换突变的技术是公知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸置换通常为一个残基，但是也可同时在多个不同位置处出现；插入的数量级通常为约1至10个氨基酸残基；并且缺失的范围为约1至30个残基。缺失或插入优选在相邻残基对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。置换、缺失、插入或它们的任一组合可联合起来获得最终的构建体。突变不能将序列置于读码框之外，并优选不会形成可产生mRNA二级结构的互补区域。置换变体为其中至少一个残基被除去并且一个不同残基被插入该位置的那些变体。这类置换通常可依据下表1和2进行，并被认为是保守置换。
功能或免疫性方面的显著改变可通过选择保守性不如表2的那些置换的置换来实现，即选择在对保持下述结构或性质的影响方面的差异更显著的残基：(a)置换区域中多肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)靶位点的分子的电荷或疏水性或者(c)侧链的大小。通常被预计会在蛋白性质方面产生的变化最大的置换为以下的这些置换：(a)亲水残基如丝氨酰基或苏氨酰基置换疏水残基如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基(或被它们置换)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换任何其他残基(或被它们置换)；(c)带有正电侧链的残基如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基置换负电残基如谷氨酰基或天冬氨酰基(或被它们置换)；或者(d)用具有大侧链的残基如苯丙氨酸置换不具有侧链的残基如甘氨酸(或被它们置换)，在这种情况下，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位点的数目。
表1：氨基酸缩写
  氨基酸   缩写
  丙氨酸   Ala  A
  精氨酸   Arg  R
  天冬酰胺   Asn  N
  天冬氨酸   Asp  D
  半胱氨酸   Cys  C
  谷氨酰胺   Gln  Q
  谷氨酸   Glu  E
  甘氨酸   Gly  G
  组氨酸   His  H
  异亮氨酸   Ile  I
  亮氨酸   Leu  L
  赖氨酸   Lys  K
  蛋氨酸   Met  M
  苯丙氨酸   Phe  F
  脯氨酸   Pro  P
  丝氨酸   Ser  S
  苏氨酸   Thr  T
  色氨酸   Trp  W
  酪氨酸   Tyr  Y
  缬氨酸   Val  V
表2：氨基酸置换
  原始残基   示例性保守置换＊
  Ala   Ser
  Arg   Lys；Glu
  Asn   Gln；His
  Asp   Glu
  Cys   Ser
  Gln   Asn；Lys
  Glu   Asp
  Gly   Pro
  His   Asn；Gln
  Ile   Leu；Val
  Leu   Ile；Val
  Lys   Arg；Gln
  Met   Leu；Ile
  Phe   Met；Leu；Tyr
  Pro   Gly
  Ser   Thr
  Thr   Ser
  Trp   Tyr
  Tyr   Trp；Phe
  Val   Ile；Leu
*其他为本领域已知
例如，一个氨基酸残基由在生物学和/或化学上相似的另一氨基酸残基所替换被本领域的技术人员称为保守置换。例如，保守置换将用一个疏水残基来替换另一个疏水残基，或者用一个极性残基来替换另一个极性残基。上述置换包括以下组合，例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Try。每个明确公开序列的这些保守置换变体均包括在本文所提供的嵌合(mosaic)多肽范围内。
可采用置换诱变或缺失诱变来插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可能是所需的。潜在的蛋白酶解位点如Arg的缺失或置换通过例如使碱性残基之一缺失来实现，或通过用谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基置换一个残基来实现。
某些翻译后的衍生化作用是由于重组宿主细胞对所表达多肽的作用所致。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常在翻译后脱去酰胺基成为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这些残基在温和的酸性环境下脱去酰胺基。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的o-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco pp 79-86，1983)，N端氨基的乙酰化以及在某些情况下C端羧基的酰胺化。
可以理解的是，定义本文所公开蛋白质的变体和衍生物的一种方法是通过根据其与具体已知序列的同源性/同一性来定义该变体和衍生物。具体公开的是本文公开蛋白质的变体，所述变体与所述序列具有至少60％、70％或75％或80％或85％或90％或95％的同源性。本领域的技术人员容易理解如何确定两种蛋白质的同源性。例如，同源性可在比对这两个序列使得该同源性处于最高水平之后计算得到。
计算同源性的另一种方法可通过已经公布的算法来进行。比较序列的最佳比对可通过以下方法进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482，1981)、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson和Lipinan的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)、这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 SeienceDr.，Madison，WT)或者核查。
相同类型的核酸同源性可通过例如在以下文献中公开的算法来获得：Zuker，M.Science 244：48-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：7706-7710，1989，Jaeger et al.MethodsEnzymol.183：281-306，1989，至少就其与核酸比对相关的内容通过援引将这些文献纳入本文。
可以理解的是，对保守突变和同源性的描述可以任何组合结合起来，例如与具体序列具有至少70％的同源性的实施方案，其中所述变体为保守突变。
由于本说明书阐述了各种蛋白和蛋白序列，因此要理解的是，编码这些蛋白序列的核酸同样被公开。这将包括与特定蛋白序列相关的所有简并序列，即具有编码一个具体蛋白序列的序列的所有核酸，以及编码所公开的该蛋白序列的变体和衍生物的所有核酸(包括简并核酸)。因此，尽管各个具体核酸序列可能并未在本文中写出，但是应理解的是，实际上每一个序列均通过所公开的蛋白质序列在本文中被公开和被描述。还要理解的是，当本文中公开了所公开蛋白的具体变体时，尽管没有氨基酸序列表明是哪种具体的DNA序列在生物体内编码该蛋白，但是编码产生该蛋白的具体菌株中此种蛋白的已知核酸序列同样是已知的，并且在本文中得以公开和描述。
可以理解的是，存在许多可被引入所公开组合物的氨基酸和肽类似物。例如，存在许多D-氨基酸或者具有与表1和表2中所示氨基酸不同的官能取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的对应立体异构体以及肽类似物的立体异构体。这些氨基酸可很容易地通过以下方式被引入多肽链：用所选氨基酸使tRNA分子带电，并利用例如琥珀密码子以位点特异方式将氨基酸类似物插入肽链来对遗传构建体进行基因工程改造(Thorson et al.，Methods in Mol.Biol.77：43-73，1991，Zoller，Curr.Opin.Biotech.，3：348-354，1992；Ibba，Biotechnol.Genet.Eng.13：197-216，1995，Cahill et al.，TrendsBiochem.Sci，14：400-403，1989；Benner，Trends.Biotechnol.，12：158-163，1994)至少就其与氨基酸类似物相关的内容通过援引将所有这些文献纳入本文)。
可产生与肽相似但不通过天然肽键连接的分子。例如，连接氨基酸或氨基酸类似物的键可包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2-和--CHH2SO--(这些键和其他键可参见Spatola，A.F.in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267，1983；Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue 3，Peptide BackboneModifications(概述)；Morley，Trends Pharm.Sci.463-468，1980；Hudson，D.et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.14：177-185，1979(--CH2NH--、CH2CH2-)；Spatola et al.Life Sci.38：1243-1249，1986(--CH H2-S)；Hann J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 307-314，1982(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist et al.J.Med.Chem.23：1392-1398，1980(--COCH2--)；Jennings-White et al.Tetrahedron Lett.，23：2533，1982(--COCH2--)；Szelke et al.European Appln.，EP 45665 CA：97：39405，1982(--CH(OH)CH2--)；Holladay et al.Tetrahedron Lett.24：4401-4404，1983(--C(OH)CH2--)和Hruby Life Sci.31：189-199，1982(--CH2--S--)，每一篇文献均通过引用纳入本文。特别优选的非肽键是--CH2NH--。可以理解的是，肽类似物可在上述键两端的原子之间具有一个以上的原子，例如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。
氨基酸类似物、类似物和肽类似物通常具有增强或所需的属性，例如生产更为经济、化学稳定性更高、药理性质(半衰期、吸收情况、效价、效力等)增强、特异性发生改变(如广谱的生物活性)、抗原性降低等。
D-氨基酸可用于形成更稳定的肽，原因在于D-氨基酸不会被肽酶等所识别。用相同类型的D-氨基酸来对具有保守序列的一个或多个氨基酸进行全面置换(例如用D-赖氨酸来置换L-赖氨酸)可用来形成更稳定的肽。半胱氨酸残基可用来环化或连接两个或多个肽。这对于迫使肽形成特定构象是有益的(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387，1992，通过援引纳入本文)。
6.补充剂
本文还公开了营养补充剂。营养补充剂为可通过给予受试者或由受试者服用，以提供、供给或增加营养物质(如维生素、矿物质、必需微量元素、氨基酸、肽、核酸、寡核苷酸、脂质、胆固醇、类固醇、碳水化合物等)的任何化合物或组合物。在一方面，本文公开了含有本文所公开任何一种化合物的营养补充剂。例如，营养补充剂可包括本文所公开的任何一种脂质。这些脂质的脂肪酸残基可为本文所公开的任何脂肪酸(如不饱和或饱和脂肪酸残基)。
营养补充剂可含有任何量本文所公开的化合物，但是将通常含有被确定可提供给受试者所需剂量的苯二醇衍生物(如CoQ10)和/或脂肪酸的量。营养补充剂中所需要的化合物的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄、体重和整体状况，被治疗的饮食缺陷的严重程度，具体的给药模式等。因此，不能对每一营养补充剂的具体量进行规定。但是，合适的量可由本领域普通技术人员在考虑本文的教导的情况下仅使用常规实验就能确定。在一个具体的实例中，营养补充剂可含有以重量计约0.05至约20％、约1至约7.5％或约3至约5％的化合物。在另一个实例中，营养补充剂可含有以重量计约0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0％的所述化合物，在合适时任一所述数值可形成上端点或下端点。在另一方面，当为营养补充剂时，该添加剂可由上限至100％的添加剂构成。
营养补充剂还可含有其他营养物质如维生素、微量元素、矿物质等。此外，营养补充剂可含有其他组分例如防腐剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂和/或粘合剂。
营养补充剂通常可口服，并且可为任何适于口服给药的形式。例如，营养补充剂通常可为片剂、凝胶胶囊、胶囊、液体、囊剂或糖浆形式。
7.送递装置
本文所述任何化合物均可掺入送递装置。送递装置的实例包括但不限于微囊、微球、纳米球或纳米颗粒、脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米红质体、固体-液体纳米颗粒、凝胶、凝胶胶囊、片剂、洗剂、膏剂、喷雾剂或乳剂。适合非口服给药的送递装置的其他实例包括多孔微粒pulmosphere。用于本文的具体送递装置的实例如下所述。
可将所公开化合物掺入脂质体中。正如本领域所知，脂质体通常来源于磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散于水性介质中的单层或多层含水液晶形成。任何能形成脂质体的无毒、生理上可接受并且可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的所公开组合物除含有本文公开的化合物外，还含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。合适的脂质的实例为天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。制备脂质体的方法为本领域所知。参见例如Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，p.33 et seq.，1976，就其对脂质体及其制备方法的教导通过援引纳入本文。
在其他实例中，脂质体可为阳离子型脂质体(如DOTMA、DOPE、DC胆固醇)或阴离子型脂质体。如若需要，脂质体可进一步包含有助于靶向具体细胞的蛋白质。含有化合物和阳离子型脂质体的组合物的给药方式可以为给予至流入靶器官的血液或者被吸入至呼吸道从而靶向呼吸道的细胞。关于脂质体，参见例如Brigham，et al，Am JResp Cell Mol Biol 1：95-100，1989；Feigner，et al.，Proc NatlAcad Sci USA 84：7413-7，1987和美国专利No.4,897,355，就其对脂质体的教导通过引用纳入本文。作为一个实例，送递可经由脂质体进行，并且可使用商购脂质体制剂例如LIPOFECITN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)以及根据本领域的方法标准开发的其他脂质体等。还可使用其中设计用于使化合物以特定速率或剂量自脂质体的扩散或送递的脂质体。
本文所述的非离子表面活性剂囊泡是可用来送递本文公开组合物的送递装置。非离子表面活性剂囊泡是包含非离子型表面活性剂的多室或单室囊泡。溶质的水溶液被由表面活性剂大分子组装形成的双分子层所包裹。与脂质体类似，非离子表面活性剂囊泡也用于靶向送递例如抗癌药，包括氨甲喋呤、多柔比星和免疫佐剂。通常认为它们与transferosome、由两亲糖类制备的囊泡和含有氨基基团的聚合物(如壳多糖)并不相同。
本文所述的纳米红质体是可用于送递本文公开组合物的送递装置。纳米红质体是由红细胞经由通过具有确定孔径的滤器的透析而制备得到的纳米囊泡。这些载体可被装载上各种生物活性分子的阵列，所述生物活性分子包括本文所公开的蛋白质和组合物。它们通常作为抗肿瘤剂(例如博来霉素、放线菌素D)的理想载体，但是也可用于送递类固醇和其他脂质等。
本文所述的人工红细胞是可用于送递本文所公开组合物的另一类送递装置。人工红细胞可通过界面聚合法和复合乳化法形成。通常，“细胞”壁由polyphtaloyl L-赖氨酸聚合物/聚苯乙烯构成，内部由来自绵羊红细胞裂解液的血红蛋白溶液构成。负载血红蛋白的微球通常具有约1至约10mm的颗粒大小。它们的大小、柔韧度和携氧能力与红细胞相似。
本文所述固体-液体纳米颗粒是可用于送递本发明组合物的其他送递装置。固体-液体纳米颗粒是纳米颗粒，它们分散于水性表面活性剂溶液中。它们由具有单分子层磷脂包被物的固体疏水核心构成，通常由高压匀浆技术制备得到。免疫刺激复合物(ISCOMS)是固体-液体纳米颗粒的实例。它们是含有脂质、胆固醇和疏水抗原的40nm笼形超分子装置，主要用作免疫佐剂。例如，ISCOM可用于延长皮下注射的环孢霉菌A的血浆水平。
本文所述的微球和微囊是可用于送递本文公开组合物的其他送递装置。与脂质体送递系统不同，微球和微囊通常并不具有水性核心，而是具有固体聚合物基质或膜。这些送递装置通过以下方法获得：聚合物的控制沉淀法、可溶聚合物的化学交联法以及两种单体的界面聚合法或高压匀浆技术。这些被包封的化合物通过自颗粒蚀解或扩散从储库逐渐释放。已成功开发出短效肽类制剂，例如诸如亮丙瑞林和曲谱瑞林(triptoreline)的LHRH激动剂。聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)微球目前以每月一次和每三月一次的剂型形式用于治疗晚期前列腺癌、子宫内膜异位症和其他激素响应病症。亮丙瑞林是一种LHRH超拮抗剂，使用溶剂萃取法/蒸发法可将其掺入多种PLGA基质中。正如所描述的那样，全部这些送递装置均可用于本文所公开方法中。
Pulmosphere是可用于本发明的送递装置的其他实例。Pulmosphere为密度较低(小于约0.1m mL-1)的中空多孔颗粒。Pulmosphere通常具有良好的再分散性，通常通过超临界液体浓缩(supercritical fluid condensation)技术制备。采用某些基质(如碳水化合物、人血清白蛋白等)的同步喷雾干燥法可提高用于肺部送递的蛋白质和肽(如胰岛素)以及其他生物分子的稳定性。这类送递还可由微型乳剂和脂质乳剂完成，这两类乳剂为无需大量输入机械能即能自发形成的超细、超薄、透明的水包油(o/w)乳剂。在该技术中，乳剂可在某一温度下制备，该温度必须较系统的相转移温度要高。在较高温度条件下，该乳剂为油包水(w/o)形式，而在相转移温度下冷却时，该乳剂则反转为o/w。由于其内相非常小，所以它们极其稳定并且可用于类固醇和疫苗的缓释。脂质乳剂包含中性脂质核心(即甘油三酯)，所述核心通过使用表面活性剂(如卵磷脂甘油三酯和miglyol)的两亲脂质(即磷脂)的单分子层稳定化。它们适合于被动靶向和主动靶向。
也研究了其他口服送递系统，所述系统以渗透压调整、pH调整、溶涨调整、改变的密度和浮动系统(altered density and floatingsystem)、粘附性(mucoadhesiveness)等为基础。当前正在使用或研究的依据疾病的昼夜规律送递药物的这些制剂和缓释制剂均可用来送递本文公开的组合物。
在本文公开的一个具体方面，所公开化合物(包括营养补充剂及其药物制剂)可如本文所述被掺入微囊中。
在本文公开的一个方面，所公开化合物可被掺入微囊中。在一方面，微囊含有基本(primary)微囊的聚集物(agglomeration)和本文所述的铬化合物，每个基本微囊个体均具有一个主壳(primaryshell)，其中所述铬化合物被所述主壳包封，其中所述聚集物被外壳包封。这些微囊在本文中被称为“多核微囊”。
在另一方面，本文描述了包括铬化合物、主壳和辅壳的微囊，其中所述主壳包封铬化合物，而所述辅壳包封负载物质和主壳。这些微囊在本文中被称为“单核微囊”。
任选地，其他负载物质可与铬化合物一起被包封。负载物质可为在水性混合物中不完全溶解的任何物质。在一方面，负载物质为固体、疏水液体或固体和疏水液体的混合物。在另一方面，负载物质含有脂肪、油类、脂质、药物(如小分子)、生物活性物质、营养补充剂(如维生素)、香味化合物或它们的混合物。油类的实例包括但不限于动物油(如鱼油、海生哺乳动物油等)、植物油(如油菜籽油或菜籽油)、矿物油、其衍生物或它们的混合物。负载物质可为纯化的或部分纯化的油性物质如脂肪酸、甘油三酯或其酯、或它们的混合物。在另一方面，负载物质可为类胡萝卜素(如番茄红素)、填充剂(satietyagent)、香味化合物、药物(如非水溶性药物)、颗粒、农用化合物(如除草剂、杀虫剂、肥料)或水产养殖成分(如饲料、色素)。
在一方面，负载物质可为ω-3脂肪酸。ω-3脂肪酸的实例包括但不限于α-亚麻酸(18:3n3)、十八碳四烯酸(18:4n3)、二十碳五烯酸(20:5n3)(EPA)、二十二碳六烯酸(22:6n3)(DHA)、二十二碳五烯酸(22:5n3)(DPA)、二十碳四烯酸(20:4n3)、二十一碳五烯酸(21:5n3)、二十二碳五烯酸(22:5n3)，以及它们的衍生物及它们的混合物。ω-3脂肪酸的多类衍生物为本领域所熟知。合适的衍生物的实例包括但不限于酯类例如植物甾醇酯、支链或直链C1-C30烷基酯、支链或直链C2-C30烯基酯、或者支链或直链C3-C30环烷基酯(如植物甾醇酯)和C1-C6烷基酯。油源可来自水生生物(如鳀鱼、毛鳞鱼、大西洋鳕、大西洋鲱、大西洋鲭、大西洋鲱鱼、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲔鱼等)和植物(如亚麻、蔬菜等)以及微生物(如真菌和藻类)。
在一方面，负载物质可含有抗氧化剂。抗氧化剂的实例包括但不限于维生素E、CoQ10、生育酚、极性更强的抗氧化剂的脂溶性衍生物如抗坏血酸脂肪酸酯(如抗坏血酸棕榈酸酯)、植物提取物(如迷迭香油、鼠尾草油和牛至油)、藻提取物和合成抗氧化剂(如BHT、TBHQ、乙氧喹、烷基没食子酸酯、氢醌、生育三烯酸)。
许多不同的聚合物可用于生产单核微囊和多核微囊的壳层。这类聚合物的实例包括但不限于蛋白质、聚磷酸酯、多糖或它们的混合物。在另一方面，用于制备单核微囊和多核微囊的壳材进一步包括A型明胶、B型明胶、聚磷酸酯、阿拉伯胶、藻酸盐、壳多糖、角叉菜胶、果胶、淀粉、变性淀粉、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白(lactoglobumin)、卵清蛋白、聚山梨酯(polysorbiton)、麦芽糊精、环糊精、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素(hydropropylmethylcellulose)、羧甲基纤维素、乳蛋白质、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白、甲壳质、聚丙交酯、聚-丙交酯-共-乙交酯、衍生的甲壳质、壳多糖、聚赖氨酸、各种无机-有机复合材料或它们的任何混合物。同样虑及的是这些聚合物的衍生物也可使用。在另一方面，聚合物可为kosher明胶、non-kosher明胶、Halal明胶或non-Halal明胶。
在一方面，单核微囊和多核微囊中一层或多层壳层含有Bloom值小于50的明胶。该明胶在本文中被称为“低Bloom明胶”。Bloom值描述了6.67％的溶液在10℃胶化18小时时形成的凝胶强度。在一方面，低Bloom明胶的Bloom值低于40、低于30、低于20或低于10。在另一方面，明胶的Bloom值为45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0，其中任何两个数值均可用来形成一个范围。在另一方面，低Bloom明胶存在于多核微囊的主壳和外壳两者之中。在一方面，低Bloom明胶为A型明胶。在另一方面，低Bloom明胶为Kenney&Ross Ltd.，R.R.#3 Shelburne，NS Canada生产的A型明胶。在另一方面，在多核微囊的主壳和外壳之中均存在Bloom值为零的明胶。
在一方面，用于制备单核微囊或多核微囊的壳层的材料为由两类不同聚合物的混合物所制备得到的二组分系统。在一方面，该材料为聚合物组分之间的复合凝聚层。复合凝聚作用是由于两种带有相反电荷的聚合物之间的相互作用所致。在一方面，用于生产单核微囊和多核微囊的壳材由以下物质构成：(1)低Bloom明胶和(2)B型明胶、聚磷酸酯、阿拉伯胶、藻酸盐、壳多糖、角叉菜胶、果胶、羧甲基纤维素、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白或它们的任意混合物。不同聚合物的摩尔比可有所变化。例如，低Bloom明胶和其他聚合物组分的摩尔比为1∶5至15∶1。例如，在使用低Bloom明胶和聚磷酸酯时，低Bloom明胶和聚磷酸酯的摩尔比为约8∶1至约12∶1；在使用低Bloom明胶和B型明胶时，摩尔比为2∶1至1∶2；而在使用低Bloom明胶和藻酸盐时，摩尔比为3∶1至8∶1。
壳材(如主壳或外壳)中可包含有加工助剂。加工助剂的使用可有多种原因。例如，它们可用于促进基本微囊的凝聚、稳定乳液系统、改善外壳的性质、控制微囊大小和/或用作抗氧化剂。在一方面，加工助剂可为乳化剂、脂肪酸、脂质、蜡、微生物细胞(如酵母细胞系)、粘土或无机化合物(如碳酸钠)。并不希望受缚于理论，这些加工助剂可促进微囊的屏障性。在一方面，可将一种或多种抗氧化剂加入壳材中。抗氧化性在加工期间(如在凝聚和/或喷雾干燥期间)以及在形成之后的微囊中(即延长壳寿命等)均是有用的。优选可以使用起多种作用的少量加工助剂。在一方面，抗氧化剂可为酚化物、植物提取物或含硫氨基酸。在一方面，抗坏血酸(或其盐例如抗坏血酸钠或抗坏血酸钾)可用来促进基本微囊的凝聚、控制微囊大小和用作抗氧化剂。抗氧化剂可使用的量为约100ppm至约12,000ppm，或者约1,000ppm至约5,000ppm。也可使用其他加工助剂例如金属螯合物。例如，乙二胺四乙酸可用来结合金属离子，该金属离子可降低负载物质的催化氧化作用。
在一方面，基本微囊(主壳)的平均直径为约40nm至约10μm、0.1μm至约10μm、1μm至约10μm、1μm至约8μm、1μm至约6μm、1μm至约4μm或1μm至约2μm，或者1μm。在另一方面，多核微囊的平均直径为约1μm至约2000μm、20μm至约1000μm、约20μm至约100μm或约30μm至约80μm。在另一方面，单核微囊的外径为约1μm至2,000μm。
本文所述的微囊通常同时具有高的有效负荷和结构强度。例如，负载物质的有效负荷以重量计占单核微囊或多核微囊的20％至90％、50％至70％或者以重量计占60％。
在一方面，美国专利申请公开文本No.2003/0193102(通过援引全文纳入)所公开的方法可用来包封本文所述藻脂质。同样考虑到的是在单核微囊或多核微囊的外壳上可搁置一层或多层额外的壳层。在一方面，国际申请公开文本No.WO 2004/041251 A1(通过援引全文纳入)所述的技术可用于在单核微囊和多核微囊上添加额外的壳层。
a)药物组合物和营养组合物
这些脂质和抗氧化剂旨在用于动物饲料、药物制剂、营养制品(特别是婴儿配方)以及用于工业生产中。这也同样包括营养制品的送递形式如凝胶胶囊和常见的微囊化等。
如上所述，组合物也可以以可药用载体形式用于体内给药。“可药用”指的是非生物学上或其他方面不合需要的物质，即该物质可与核酸或载体一起给予受试者，而不会引起任何不良生物学影响或以有害方式与含有该物质的药物组合物的任何其他组分相互作用。正如本领域技术人员所熟知的那样，必然会对载体进行选择，从而使得活性成分的任何降解最少，并使其对于受试者的任何不良副作用最小化。
组合物可通过口服、胃肠外(如静脉内)途径、肌内注射、腹膜内注射、经皮、体外、局部途径等给药，包括局部鼻内给药或通过吸入器给药。本文所使用的“局部鼻内给药”指的是通过一个或两个鼻孔将组合物送递至鼻内或鼻道，并且可包括通过喷雾机制或滴注机制或通过雾化核酸或载体来送递。通过吸入器给予组合物可经由通过喷雾或滴注机制的送递通过鼻或嘴进行。送递还可经由插管法直接到达呼吸系统(如肺)的任何区域。所需要的组合物的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄、体重和整体状况、被治疗的变态性紊乱的严重程度、所使用的具体核酸或载体、其给药模式等。因此，不能对每种组合物的确切量进行规定。但是，合适的量可由本领域普通技术人员在考虑本文的教导的情况下仅使用常规实验就能确定。
若使用组合物的胃肠外给药，那么其特征通常在于通过注射给药。注射剂可以常规形式制备，为液体溶液或悬液、适合在注射前配制成悬浮于液体中的溶液的固体形式，或者为乳液形式。新近作出改进的胃肠外给药方法包括使用慢释或缓释系统以维持恒定剂量。参见例如美国专利No.3,610,795，通过援引将其纳入本文。
该物质可存在于溶液、悬液(例如被掺入至微粒、脂质体或细胞中)中。这些物质可经由抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术来将特定蛋白靶向肿瘤组织的实例(Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，2：447-451，1991；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60：275-281，1989；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58：700-703，1988；Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，4：3-9，1993；Battelli，et al.，Cancer Immunol.Immunother.，35：421-425，1992；Pietersz and McKenzie，Immunolog.Reviews，129：57-80，1992和Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol.，42：2062-2065，1991)。运载体例如“Stealth”和其他抗体可缀合脂质体(包括介导药物靶向结肠癌的脂质)、通过细胞特异性配体介导DNA靶向的受体、引导肿瘤靶向的淋巴细胞以及高度特异性治疗性反转录病毒靶向的鼠体内胶质瘤(glicoma)细胞。以下参考文献是利用该技术来将具体蛋白靶向肿瘤组织的实例(Hughes et al.，CancerResearch，49：6214-6220，1989)；和Litzinger and Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104：179-187，1992)。总之，受体以组成型方式或配体诱导方式参与到胞吞途径中。这些受体聚集于笼形蛋白小窝中，经由笼形蛋白包裹的小泡进入细胞，穿过酸化内体(受体在其中被分选)，随后或者再循环至细胞表面被储存于细胞内，或者在溶酶体中被降解。内化途径起着多种作用，例如营养物质的摄入、活化蛋白的除去、大分子的清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解以及受体水平的调节。很多受体遵循一种以上的胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体效价和配体浓度。受体介导的胞吞作用的分子和细胞机制已有综述(Brown andGreene，DNA and Cell Biology 10：399-409，1991)。
(1)可药用载体
包含抗体的组合物可与可药用载体联合用于治疗。
合适的载体及其制剂描述于Remington：The Science andPractice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，MackPublishing Company，Easton，PA 1995。通常，可在制剂中使用恰当量的可药用盐以确保制剂等渗。可药用载体的实例包括但不限于盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选地为约5至约8，更优选约7至约7.5。其他载体包括缓释制剂例如含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质为具有成型颗粒的形式例如薄片、脂质体或微粒形式。对于本领域技术人员而言显而易见的是，某些载体更为优选，这取决于例如给药途径和被给药的组合物的浓度。
药物载体为本领域技术人员所知。它们最通常为将药物给予人的标准载体，包括溶液例如无菌水、盐水和生理pH的缓冲溶液。组合物可经肌内或皮下途径给药。其他化合物可依据本领域技术人员所使用的标准方法给予。
除了所选分子之外，药物组合物还可包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包含一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
药物组合物可以多种方式给药，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗区域。可通过局部途径(包括眼部途径、阴道途径、直肠途径、鼻内途径)、口服途径、吸入途径或肠胃外途径给药，例如通过静脉内滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射给药。所公开抗体可通过静脉内途径、腹膜内途径、肌内途径、皮下途径、腔内或经皮途径给药。
胃肠外给药制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、酒精溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外运载体包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸Ringer’s或不挥发性油。静脉内运载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如以Ringer’s葡萄糖为基础的那些电解质补充剂)等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
局部给药制剂可包含软膏剂、洗剂、膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载体、水性基质、粉剂基质或油性基质、增稠剂等可能是必不可少的或需要的。
口服给药组合物包含溶于水或非水性介质中的粉剂或颗粒剂、悬液或液体、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是合乎需要的。
一些组合物有可能以可药用酸加成盐或碱加成盐形式有效地给药，所述加成盐通过与无机酸(如氢氯酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸等)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸等)反应形成，或通过与无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等)和有机碱(如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺等)反应形成。
(2)治疗用途
有效剂量和组合物的给药方案可依据经验确定，并且做出这类决定是在本领域技术人员能力范围内的。组合物给药的剂量范围为大到足以产生其中症状紊乱得到治疗的所需疗效的那些剂量范围。剂量不应大到引起不良副作用，例如不良交叉反应、过敏性反应等。通常，剂量会随以下因素而异：患者年龄、病症、性别和疾病严重程度，给药途径，或者给药方案中是否包含其他药物；并且可由本领域技术人员来确定。若出现任何禁忌症，则该剂量可由各个医师来调整。剂量可有所变化，并且可以每日单剂或多剂给药形式给予，持续一天或几天。用于指定类别药剂的合适剂量的指南可参见文献。例如，选择合适的抗体剂量的指南可参见关于抗体的治疗用途的文献，如Handbookof Monoclonal Antibodies，Ferrone et al.，eds.，NogesPublications，Park Ridge，NJ.，(1985)ch.22 and pp.303-357；Smith et al.，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haberet al.，eds.，Raven Press，New York(1977)pp.365-389。单独使用的抗体的典型每日剂量为每天约1μg/kg至上限100mg/kg体重或更多，这取决于上文提及的因素。
b)靶向送递
所公开脂质体和微囊可经由抗体、受体或受体配体被靶向至特定细胞类型如胰岛细胞。以下的参考文献是为利用该技术来靶向特定组织的实例(Senter，et al.，Bioconjugate Chem 2：447-51，1991；Bagshawe，Br J Cancer 60：275-81，1989；Bagshawe，et al.，BrJ Cancer 58：700-3，1988；Senter，et al.，Bioconjugate Chem4：3-9，1993；Battelli，et al.，Cancer Immunol Immunother35：421-5，1992；Pietersz and McKenzie，Immunolog Reviews129：57-80，1992和Roffler，et al.，Biochem Pharmacol 42：2062-5，1991)。这些技术可用于各种其他特定的细胞类型。
8.食品
本文还公开了含有本文所公开的任一微囊和乳液的食品。“食品”指的是可由受试者服用(如吃、喝或摄取)的任何物质。在一方面，微囊可用作食品的营养补充剂。例如，微囊和乳液可装载有维生素、ω-3脂肪酸和对健康有益的其他化合物。在一方面，食品可为烘焙食品、面食、肉制品、冷冻乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、调味品、汤粉、点心、坚果制品、植物蛋白制品、硬糖、软糖、家禽产品、经加工的果汁、砂糖(如白砂糖或赤砂糖)、酱油、肉汁、糖浆、营养棒、饮料、饮料干粉、果酱或果冻、鱼制品或伴侣宠物食品。在另一方面，食品为面包、玉米饼、谷类食品、香肠、鸡肉、冰淇淋、酸奶、牛奶、沙拉调味料、米糠、果汁、饮料干粉、面包卷、饼干、薄脆饼干、快餐、水果馅饼或蛋糕。
9.芯片和微阵列
公开了其中至少有一个地址为本文所公开的任一核酸序列中所列出的序列或序列的一部分的芯片。还公开了其中至少有一个地址为本文所公开任一肽序列中所列出的序列或序列的一部分的芯片。
还公开了其中至少有一个地址为本文所公开任一核酸序列中所列出的序列或序列的一部分的变体的芯片。还公开了其中至少有一个地址为本文所公开任一肽序列中所列出的序列或序列的一部分的变体的芯片。
10.计算机可读介质
可以理解的是，所公开的核酸和蛋白质可表示为由核苷酸或氨基酸组成的序列。存在多种方法来显示这些序列，例如，核苷酸鸟苷可表示为G或g。同样，氨基酸缬氨酸可表示为Val或V。本领域的技术人员明白如何以所存在的多种方式中的任何一种方式(每种方式均被认为在本文中公开)显示和表达任一核酸或蛋白序列。在本文中特别考虑的是将这些序列显示于计算机可读介质上，例如可商购的软盘、磁带、芯片、硬盘、光盘和视盘或其他计算机可读介质。还公开了所公开序列的二进制代码表示形式。本领域的技术人员明白是什么是计算机可读介质。因此，这种计算机可读介质记录、储存或保存了核酸或蛋白序列。
公开了记载有本文所列出的序列和与这些序列相关的信息的计算机可读介质。
11.试剂盒
本文公开了装有可用于实施本文所公开方法或可用于使用或保存本文所公开组合物的试剂的试剂盒。该试剂盒可包含本文所讨论的或者被认为是实施所公开方法所必不可少的或有益的任何试剂或试剂的组合。例如，该试剂盒可包括本文所公开的一种或多种真核微生物以及例如用于培养它们的培养基。该试剂盒还包括例如脂质或抗氧化剂以及使用或者给予这些物质的工具。
12.具有相似功能的组合物
可以理解的是，本文所公开组合物具有某些功能，例如产生一定比率的脂质。本文公开了实现所公开功能的某些结构方面、遗传方面和功能方面的要求，并且可以理解的是，存在多种能实现与所公开结构相关的相同功能的结构、遗传背景以及功能背景，并且这些结构最终会获得相同的结果，例如产生一定比率的脂质。
D.制备组合物的方法
除非另外明确指明，否则本文所公开组合物和进行所公开方法必不可少的组合物，可通过使用本领域技术人员已知的用于该具体试剂或化合物的任何方法制备得到。
1.核酸合成
例如，核酸(例如预备用作引物的寡核苷酸)可使用标准化学合成法制备得到，或者使用酶促法或任何其他已知方法产生。这类方法包括由标准的酶法消化之后进行核苷酸片段分离(参见例如Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)Chapters 5，6)至纯粹的合成法，例如通过采用Milligen或Beckman System 1 Plus DNA合成仪(例如Milligen-Biosearch，Burlington，MA的型号为8700的自动合成仪或ABI 380B型)的氰乙基磷酰胺酸法。用于制备寡核苷酸的合成法同样描述于Ikuta etal.，Ann.Rev.Biochem.53：323-356，1984(磷酸三酯法和亚磷酸三酯法)和Narang et al.，Methods Enzymol.，65：610-620，1980(磷酸三酯法)。蛋白核酸分子可使用已知方法例如由Nielsen et al.，Bioconjug.Chem.5：3-7，1994所描述的那些方法来制备。
2.肽合成
产生所公开蛋白质的一种方法是通过蛋白化学技术将两个或多个肽或多肽连接起来。例如，肽或多肽可使用现有的实验设备、采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学品(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)进行化学合成。本领域的技术人员容易理解，与所公开蛋白质相对应的肽或多肽可通过例如标准化学反应合成。例如，可合成某种肽或多肽并且不将其从其合成树脂上切割下来，而可合成肽或蛋白的其他片段并在随后将其从树脂上切割下来，由此暴露出在其他片段上被功能性阻断的末端基团。通过肽缩合反应，这两个片段可经由肽键分别在其羧基末端和氨基末端共价连接，从而形成抗体或其片段(Grant GA(1992)Synthetic Peptides：A User Guide.W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1992)；Bodansky Mand Trost B.，Ed.(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.，NY(至少就其与肽合成相关的内容将其纳入本文))。或者，如本文所述，在体内独立合成肽或多肽。这些相互独立的肽或多肽一旦分离，就可经由相似的肽缩合反应连接起来形成肽或其片段。
例如，克隆得到或合成的肽区段的酶学连接使得相对较短的肽片段被连接起来产生较大的肽片段、多肽或全蛋白结构域(Abrahmsen Let al.，Biochemistry，30：4151，1991)。或者，可利用对合成肽进行天然化学连接来由较短的肽片段合成性地构建大的肽或多肽。这种方法由两步化学反应组成(Dawson et al.Science，266：776-779，1994)。第一步是没有保护的合成肽-硫酯与另一种没有保护的含氨基端Cys残基的肽区段之间发生化学选择反应，从而产生硫酯连接的中间产物，它被作为初始共价产物。在不改变反应条件的情况下，该中间产物会经历自发的、快速的分子内反应，从而在连接位点形成天然肽键(Baggiolini M et al.FEBS Lett.307：97-101，1992；Clark-Lewis I et al.，J.Biol.Chem.，269：16075，1994；Clark-Lewis I et al.，Biochemistry，30：3128，1991；RajarathnamK et al.，Biochemistry 33：6623-30，1994)。
或者，没有保护的肽区段可以化学方式连接，其中由于化学连接而在肽区段之间形成的键是非天然(非肽)键(Schnolzer，M et al.Science，256：221，1992)。该技术已被用于合成蛋白结构域的类似物以及大量相对较纯的、具有完全生物活性的蛋白质(de LisleMilton RC et al.，Techniques in Protein Chemistry IV.AcademicPress，New York，pp.257-267，1992)。
3.制备组合物的方法
公开了制备组合物以及制备获得该组合物的中间产物的方法。例如，公开了可产生所需脂质和抗氧化剂的真核微生物以及分离和纯化所需脂质和抗氧化剂的方法。存在多种可用于制备这些组合物的方法，例如合成化学法和标准分子生物学方法。可以理解的是，制备这些和其他所公开组合物的方法被具体公开。
公开了通过用任一核酸转化细胞的方法产生得到的细胞。公开了通过用任一非天然存在的所公开核酸转化细胞的方法产生得到的细胞。
公开了由所公开真核微生物产生得到的任何一种脂质。公开了通过在所公开生物体中表达肽的方法产生得到的任何一种肽。公开了使用组合物的方法
4.将组合物用作研究工具的方法
所公开组合物可以各种方式被用作研究工具，并且用于各种例如脂质和抗氧化剂的生产中。
如本文所述，所公开组合物既可用作微阵列中的试剂，也可用作探测或分析现有微阵列的试剂。所公开组合物可用在用于分离或鉴定单核苷酸多态性的任何已知方法中。所述组合物还可用在用于确定例如本文所公开生物体菌株的任何等位基因分析方法中，尤其是等位基因分析，原因在于它与脂质和抗氧化剂的产生相关。所述组合物还可用在用于与芯片/微阵列相关的任何已知的筛选测定方法中。还可以以任何已知的使用所公开组合物的计算机可读实施方案的方式使用该组合物，例如来研究所公开组合物的亲缘关系或者进行与所公开组合物相关的分子建模分析。
5.基因修饰和基因破坏方法
所公开组合物和方法在可经历这些事件的任何动物中被用于靶向的基因破坏和基因修饰。基因修饰和基因破坏指的是以选择性除去或改变生物体(例如本文所公开真核生物)中的基因或一段染色体为目的的方法、技术和组合物，其方式是通过生物体的复制来延续这种修饰作用。通常，例如如本文所述，使用被设计为可与细胞内所包含的具体染色体或核酸的某一区域同源重组的载体来转化细胞。该同源重组事件可产生含有外源DNA(例如在读码框内)并且具有周围DNA的染色体。这种类型的实验方案使得可以将特异性很高的突变(例如点突变)导入细胞中所包含的基因组中。进行这种类型的同源重组的方法也在本文公开。
V.具体实施方案
公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在包含脂肪酸生产拮抗剂的异样培养基中培养产油微生物。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在包含脂肪酸生产拮抗剂的异样培养基中培养产油微生物，还包括分离所述脂质组合物。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，其中所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率会增大。
还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，其中所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率会增大，其中所述总脂肪酸含量没有变化。
用于本文公开的方法的产油微生物可以是硅藻、微藻、真菌、细菌、原生生物。例如，该产油微生物可具有18S序列，其中所述18S序列与SEQ ID NO：1中列出的序列有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性；或者该产油微生物具有18S序列，其中所述18S序列与SEQ ID NO：1中列出的序列有至少80％的同一性。
所述产油微生物可来自网黏菌门、网黏菌纲、破囊壶菌亚纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科或破囊壶菌属。
还公开了能用于所公开的方法中的脂肪酸生产拮抗剂。所述脂肪酸生产拮抗剂可选自油酸、浅蓝菌素、甲基苯甲酸、姜黄素、环丙烯、没食子酸烷基酯、没食子酸丙酯、芝麻油、花生油、菜籽油、哒嗪酮、氟草敏、二苯胺、稀禾定和辣椒素。
还公开了包含有所公开的组合物的送递装置。该送递装置可包括微囊、微球、纳米球或纳米颗粒、脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米红质体、固体-液体纳米颗粒、亮丙瑞林、凝胶、凝胶胶囊、片剂、洗剂、膏剂、喷雾剂、乳剂或粉剂。
还公开了制备类胡萝卜素组合物的方法，所述方法包括：在包含脂肪酸生产拮抗剂的异样培养基中培养产油微生物。
还公开了制备类胡萝卜素组合物的方法，所述方法包括：在包含脂肪酸生产拮抗剂的异样培养基中培养产油微生物，还包括分离所述类胡萝卜素组合物。
还公开了制备抗氧剂组合物的方法，所述方法包括：在包含脂肪酸生产拮抗剂的异样培养基中培养产油微生物。
还公开了制备抗氧剂组合物的方法，所述方法包括：在包含脂肪酸生产拮抗剂的异样培养基中培养产油微生物，还包括分离所述抗氧剂组合物。
还公开了包含基本微囊的聚集物和负载物质的微囊，各个基本微囊个体均具有主壳，其中所述负载物质含有任一上述组合物，并被主壳包封，并且其中所述聚集物被外壳包封。主壳和/或外壳可包含表面活性剂、明胶、聚磷酸酯、多糖或它们的混合物。主壳和/或外壳还可包含B型明胶、聚磷酸酯、阿拉伯胶、藻酸盐、壳多糖、角叉菜胶、果胶、淀粉、变性淀粉、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白(lactoglobumin)、卵清蛋白、聚山梨酯(polysorbiton)、麦芽糊精、环糊精、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素、乳蛋白质、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白、kosher明胶、non-kosher明胶、Halal明胶或non-Halal明胶或者它们的混合物。所述主壳和/或外壳还可包含复合凝聚层、A型明胶、鱼明胶、Bloom值为约0至约300的明胶、Bloom值为约0至约50的明胶、Bloom值为约51至约300的明胶、Bloom值为约0、约210、约220或约240的明胶、明胶和聚磷酸酯的凝聚层。
所公开微囊的装载物质可包含来自任何所公开的微生物或它们的混合物的油。该装载物质以重量计为微囊的约20％至约90％或50％至约70％。
所公开微囊的外壳其平均直径为约1μm至约2000μm、约20μm至约1000μm、约30μm至约80μm、约40nm至约10μm或约0.1μm至约5μm。
还公开了包含任一上述组合物、送递装置或微囊的营养补充剂。所公开营养补充剂为片剂、凝胶胶囊、胶囊、液体或糖浆形式。
还公开了包含任一上述组合物、送递装置或微囊的食品。该食品可为烘焙食品、面食、肉制品、冷冻乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、调味品、汤粉、点心、坚果制品、植物蛋白制品、硬糖、软糖、家禽产品、经加工的果汁、砂糖、酱油、肉汁、糖浆、营养棒、饮料、饮料干粉、果酱或果冻、婴儿配方或婴儿食品。该食品还可为鱼肉制品、伴侣宠物食品、家畜饲料或水产养殖饲料。
所述食品还可为面包、玉米饼、谷类食品、香肠、鸡肉、冰淇淋、酸奶、牛奶、沙拉调味料、米糠、果汁、饮料干粉、面包卷、饼干、薄脆饼干、水果馅饼或蛋糕。
还公开了将组合物送递给受试者的方法，包括给予该受试者任一上述组合物、送递装置、微囊或食品。该受试者可为哺乳动物。该受试者还可以为人。
还公开了任一上述微囊用于制备将负载物质送递给受试者的药物的用途。
还公开了降低受试者体内胆固醇水平、甘油三酯水平或它们的组合的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。
还公开了补充受试者体内必需微量元素的方法，所述方法包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤，其中所述组合物、送递装置、微囊、补充剂和食品含有必需微量元素。
还公开了提高受试者体内胰岛素敏感度的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。
还公开了减轻受试者体内高血糖症的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。
还公开了减轻受试者体内高胆固醇血症的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。    
还公开了减少受试者体内脂肪的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。
还公开了促进受试者减肥的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。
还公开了治疗或预防受试者体内糖尿病的方法，包括给予该受试者有效量的任一上述组合物、送递装置、微囊、营养补充剂或食品的步骤。
还公开了一种药物制剂，所述药物制剂包含任一上述组合物、送递装置或微囊以及药物载体。
VI.实施例
给出以下的实施例旨在为本领域的普通技术人员提供关于如何制备和评估本申请所要求保护的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整公开和描述，纯粹是为了举例说明，而无意于对公开内容作限制。已努力确保数字(如量、温度等)方面的准确性，但是还是应该考虑到会存在某些误差和偏差。除非另外指明，否则份数为重量份数，温度为℃或者环境温度，压力为大气压或接近大气压。
1.实施例1：ONC-T18破囊壶菌属种菌株的分离
采用了经典的细菌学菌株纯化技术，目的在于从在AdvocateHarbor，Nova Scotia收集到的红树树叶分离ONC-T18。在营养培养基琼脂(0.2μm过滤的1L海水中含有5g L-1葡萄糖、2g L-1蛋白胨、2g L-1酵母提取物和15.0g L-1琼脂)中于25℃下连续培养ONC-T18，直至获得足够的纯度。随后，配制含有15％人工海水(营养型海水)、补充有氮源和碳源(分别为60g L-1葡萄糖和10g L-1酵母提取物)的液体培养基。用ONC-T18接种该培养基(250ml烧瓶中装有50ml)，然后在25℃下培养，并通过于120rpm振荡来充气。
通过离心自培养基分离ONC-T18，然后洗涤细胞生物菌体，再次离心并彻底冷冻干燥。然后对细胞生物菌体进行称重，目的在于通过所记录的每升培养基的生物量来确定培养效率。使用Bligh&Dyer方法从生物菌体中提取脂质组分，随后分离脂肪酸甲酯。通过以下步骤进行酯交换：将冷冻干燥的细胞物质转移至10ml带有螺旋盖的试管中，并将10％甲醇HCl和二氯甲烷加入该试管中，使该混合物在90℃下反应2小时。然后通过加入己烷：氯仿来提取脂肪酸甲酯，并通过气相色谱(FID)来测量甲酯组分，目的是确定各种微生物和共生群落(ONC-T18)的脂肪酸分配比例。通过比较在酯交换过程的开始(C23:0)和结束(C19:0)时以确定量加入的两个内标(C19:0和C23:0)的GC峰面积，测定了各种脂肪酸甲酯(C14:0至C22:6)的浓度。使用这种方法计算得到的总脂肪酸量/克干细胞生物量以及每种脂肪酸的百分含量示出于图2中。
通过对这些结果的分析并结合示出于图1中的那些结果，可发现ONC-T18表现出产生增加量的DHA以及显著量的EPA和DPA的能力。ONC-T18在该非最佳发酵培养基中产生了大约25％DHA、8.0％(n-6)DPA和1.0％EPA。随后基于以下经济所需特征的组合来选择ONC-T18：(1)能最大程度地进行异养生长(与对照菌株相比较)；(2)含有高百分比的ω-3高度不饱和脂肪酸；(3)能在便宜的营养物质中生长；(4)具有耐热性；以及(5)具有广耐盐性。
另外，将产油微生物的多种不同菌株与ONC-T18进行了比较。这其中的每种微生物均被认为包含有破囊壶菌，并产生表3中所示量的油。
表3，[]＝mg/g
Figure G200780036668XD00721
Figure G200780036668XD00731
可以理解的是，如本文所述的ONC-T18一样，公开了用本文所公开产油能力所表示的一系列产油微生物，例如通过DHA占油总产量的百分比或通过DHA总产量。
2.实施例2：使用遗传技术鉴定真核破囊壶菌属种ONC-T18
使用聚合酶链式反应(PCR)技术和靶向于18S核糖体RNA基因的引物(为所有真核生物物种的通用引物)，能产生自ONC-T18分离得到的产油微生物结构基因的PCR产物(如实施例1所述)。然后对PCR产物进行测序，并将该对于真核生物物种的序列命名为SEQ IDNO：1(参见图2)。
使用BLAST(基本的局部比对搜索工具)算法，将SEQ ID NO：1与在基因组数据库GenBank(美国国家生物技术信息中心，美国国家卫生研究所，贝塞斯达，马里兰，美国)中的核酸序列相比较，鉴定发现SEQ ID NO：1与纹状破囊壶菌[AF265338]关系最为密切(97.5％相似性)。
ONC-T18破囊壶菌属种的BLAST结果如下所示。
Sequences producing significant alignments：                       Score E
                                                                   (bits)Value
gi|14279326|gb|AF265338.1|Thraustochytrium striatum small subun... 2126 0.0
gi|50508012|dbj|AB183657.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11072 gen... 2121 0.0
gi|54778780|gb|AY773276.1|Thraustochytriidae sp.FJN-10 18S rib... 1857 0.0
gi|50508019|dbj|AB183664.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11093 gen... 1828 0.0
gi|38524571|dbj|AB126669.1|Thraustochytrium sp.CHN-1 gene for... 1748 0.0
gi|24817740|dbj|AB073308.2|Thraustochytriidae sp.N1-27 gene fo... 1628 0.0
gi|50508018|dbj|AB183663.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11092 gen... 1257 0.0
gi|50508017|dbj|AB183662.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11091 gen... 1257 0.0
gi|50508015|dbj|AB183660.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11084 gen... 1255 0.0
gi|50508011|dbj|AB183656.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11070 gen... 1255 0.0
gi|50508016|dbj|AB183661.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11086 gen... 1249 0.0
gi|15823623|dbj|AB052555.1|Schizochytrium sp.KH105 gene for 18... 1245 0.0
gi|50508013|dbj|AB183658.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11075 gen... 1227 0.0
gi|50508010|dbj|AB183655.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11067 gen... 1213 0.0
gi|54303872|gb|AY758384.1|Schizochytrium sp.FJU-512 18S riboso... 1158 0.0
gi|14279326|gb|AF265338.1|AF265338 Thraustochytrium striatum sma... 1106 0.0
gi|6492308|gb|AF155209.1|AF155209 Labyrinthulid quahog parasite... 765 0.0
gi|16209570|gb|AY052644.1|Labyrinthulid quahog parasite QPX sma... 757 0.0
gi|9755031|gb|AF261664.1|AF261664 Labyrinthulid quahog parasite ... 757 0.0
gi|58176547|gb|AY870336.1|Thraustochytriidae sp. Fng1 18S ribos... 735 0.0
gi|67624914|dbj|AB191425.1|Uncultured eukaryote gene for small... 724 0.0
gi|5509891|dbj|AB022112.1|Thraustochytrium striatum gene for 18... 724 0.0
gi|561884|gb|L34054.1|ULKRRE Ulkenia profunda 18S ribosomal RNA... 702 0.0
gi|50508014|dbj|AB183659.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11077 gen... 686 0.0
gi|50508008|dbj|AB183653.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11060 gen... 686 0.0
gi|50508009|dbj|AB183654.1|Thraustochytriidae sp.MBIC11063 gen... 658 0.0
gi|41391986|emb|AJ535188.1|Pleurosiracf.laevis 18S rRNA gene，... 634 e-178
gi|28316562|gb|AF525670.1|Pleurosira laevis small subunit ribos... 634 e-178
gi|5509889|dbj|AB022110.1|Thraustochytrium aureum gene for 18S... 634 e-178
gi|561883|gb|L34668.1|TUKRRE Thraustochytrium kinnei 18S ribosom... 628 e-176
gi|5509894|dbj|AB022115.1|Ulkenia radiata gene for 18S rRNA      624 e-175
gi|5509893|dbj|AB022114.1|Ulkenia profunda gene for 18S rRNA      624 e-175
gi|5509895|dbj|AB022116.1|Ulkenia visurgensis gene for 18S rRNA   603 e-169
gi|9027563|gb|AF257315.2|Thraustochytriidae sp.BS2 18S ribosom... 589 e-164
gi|5509886|dbj|AB022107.1|Schizochytrium limacinum gene for 18S... 581 e-162
gi|48727879|gb|AY620254.1|Metromonas simplex clone TC-S small s... 571 e-159
gi|33309650|gb|AF411282.1|Unidentified cercozoan 18S ribosomal... 569 e-158
gi|28076844|gb|AF530543.1|Uncultured eukaryote clone AT4-68 18S... 531 e-147
gi|30144485|gb|AY256273.1|Uncultured eukaryote isolate E170 sma... 517 e-143
gi|30144529|gb|AY256317.1|Uncultured eukaryote isolate D107 sma... 507 e-140
gi|14579477|gb|AF363207.1|Eukaryote marine clone ME1-24 18S rib... 505 e-139
gi|39578677|gb|AY426906.1|Uncultured marine eukaryote clone BL0... 504 e-139
gi|39981869|gb|AY381216.1|Uncultured eukaryote clone BL010625.3... 504 e-139
gi|73533408|gb|DQ103811.1|Uncultured marine eukaryote clone M4_... 504 e-139
gi|73533402|gb|DQ103805.1|Uncultured marine eukaryote clone M3_... 504 e-139
gi|73533389|gb|DQ103792.1|Uncultured marine eukaryote clone M2_... 504 e-139
gi|73533382|gb|DQ103785.1|Uncultured marine eukaryote clone M1_... 504 e-139
gi|30144534|gb|AY256322.1|Uncultured eukaryote isolate D179 sma... 504 e-139
gi|24817738|dbj|AB073305.2|Thraustochytriidae sp.H1-14 gene fo... 504 e-139
gi|30268157|emb|AJ519935.1|AST519935 Aplanochytrium stocchinoi p... 504 e-139
gi|58531881|gb|AY882527.1|Uncultured marine eukaryote clone T41... 504 e-139
gi|463127|gb|L27634.1|LADDLRRNA Labyrinthuloides minuta 16S-like... 504 e-139
gi|39981839|gb|AY381186.1|Uncultured eukaryote clone OR000415.1... 502 e-138
gi|39981824|gb|AY381171.1|Uncultured eukaryote clone HE001005.1... 502 e-138
gi|18026024|gb|AY046848.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E019... 502 e-138
gi|18026022|gb|AY046846.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E017... 502 e-138
gi|18026014|gb|AY046838.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E008... 502 e-138
gi|18026008|gb|AY046832.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E002... 502 e- 138
gi|18025980|gb|AY046804.1|Uncultured eukaryote isolate C2_E014... 502 e-138
gi|18025969|gb|AY046793.1|Uncultured eukaryote isolate C2_E002... 502 e-138
gi|18025801|gb|AY046625.1|Uncultured eukaryote isolate C1_E024... 502 e-138
gi|67624915|dbj|AB191426.1|Uncultured eukaryote gene for small... 502 e-138
gi|67624913|dbj|AB191424.1|Uncultured eukaryote gene for small... 502 e-138
gi|67624912|dbj|AB191423.1|Uncultured eukaryote gene for small... 502 e-138
gi|39981861|gb|AY381208.1|Uncultured eukaryote clone BL010320.1... 500 e-138
gi|14349249|dbj|AB052556.1|Thraustochytrium sp.KK17-3 gene for... 500 e-138
gi|20218962|dbj|AB073307.1|Thraustochytriidae sp.M4-103 gene f... 498 e-137
gi|59709960|gb|AY916582.1|Uncultured eukaryote clone Zeuk76 18S... 496 e-136
gi|18025960|gb|AY046784.1|Uncultured eukaryote isolate A3_E043... 496 e-136
gi|18025789|gb|AY046613.1|Uncultured eukaryote isolate C1_E009... 496 e-136
gi|30144548|gb|AY256336.1|Uncultured eukaryote isolate D278 sma... 496 e-136
gi|2138106|gb|U59933.1|U59933 Scybalium jamaicense 18S ribosomal... 496 e-136
gi|53828186|gb|AY744948.1|Phytophthora palmivora isolate 88108... 494 e- 136
gi|60687349|gb|AY821976.1|Uncultured oomycete clone CV1_B2_5 sm... 494 e-136
gi|60687347|gb|AY821974.1|Uncultured Phytophthora-likeoomycete... 494 e-136
gi|60687342|gb|AY821969.1|Uncultured oomycete clone CV1_B1_49 s... 494 e-136
gi|39981870|gb|AY381217.1|Uncultured eukaryote clone BL010625.3... 494 e-136
gi|39981864|gb|AY381211.1|Uncultured eukaryote clone BL010320.2... 494 e-136
gi|39981860|gb|AY381207.1|Uncultured eukaryote clone BL010320.6... 494 e-136
gi|39981844|gb|AY381191.1|Uncultured eukaryote clone BL000921.1... 494 e-136
gi|18026046|gb|AY046870.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E044... 494 e-136
gi|18026039|gb|AY046863.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E035... 494 e-136
gi|18026031|gb|AY046855.1|Uncultured eukaryote isolate C3_E026... 494 e-136
gi|42412527|gb|AY486144.1|Pythium insidiosum 18S ribosomal RNA... 494 e-136
gi|73533425|gb|DQ103828.1|Uncultured marine eukaryote clone M2_... 494 e-136
gi|34576227|gb|AY129064.1|Uncultured marine eukaryote UEPAC45p4... 494 e-136
gi|30144522|gb|AY256310.1|Uncultured eukaryote isolate D85 smal... 494 e-136
gi|30144521|gb|AY256309.1|Uncultured eukaryote isolate D84 smal... 494 e-136
gi|30144518|gb|AY256306.1|Uncultured eukaryote isolate D79 smal... 494 e-136
gi|30144475|gb|AY256263.1|Uncultured eukaryote isolate E106 sma... 494 e-136
gi|30144473|gb|AY256261.1|Uncultured eukaryote isolate E94 smal... 494 e-136
gi|21954246|gb|AY116220.1|Uncultured eukaryote clone ANT12-26 1... 494 e-136
gi|41393027|emb|AJ535176.1|LMI535176 Leptocylindrus minimum 18S... 494 e-136
gi|53693111|gb|AY742743.1|Phytophthora tropicalis isolate 129F-... 494 e-136
gi|53693108|gb|AY742759.1|Pythium vexans isolate Pyv6-2 18S rib... 494 e-136
gi|53693105|gb|AY742756.1|Pythium splendens isolate 117 18S rib... 494 e-136
gi|53693104|gb|AY742755.1|Pythium aphanidermatum 18S ribosomal... 494 e-136
gi|53693097|gb|AY742748.1|Phytophthora capsici isolate 98110 18... 494 e-136
gi|53693096|gb|AY742747.1|Phytophthora tropicalis isolate 23047... 494 e-136
gi|53693094|gb|AY742745.1|Phytophthora palmivora isolate 8829 1... 494 e-136
gi|58531862|gb|AY882508.1|Uncultured marine eukaryote clone T53... 494 e-136
3.实施例3：使用菌株ONC-T18最优化生物菌体的生产
来源于微生物的(或单细胞的)油的生产取决于多个过程变量，例如初始接种物水平/浓度、底物类型、培养基组成、温度和pH。具体而言，使用破囊壶菌菌株、以微生物为基础的高度不饱和脂肪酸的生产表明生物量和脂肪酸生产之间有直接关系。因此，对基本需求的理解或者对参数的最优化是获得最大产量的重要因素。因此，为确定用于产生增加的脂肪酸量的最佳培养基，进行了初始的生物量最优化实验。具体而言，使用新近开发的以正交阵列为基础的Taguchi法(Joseph J and Piganatiells JR，IIE Trans 20：247-254，1998)，目的在于确定使光密度(与生物菌体产生直接相关)增加的最佳培养基组成。在这种情况下，使用Taguchi法来理解对生物量产生有影响的变量的累积效应。氮(酵母提取物、蛋白胨、L-谷氨酸盐)、碳(葡萄糖)和盐浓度(人工海盐)的改变对生物菌体产生有影响。因此，配制了多种液体培养基，所述培养基中含有各种量的酵母提取物、蛋白胨和L-谷氨酸盐(0、4、10、20、50g L-1)和各种量的葡萄糖和盐水溶液(分别为5、40、100、160、200g L-1和0、6、20、30、40g L-1)。依据L25正交阵列以下述方式计算浓度：利用下面的公式，通过使用在48小时和120小时时的信噪比(SNL)辨别所选择的氮培养基：
SNL = - 10 log [ 1 n Σ i = 1 n 1 y i 2 ]
其中，n＝水平数目，y＝产量(来自三个平行实验的平均OD600值)。
这些实验(特别针对考虑因素生物量)的结果(如附图2所示)表明，与光密度(OD600)最相关的ONC-T18的氮利用率为蛋白胨，然后是酵母提取物，随后是L-谷氨酸盐。但是，以最快生长为基础，则提高生物菌体产量的最佳氮源是酵母，然后是蛋白胨，随后是L-谷氨酸盐。另外，通过使用与葡萄糖和盐度(海盐浓度)变化相似的实验，用于生产ONC-T18生物菌体的最佳和最便宜的培养基组成为：培养基中含有2g L-1酵母提取物、8g L-1MSG、60g L-1葡萄糖和6g L-1海盐。
4.实施例4：用菌株ONC-T18最优化二十二碳六烯酸(DHA)的生产
制备由氮源(蛋白胨、酵母提取物、L-谷氨酸盐(MSG)或它们的组合)和碳源(葡萄糖)(溶解在盐水(人工海水)溶液中)组成的培养基，以与实施例3所描述的方式相似的方式确定能最优化生物菌体和DHA产生的最佳培养基组成(示于表4)。在25℃下和以130rpm培养三天后，依据实施例1和此处所述的方法，通过气相色谱测定生物量、每升培养基中的总脂肪酸、脂肪酸的重量百分含量、DHA占总脂肪酸的百分含量以及每升培养基中DHA的量，结果示出于表4中。
在这种情况下，通过使用气相色谱联合质谱和峰值锁定(peaklocking)法，与已知的DHA标准品相比较，测定了DHA。实验组合(experimental package)
Figure G200780036668XD00781
的结果(其中对天然和有机两种形式的氮的变化均进行了研究)表明，对于生物菌体和DHA的最佳生产而言，最佳培养基组成中应含有的酵母提取物和L-谷氨酸盐的量均为4.0至6.0g L-1。另一方面，实验组合
Figure G200780036668XD00782
(研究了加至培养基中的钠组分的变化)表明，使用人工海盐可产出最佳的生物菌体和DHA生产。此外，实验组合(其中培养基中钠的浓度有所不同)表明，在使用5至15％人工海水L-1dH2O时出现DHA和生物菌体的最大生产量。实验组合
Figure G200780036668XD00784
(其中对葡萄糖水平的变化进行了评估)的结果表明，40至少于160g L-1的葡萄糖范围可以得到最佳的生物量和DHA的生产。最后，实验组合
Figure G200780036668XD00785
的结果表明，在葡萄糖或丙三醇用作碳源时，ONC-T18所产生的细胞生物量和DHA浓度数值是等价的。
表4：培养基组成不同的情况下，DHA生产最优化实验的结果。
5.实施例5：产生最大量DHA的ONC-T18的最佳收集时间
在与实施例1中示出的那些培养基组成和条件相同的培养基组成和条件下培养ONC-T18。在此具体情况中，所研究的是为获得最大量DHA、DPA和EPA，ONC-T18应被收集的时间，同时还考虑了获得所述的量必需的时间(参见图3)。
时程实验结果表明，用于在烧瓶和生物反应器中最优化DHA生产的ONC-T18的最佳收集时间分别介于3至5天之间。
6.实施例6：对来源于ONC-T18的脂质进行的分析
使用改进的Bligh&Dyer法提取ONC-T18的总脂质级分。具体而言，将2.0g干细胞生物菌体在4℃下于8ml蒸馏水中再水化过夜。将30ml甲醇∶氯仿(2∶1体积/体积)加入混合物中并以120rpm温和振荡20min，倒出所得到的上清。然后将沉淀重悬于甲醇∶氯仿∶H2O(2∶1∶0.8体积/体积/体积)，重复该过程，收集上清并将其转移至分离漏斗中。然后将5ml氯仿和5ml H2O加入漏斗，从而形成两相液体系统。在分离漏斗内充分混合之后，移出氯仿层，在氮气下浓缩，重悬于氯仿中并于-20℃保存直至分析。将大约1μl的总脂质级分点样于多个色谱棒上，并且使用Iatroscan MK6 TLC/FID仪器来分离和分析。
结果分析表明，异养发酵条件下由ONC-T18产生的脂肪酸组分本质上几乎全部是甘油三酯(至少95％)。除了上述中性脂肪酸组分外，ONC-T18还产生可辨别的类胡萝卜素和磷脂级分。通过随后对磷脂级分的分离(首先经过50％Burn，随后经过75％Burn，紧接着通过以溶剂为基础的分离)，可确定存在大量复杂的磷脂级分。结果显示在样品中存在磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸组分。
7.实施例7：使用菌株ONC-T18生产抗氧化剂
使用前述条件和培养基来培养真核生物ONC-T18。异养发酵后所得到的细胞生物量经由离心、过滤或沉淀来收集。细胞通过在3800×g离心收集，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤。将细胞生物菌体(刚产生得到的或冷冻干燥的)悬浮于10×体积的丙酮中，以200rpm搅拌5分钟，以3800×g离心5分钟，并在氮气条件下蒸发浓缩至干燥。然后将该色素立即重悬于极少量的10％丙酮的己烷溶液中，并在-20℃下保存直至进行HPLC分析。然后在配备有设定在470nm的可变波长检测器的Agilent 1100 HPLC(Agilent，Palo Alto，CA，USA)上鉴定类胡萝卜素提取物。样品通过Symmetry C18保护柱(Waters，Milford，MA，USA)被注射至Bondclone C18反相柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA；颗粒为10μm；内径为3.9×300mm)。注射体积为10μl，所使用的流动相为1.00ml/min 10％丙酮的己烷溶液，进行25分钟。将类胡萝卜素的峰面积与已知的标准品(在此情况下为虾青素、角质素、β-玉米黄素、玉米黄素、海胆酮和β-胡萝卜素；ChromaDex，Santa Ana，CA，USA)相比较，获得类胡萝卜素的定量数据。在不存在已知标准品例如类胡萝卜素、芬尼黄质的情况下，用虾青素的峰面积来计算其浓度。类胡萝卜素特征的进一步确认通过使用配备有引入Micromass ESI-Q-Tof质谱仪(Waters，Milford，MA，USA)的光敏二极管阵列(Waters model 996)的Waters HPLC经由HPLC-MS进行。随后对ONC-T18的HPLC分析表明，在细胞生物菌体中存在几种抗氧化剂化合物(50至1250mg/kg)。这些化合物包括范围分别为1至20mg/kg、0.25至10mg/kg、1至20mg/kg、1至20mg/kg和1至200mg/kg的抗氧化剂类胡萝卜素虾青素、玉米黄素、角质素、海胆酮和β-胡萝卜素，以及几种性质尚未被鉴定的类黄酮多酚化合物(flavenoid polyphenolic compound)。
8.实施例8：与已知微生物的比较
将ONC-T18产生DHA、EPA和DPA的能力与已知微生物的这一能力相比较。当通过培养金黄破囊壶菌ATCC 34304、破囊壶菌属种ATCC20891、破囊壶菌属种ATCC 20892、粉红破囊壶菌ATCC 28210、破囊壶菌属种ATCC 26185、裂殖壶菌属种ATCC 20888、集生裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)ATCC 28209和Schizochytriumlimacinum MYA-1381生产DHA、EPA和DPA时以及当了通过培养本发明的ONC-T18产生DHA、EPA和DPA时，测定了每升培养基中细胞生物菌体的量，每克干细胞生物菌体中脂肪或脂肪酸的百分含量，总脂肪酸中DHA、EPA和DPA的百分含量，以及所获得的DHA、EPA和DPA的量。
表5.对几种代表性破囊壶菌菌株的脂质生产和生物量特征的比较
Figure G200780036668XD00811
如表5所示，很显然的是，在使用本发明的ONC-T18进行培养时，与被测试的其他菌株相比，每升培养基中细胞生物量数值极高。此外，根据本发明，ONC-T18与上述其他菌株相比具有非常高百分含量的脂质。另外，根据本发明，ONC-T18内DHA和DPA的百分含量极高，并且EPA水平被证明与全部被筛选的菌株相当。因此，显然ONC-T18具有在实施例1所述发酵条件下产生大量DHA、EPA和DPA的能力。
9.实施例9：替代碳源的信息
已表明ONC-T18优先在这样一种培养基上生长，其中主要氮源为酵母提取物、谷氨酸钠和/或蛋白胨并且主要碳源为D-葡萄糖。基于ONC-T18的详细代谢分配比例，可注意到甘油(碳源)同样是可行的替代物质。另外，还测试了鱼油加工废液(含有甘油)作为成本低廉的营养替代物质的可行性。对甘油的情况进行了如下实验：使用装于500ml烧瓶中的200ml培养基，在25℃下以120rpm生长3天。两种鱼油加工废物——GWW(甘油水性洗液)和GAW(甘油酸性洗液)的甘油含量占200ml培养基(调节至pH6.5)的40％(体积∶体积)，并将6％甘油加入200ml培养基(重量∶体积)中作为对照。
对这些结果的分析已经证实，将鱼油废液组分(例如副产品甘油)用作ONC-T18的大规模发酵的碳源时，尽管导致微生物细胞内的总脂肪酸量减少，但是其中的DHA含量保持不变(图10)。
表6.替代碳源研究的脂肪酸、生物量和甘油含量
Figure G200780036668XD00821
10.实施例10：细胞干重的扩大培养
可在上限100,000L的多种反应器组成中培养破囊壶菌属种ONC-T18来生产ω-3油。所有的发酵过程均开始于配制占终体积的10-20％的接种物，它可用于形成发酵培养物。初始培养基组成包含有上限6g/L海盐、10g/L氮源和60g/L碳源，并在初始发酵24至36小时后进行补料，分批加入另外75g/L碳源，再持续72至96小时，并且温度范围为18-25℃。例如，使用含有6g/L海盐、2g/L酵母提取物、8g/L L-谷氨酸盐和60g/L D-葡萄糖(36小时后再加入75g/L)的培养基在25℃下培养96小时，ONC-T18能产生40g/L细胞干重(dcw)、占细胞干重(dcw)80％的总脂肪酸(TFA)/脂质级分(介于C14:0至C24:0之间)和30％的(TFA)DHA。同样，能通过成倍增加氮和碳培养基组分的含量，使得生物量也有相似倍数的增加，从而增加细胞干重，而不影响TFA或DHA的含量。例如，使用含有24g/L海盐、8g/L酵母提取物、32g/L L-谷氨酸盐和300g/L D-葡萄糖的培养基在25℃下培养312小时，ONC-T18能产生80g/L的细胞干重(dcw)、占细胞干重(dcw)60％的总脂肪酸(TFA)/脂质组分(介于C14:0至C24:0之间)和38％的(TFA)DHA。
11.实施例11：破囊壶菌属种ONC-T18在各种替代的碳(C)源和氮(N)源中的生长情况以及对细胞干重和脂质的影响
对破囊壶菌属种ONC-T18在各种成本低廉的氮源和碳源中的生长情况进行了研究。具体而言，将50ml ONC-T18在装有6g/L人工海盐的250ml烧瓶中于25℃下培养72小时。碳源和氮源浓度如下所示，与8g/L L-谷氨酸盐联合使用的所列各氮源为2g/L(使用鱼粉的情况例外，该鱼粉用量为4g)。碳源如所示那样变化。全部实验平行进行三次；用于脂肪酸甲酯分析的所有提取均平行进行三次，同时平行进行三次GC注射。
结果表明，当破囊壶菌属种ONC-T18在氮源EMD酵母提取物和鱼粉中生长时，可产生优化的细胞干生物量(即比两种对照培养基要高)。相反，使用玉米浆和EMD蛋白胨时，发现脂质含量比对照低，而DHA含量得到优化。最后，发现碳源右旋糖会增加脂质含量，而果糖和右旋糖会产生比对照更高的DHA含量。
表7：破囊壶菌属种ONC-T18的生长情况
Figure G200780036668XD00831
缩写：
MSG＝L-谷氨酸盐(钠)  YE＝酵母提取物
12.实施例12：用于分离总脂质和各组分的提取技术
对多种分离所选ω-3油的方法进行了测试，目的是确定最佳的分离效率。这些方法包括：标准的Bligh&Dyer法(Bligh&Dyer，Can J.Biochem.Physiol.，37：912-917，1959)；专门用于破囊壶菌种的联合提取和酯交换法(可对样品进行加工用于快速GC FAME分析)(Lewis et al.，J.Microbiol.Methods，43：107-116，2000)；采用同时皂化的提取法(Cartens et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.73：1025-1031，1996)；和使用可选择性分离甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯的硅胶柱的固相提取法(Pinkart et al.，J.Microbiol.Methods，34：9-15，1998；Bateman&Jenkins，J.Agric.Food Chem.，45：132-135，1997)。
具体而言，将在单次发酵操作(参见实施例1)中产生的40g细胞干重破囊壶菌属种ONC-T18生物量分为0.44g的多个组，并用于各种技术。所有技术均平行进行三次，并使用通过FID-GC的脂肪酸甲酯确定法来分析效率，同样平行进行三次，并且每个样品平行进行三次。结果表明，各种方法所获得的总脂肪酸含量有所不同，这种波动最可能是由于溶剂：化合物的饱和状况、生物量破坏情况和其他物理条件(如温度和时间)等考虑因素。
表8：分离总脂质和级分的提取技术
Bligh and Dyer
     DHA     EPA   C14:0  C14:1  C15:0   C16:0  C16:1  C18:1  C20:0  C20:4  C22:5  TFA
                          mg omega-3/克生物量(mg/g)
1    104.39  4.25  36.28  5.82   113.94  77.27  4.92   44.01  1.13   1.67   28.86  430.99
2    136.75  5.45  46.51  7.40   142.96  98.38  6.07   56.49  1.40   2.19   37.92  552.98
3    134.59  4.78  42.51  6.91   128.54  87.01  5.20   51.10  1.30   2.10   35.98  532.91
Av.  125.24  4.83  41.77  6.71   128.48  87.55  5.40   50.53  1.28   1.99   34.25  505.63
直接酯交换
      DHA      EPA    C14:0   C15:0  C16:0    C16:1   C18:0  C18:1   C20:0  C20:4  C22:5   TFA
                               mg omega-3/克生物量(mg/g)
1     104.39   4.24   36.39   5.42   112.94   75.27   5.42   44.01   1.13   1.67   28.86   420.99
2     89.83    4.54   34.81   5.60   103.04   73.43   5.56   42.85   0.98   1.87   25.35   392.88
3     101.64   4.25   37.16   5.98   106.94   75.98   5.35   43.95   1.11   1.78   26.46   410.65
Av.   98.65    4.34   36.12   5.67   107.64   74.89   5.44   43.60   1.07   1.77   26.89   408.17
同时皂化
     DHA      EPA    C14:0   C15:0  C16:0    C16:1    C18:0   C18:1    C20:0  C20:4  C22:5   TFA
                              mg omega3/克生物量(mg/g)
1    204.85   6.75   46.55   8.56   182.26   134.81   8.73    105.04   2.16   3.20   66.68   785.25
2    188.51   6.17   47.64   9.32   208.29   121.25   10.35   95.80    2.53   2.89   61.41   770.14
3    198.25   6.12   47.21   9.65   207.71   136.51   9.589   8.50     2.41   3.10   63.58   782.54
Av.  197.20   6.35   47.13   9.18   199.42   130.86   9.559   9.78     2.37   3.06   63.89   779.31
固相提取
    DHA       EPA    C14:0    C15:0   C16:0    C16:1    C18:0  C18:1    C20:0  C20:4  C22:5   TFA
                                mg omega-3/克生物量(mg/g)
1   169.17    0.42   68.41    10.83   204.43   140.14   8.09   76.97    1.75   3.00   47.05   748.33
2   172.26    0.44   69.59    11.01   207.01   143.74   8.11   78.72    1.74   3.27   47.86   819.04
3   173.65    0.43   69.21    11.31   208.97   146.64   8.16   77.64    1.73   3.64   46.98   785.64
Av. 171.69    0.43   69.07    11.05   206.80   143.51   8.12   77.78    1.74   3.30   47.30   784.34
N.B：以上列出的各数值为使用用于FAME分析的FID-DC的三次平行实验的平均值
13.实施例13：对产生多不饱和脂肪酸的破囊壶菌属种ONC-18的分离和表征：目标为识别菌株的筛选及优化本文的生产。
a)材料和方法
(1)破囊壶菌的分离和培养
2002年7月和8月期间，在Nova Scotia，Prince Edward Island，New Brunswick，Newfoundland和Labrador的加拿大东部沿海地区收集了70个海洋样品，包括：互花米草(Spartina alterniflora)、大叶藻(Zostera marina)和泥沙。将样品置于装有如下物质的20mL小瓶中：10mL 0.2μm过滤的无菌天然海水、300mg L-1青霉素和500mg L-1链霉素。依据Bremer，Marine Mycology-A PracticalApproach，Fungal Diversity Press，Hong Kong，pp 49-61(2000)所述，将悬液用无菌花粉(槭树(Acer sp.))诱集，并在18℃下孵育48小时。然后通过接种环转移花粉粒并在含有抗生素的B1琼脂板(1L天然海水含有1g L-1酵母提取物、1g L-1蛋白胨、10g L-1琼脂)上划线并培养。挑选球形或蛞蝓形细胞的单个无规则透明集落和非典型的酵母或细菌集落，并在B1板上至少传代培养三次以进行纯化。
(2)用于脂肪酸筛选的生物菌体生产
为筛选用于培养和脂肪酸生产的分离株，使用0.2μm过滤的天然海水配制液体培养基，该液体培养基含有2g L-1蛋白胨(BD，Franklin Lakes，NJ，USA)和2g L-1酵母提取物(BD，Franklin Lanes，NJ，USA)，通过高压灭菌对培养基灭菌，然后加入0.2μm滤器过滤除菌的5g L-1葡萄糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)(Bowleset al.，J Biotechnol 70：193-202(1999))。通过接种环从琼脂板上接种体积为30mL的培养物，并在设定为100RPM的振荡器上于18℃下培养4天。然后将5mL该培养物接种于95ml培养基，并再培养4天(稳定期)。通过在4,500RPM下离心收集细胞，用5mL蒸馏水洗涤并再次离心。将细胞沉淀冷冻干燥、称重并在-80℃下保存，然后进行脂肪酸的衍生作用分析。
(3)脂肪酸甲酯(FAME)的制备
可通过从Lewis等人(J Microbiol Meth.43：107-116(2000))改良的直接酯交换方法进行脂肪酸甲酯(FAME)的提取。具体而言，加入20mg冷冻干燥的物质和3ml酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿(10∶1∶1体积/体积))。将细胞涡旋振荡10秒钟，以确保生物菌体均匀分散，并于90℃下放置120分钟。在完成酯交换后取出样品并将其冷却至室温。然后加入水(1ml)并涡旋振荡10秒钟。然后通过如下步骤提取FAME：加入3×2ml己烷∶氯仿(4∶1)的等份样品，涡旋振荡10秒钟，并且静置直至获得澄清的液体分离物。
(4)FAME的气相色谱(GC)分析
使用两个内标(各200μl)进行FAME的GC分析。一个是二十六酸(hexacosaenoic acid)(C23:0)，在酯交换之前加入；另一个是十九酸(C19:0)，在分析之前直接加入。使用Agilent 6890 GC(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)进行分析，该仪器配备有30m×0.32m内径(0.25μm膜厚度)的OMEGAWAX 320熔融石英毛细管柱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和火焰离子化检测器(注射体积为1μl，载气为H2，恒定流速为5.0ml min-1，设定在250℃，在275℃时FID检测器的分流比为50∶1)。通过使用Trace GC-DSQ质谱仪(Thermo Electron，Boston，MA，USA)并与实验标准品的滞留时间相比较，进行FAME特征的确认。
(5)遗传鉴定
使用MoBio UltraClean Microbial DNA Isolation Kit(MoBioLaboratories，Carlsbad，CA，USA)，根据制造商的说明书来提取基因组DNA。用于扩增18S rRNA基因的寡核苷酸引物是从Honda等人(J Eukaryot Microbiol.46：631-641(1999))所用的引物改进而来，即T18S1F 5’-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’和T18S5R 5’-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3’。20μl的PCR反应混合物含有2UBiolaseTM DNA聚合酶(Bioline，Boston，MA，USA)、1×NH4反应缓冲液、3mM MgCl2、1M甜菜碱(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)、200μM混合的PCR核苷酸(Promega，Madison，WI，USA)、各1μM的正向引物和反向引物(MWG Biotech.，High Point，NC，USA)以及100ng基因组DNA模板。在首先于94℃下变性3分钟之后，使用Eppendorf Master Cycle Gradient基因扩增仪(Eppendorf，Westbury，NY，USA)进行PCR扩增，其程序为：94℃45秒、64℃30秒、72℃2分钟，此程序进行30个循环，最后在72℃延长10分钟。使用MoBio UltraClean PCR Clean-up Kit(MoBio Laboratories Inc，Carlsbad，CA，USA)来纯化PCR产物，以便使用引物FA2、FA3、RA1、R(Mo et al.，Mar Biol 140：883-8892002)、T18S1F和T18S5R来进行直接测序(MWG Biotech.，High Point，NC，USA)。使用DSGene(Accelrys，San Diego，CA，USA)来对所得到的序列进行比对，并将其与保存在GenBank(Benson et al.，Nucleic Acids Res33：D34-38(2005))的相似微生物的核苷酸序列相比较。然后使用邻接法(Neighbor-Joining method)(Saito and Nei，Mol Biol Evol4：406-425(1987))生成系统树，并使用1000个自举模拟取样样品(Felsenstein，Evolution 39：783-791(1985))来评估统计学意义。
(6)类胡萝卜素的鉴定
通过以3800×g离心来收集细胞，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤。然后重悬于10×体积的丙酮(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)中，以200RPM搅拌5分钟，以3,800×g离心5分钟，并通过N2蒸发浓缩至干燥。之后重悬于极少量的10％丙酮的己烷溶液中，随后进行HPLC分析。在配备有设定在470nm的可变波长检测器的Agilent1100HPLC(Agilent，Palo Alto，CA，USA)上进行鉴定。样品通过Symmetry C18保护柱(Waters，Milford，MA，USA)被注射至BondcloneC18反相柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA；颗粒为10μm；内径为3.9×300mm)。注射体积为10μl，所使用的流速为1ml/min 10％的丙酮的己烷溶液，进行25分钟。类胡萝卜素特征的进一步确认是通过质谱分析法(Micromass ESI-QTof MS，Waters，Milford，MA，USA)进行。各种类胡萝卜素的定量数据以使用标准品(虾青素、玉米黄素、角质素、海胆酮和β-胡萝卜素)来形成校正曲线并将峰面积与确定浓度相比较为基础。
(7)发酵最优化
通过在250ml Erlenmeyer瓶中进行分批培养(130RPM振荡，于25℃下培养3天)来检测碳、氮和海盐对脂肪酸和DHA生产的影响。使用
Figure G200780036668XD00881
Bplus Twin 5L生物反应器(Sartorius BBI SystemsInc.，Betlehem，PA，USA)进行进一步的培养研究。将100ml的接种物接种于装在生物反应器中的4.9L培养基。使用Glucose(HK)Assay Kit(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)，根据制造商的说明书来测量葡萄糖浓度。在生物反应器中所采用的培养基组分和条件在相关结果部分进行了详细阐述。
b)结果
开发了收集和筛选方法，藉此，使用花粉诱集法和选择性细菌培养基对原生生物盘根足虫目(family Labyrinthulida)成员(尤其是裂殖壶菌属和破囊壶菌属)进行了分离。该研究涵盖分布于整个Atlantic Canada的20个不同的采集地点，并获得了经显微鉴定的68个纯的菌株。根据Lewis et al.，J Microbiol Meth 43：107-116(2000)的方法，产油菌株(其细胞干重的20％以上均为脂肪酸)的筛选基于以下结果：GC PUFA分配比例、生物菌体产率、最高TFA、DHA，其次是EPA浓度(图11)。生物菌体、TFA以及DHA和EPA产率的数值范围分别为100至2300mg L-1、27.1至321.14、5.18至83.63和2.97至21.25mg g-1(图11)。
在液体培养基中生长(68个中的54个)的所有分离株均产生了大量ω-3多不饱和脂肪酸尤其是DHA，该DHA占这些细胞的C20至C22总含量的22至80％(图11)。这肯定了之前的结果，即从寒温带环境中分离出来的破囊壶菌具有DHA占所存在总脂肪酸的最高至53％的脂肪酸分配比例(Bowles et al.，J Biotechnol 70：193-202(1999)和Huang et al.，Mar Biotechnol 5：450-457(2003))。特别值得关注的是ONC-T18，它可产生占其C20至C22含量上限90％的DHA，该DHA大约为总细胞内脂肪酸的35％。已表明该DHA含量与几种用于商业化生产的菌株(例如裂殖壶菌属种ATCC 20888(32％)和S.limacinum MYA-1381/SR21(34％))的DHA含量相同(Barclayet al，J Appl Phycol 6：123-129(1994)和Yokochi et al.，ApplMicrobiol Biotechnol 49：72-76，(2003))。此外，所有分离株均合成占所鉴定总PUFA的2％至20％w/w的二十碳五烯酸(EPA)(图11)。除了所产生的ω-3油之外，全部分离株中约80％能合成ω-6PUFA、花生四烯酸(AA)或二十二碳五烯酸(DPA)，其浓度分别介于1至18％和3至7％w/w之间(图11)。
Huang等人(Mar Biotechnol 5：450-457(2003))认为，对于自日本和斐济的热带沿海水域分离的破囊壶菌而言，可描述的有五种不饱和脂肪酸分配比例，即DHA/DPA(n-6)、DHA/DPA/EPA、DHA/EPA、DHA/DPA/EPA/AA和DHA/DPA/EPA/AA/二十二碳四烯酸(Huang et al.，Mar Biotechnol 5：450-457(2003))。就此破囊壶菌(自AtlanticCanada的温带水域分离得到)收集物而言，可确定有四种PUFA分配比例，其中三种与上述的那些相同，即占收集物7.4％的DHA/DPA/EPA、占收集物13％的DHA/EPA和74％的DHA/DPA/EPA/AA，第四种包括5.6％的DHA/EPA/AA的混合物。
通过对18S rDNA基因进行直接测序，ONC-T18被肯定地鉴定为破囊壶菌目(Thraustochytrid)的一员(GenBank编号：DQ374149)。系统进化分析表明，ONC-T18与纹状破囊壶菌T91-6形成了单独的一组(同一性为97.5％)(图12)(Leander and Porter，Mycologia93：459-464(2001))。而自日本沿海温带水域收集、并被发现是DHA的重要生产者(Carmona et al.，Biosci Biotechnol Biochem67：884-888(2003)和Huang et al.，Mar Biotechnol 5：450-457(2003))的破囊壶菌科菌种MBIC 11093、N1-27和破囊壶菌属种CHN-1分别表现出与ONC-T18具有96、95.5和94.5％的相似性。图12所示破囊壶菌科的全部成员之间遗传多样性相当低，所有菌种之间的相似性介于97.5-91.0％之间。然而，这些菌种遍布全球，并且有三分之二分离自日本、中国和以色列的热带沿海水域，而剩下的分离自美国、欧洲和加拿大的温带水域。
与破囊壶菌属种KH105或S.limacinum SR21的脂肪酸分配比例相似，ONC-T18的脂肪酸分配比例包括高含量的C22PUFA、极低水平的C18和C20FA，并且出现奇数碳链的饱和脂肪酸(15:0和17:0)。此外，对菌株ONC-T18、SR21和KH105的碳和氮利用谱的分析给出了相似的吸收模式。菌株ONC-T18中n-6DPA的含量介于6-10％之间，在考虑到n-6DPA在生物圈中存在有限时，该含量看起来非常高。然而，据Nakahara等人(J Am Oil Chem Soc 73：1421-1426(1996))报道在裂殖壶菌属种SR21(6-10％)中、Ellenbogen等人(Comp BiochemPhysiol 29：805-81(1969))报道在金黄破囊壶菌(9.5％)和粉红破囊壶菌(6.6％)中有着相似水平的n-6 DPA。
对ONC-T18在三种不同的培养装置((1)琼脂板、(2)锥形烧瓶和(3)生物反应器)并在相同培养基上生长的脂肪酸分配比例(图13)的分析表明，从琼脂板到生物反应器，所存在的PUFA的多样性有所减少，并且TFA总体上升高。具体而言，琼脂板展现出PUFA阵列(array)，而在烧瓶和生物反应器中生长的培养物主要为一种或两种中间产物(图13)。金黄破囊壶菌在培养烧瓶中比在搅拌发酵罐中生长更为旺盛(Ilda et al.，J Ferment Bioeng 81：76-78(1996)，与之相比，ONC-T18在生物反应器中生长更佳。该结果与Nakahara等人(Nakahara et al.，J Am Oil Chem Soc 73：1421-1426(1996))的结果一致，他们发现裂殖壶菌属种SR21对机械搅拌表现出高的抗性，从而在生物反应器条件下生长旺盛。
此外，发现在破囊壶菌属种ONC-T18的平板、烧瓶和生物反应器发酵期间产生类胡萝卜素色素，导致褪为浅橙色。这些抗氧化剂的生产在生物反应器发酵中最活跃，并与脂肪酸生产相伴。另外，通过使用HPLC质谱法，确定这些抗氧化剂化合物被鉴定为与各种PUFA缀合的虾青素、玉米黄素、角质素、海胆酮和β-胡萝卜素(图14)。据报道在原生生物的thraustochytid群的各成员中有着相似的结果。具体而言，已表明集生裂殖壶菌可生产海胆酮和角质素(Valadon，Trans Br Mycol Soc 67：1-15(1976))，而Carmona等人(BiosciBiotechnol Biochem 67：884-888(2003))和Huang等人(MarBiotechnol 5：450-457(2003))证实，虾青素、海胆酮、角质素、芬尼黄质(并非ONC-T18中的玉米黄素)和β-胡萝卜素由破囊壶菌属种CHI-1(ONC-T18的近亲菌种)生产(图12)。在该研究中，发现这些类胡萝卜素的浓度的数量级比其在CHN-1中的要低，并且主要化合物为β-胡萝卜素而非虾青素。因此，在破囊壶菌某些种内，PUFA和类胡萝卜素生产可联合起来，从而使得所生产的储存脂肪可免于被氧化。
之前已确定，通过改变培养物的生长条件，可在某种程度上改变主要脂肪酸组分(豆蔻酸、棕榈酸和油酸)的相对量(Ilda et al.，J Ferment Bioeng 81：76-78(1996))。通过这种方式，可操纵最终的脂肪酸组分，由此可在发酵期间以可控方式操纵所需PUFA的物理性质(Sijtsma et al.，Recent Res Devel Microbiol 2：219-232(1998))。在限定ONC-T18中抑制生物量和ω-3PUFA两者产生的因素的尝试中，对营养培养基中的碳、氮和海盐组分(表9)以及培养时间(图15)进行了控制。
表9：破囊壶菌属种ONC-T18的平均生物菌体产量(SD＜15％)、总脂肪酸(TFA)和DHA含量
Figure G200780036668XD00911
在该研究中，由于氮浓度下降，总脂肪酸含量升高，并且在酵母提取物和或谷氨酸单钠浓度为1％(w/v)时获得的总脂肪酸含量最高(约80％)。然而，低氮浓度的培养物同样限制了细胞生长，并由此限制了总脂肪酸的产生。在该实验中，使用8g L-1谷氨酸单钠和2gL-1酵母提取物可获得最佳产量：产生26.1g L-1生物量和4.5g L-1 DHA(表9)。此外，碳升高到最高至100g L-1有效地提高了DHA产量，这与破囊壶菌属种SR21获得的结果(Yokochi et al.，ApplMicrobiol Biotechnol 49：72-76，(2003))一致，而与金黄破囊壶菌所给出的结果相反，在金黄破囊壶菌中，高于10g L-1的葡萄糖浓度是抑制性的(Ilda et al.，J Ferment Bioeng 81：76-78(1996))。在葡萄糖培养基中获得了高于4.0g L-1的最高DHA产量，并且产量比金黄破囊壶菌(Bajpai et al.，J Am Oil Chem Soc 68：509-514(1991))和粉红破囊壶菌(Liand Ward，J Ind Microbiol 13：238-241(1994))的高出五倍，并与裂殖壶菌属种SR21和KH105(Aki et al.，J Am Oil Chem Soc 80：789-794(2003))的相当。最后，ONC-T18展现出典型的广耐盐能力，能耐受的盐度范围为2.0至50.0g L-1，产生的生物菌体产率在25-30％之间变化(表9)。在同一实验中，发现DHA g L-1值在最佳值(4.6g L-1)和最小值(2.5g L-1)之间的变化最高达到了45％(表9)。
由ONC-T18在168h期间于5L生物反应器中产生得到的生物量、TFA和DHA示于图15。所绘出的生长曲线是在相同条件下获得的几条典型曲线。120h之后获得了最大生物菌体产量，此时接近碳源(即葡萄糖)耗尽时间点。这也是生物菌体中的总脂肪酸含量达到最大值(约占生物量的70％)时间点。有意义的是，在仅培养24h之后，DHA含量达到峰值，占总脂肪酸的30％，此后始终维持在20-25％。这些结果与其他产生脂肪酸的破囊壶菌菌株的一致，然而在这些反应的发生速度方面有所不同。
c)讨论
此前，大部分对所识别的Labyrinturomycota菌株的研究都不能以高于生物量的20％的量储存脂肪酸。例如，在分离出能累积最高占生物量50％的脂肪的裂殖壶菌属种SR21之前，金黄破囊壶菌是最好的累积者(20％)(Bajpai et al.，J Am Oil Chem Soc 68：509-514(1991))。另一方面，ONC-T18能累积最高占其生物量80％的脂质。
对于累积油的产油微生物例如ONC-T18，通常应该在具有限制量氮源(通常在24至36h之后耗尽)和足量碳源的培养基中生长。一旦氮被耗尽，产油微生物会继续吸收碳源，但是由于缺少氮(由此阻止了蛋白和核酸的合成)而不再能进行细胞分裂。结果是这些碳源(即糖类如葡萄糖)被转化成为储存的油。在这方面，认为ONC-T18比其他破囊壶菌菌株(例如G13)生长更为缓慢(Bowles et al.，JBiotechnol 70：193-202(1999)和Huang et al.，Mar Biotechnol5：450-457(2003))，然而它以更快速率产生DHA，并表现出合成更高量的总脂肪酸的独特能力。最后，值得注意的是ONC-T18能在极低的盐浓度下生长，并且具有高的生物量和总脂肪酸产率。这使得它可以在大规模生产时减少了盐水对工业发酵设备的腐蚀性。
14.实施例14：化合物(脂肪酸拮抗剂)的补充
a)稀禾定的补充
将含25g/l海盐和1g/l酵母提取物的培养基在120℃下高压灭菌20分钟。将灭菌的葡萄糖以9g/l的浓度添加至该培养基中。将稀禾定(Supleco)以5mg/ml的浓度溶解在二甲基亚砜中，然后将其以100□M的终浓度添加至所述培养基中。加入1ml在相同培养基中培养24小时的ONC-T18预培养物。于振荡器(130rpm)中在室温下培养4天。在培养期结束后，通过以4300rpm离心10分钟收集细胞。然后将所述细胞沉淀物冷冻干燥、称重并从这些细胞提取油。
提取脂质并将其派生成脂肪酸甲酯(FAME)以用于气相色谱分析(GC)。通过以下方式进行酯交换及提取，即使用200mg冷冻干燥的细胞并以C19:0作为内标，添加酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿，10∶1∶1)，混合并于90℃下加热2小时，然后将其在室温下冷却。通过如下步骤提取FAME：添加1ml水和2ml己烷∶氯仿(4∶1)，并且使有机相和水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理，以除去颗粒和残留的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME再悬浮于5ml异辛烷中并用GC-FID进行分析。转化率的计算是：用总和(产生的产物加上添加的底物)除以产生的产物，然后乘以100。结果在图11中显示。这些结果还显示，稀禾定暴露导致了ONC-T18中积累的DHA含量和比例的增加。
b)实施例2：浅蓝菌素的补充
将含6g/l海盐、2g/l酵母提取物和8g/l L-谷氨酸钠盐的培养基在120℃下高压灭菌20分钟。然后将灭菌的D+-葡萄糖以40g/l的浓度添加至该培养基中。将以5mg/ml的浓度溶解在乙醇中的浅蓝菌素加入250ml烧瓶中，使溶剂蒸发1小时然后将培养基添加至所述烧瓶中。浅蓝菌素在该烧瓶中的终浓度为20mg/l。然后将来自平板培养物的ONC-T18添加至该培养基中，并且于振荡器(130rpm)中在室温下培养4天。在培养期结束后，通过以4300rpm离心10分钟收集细胞，用蒸馏水洗涤一次，并再次以4300rpm离心10分钟。然后将所述细胞沉淀物冷冻干燥、称重并从这些细胞中提取油。
提取脂质并将其派生成脂肪酸甲酯(FAME)以用于气相色谱分析(GC)。通过以下方式进行酯交换及提取，即使用200mg冷冻干燥的细胞并以C19:0作为内标，添加酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿，10∶1∶1)，混合并于90℃下加热2小时，然后将其在室温下冷却。通过如下步骤提取FAME：添加1ml水和2ml己烷∶氯仿(4∶1)，并且使有机相和水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理，以除去颗粒和残留的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME再悬浮于5ml异辛烷中并用GC-FID进行分析。转化率的计算是：用总和(产生的产物+添加的底物)除以产生的产物，然后乘以100。结果在图11中显示。这些结果还显示，浅蓝菌素暴露导致了ONC-T18中积累的DHA含量和比例的增加。
c)实施例3：油酸的补充
将含6g/l海盐、2g/l酵母提取物和8g/l L-谷氨酸钠盐的培养基在120℃下高压灭菌20分钟。然后将灭菌的D+-葡萄糖以5g/l的浓度添加至该培养基中。将油酸以2ml/l的终浓度加入该培养基中。将这样的ONC-T18添加至该培养基中，即该ONC-T18来自在Windust培养基(5g/l酵母提取物、5g/l蛋白胨、40g/l D(+)-葡萄糖、1.25ml/l Windust微量元素、1.25ml/l Windust维生素、40g/l海盐；(Windust微量元素：5g/l NaH2PO4.H2O、3.15g/lFeCl3.6H2O、4.36g/l Na2EDTA.2H2O、0.6125mg/l CuSO4.5H2O、0.0597g/l Na2MoO4.2H2O、0.022g/l ZnSO4.7H2O、0.01g/l CoCl2.6H2O、0.18g/l MnCl2.4H2O、13μg/l H2SeO3、2.7mg/l NiSO4.6H2O、1.84mg/l Na3VO4、1.94mg/l K2CrO4)、(Windust维生素：1mg/l维生素B12、1mg/l生物素、0.20g/l盐酸硫胺素))中培养一天的接种物。培养于振荡器(130rpm)中在室温下进行3天。在培养期结束后，通过以4300rpm离心10分钟收集细胞，用蒸馏水洗涤一次，并再次以4300rpm离心10分钟。然后将所述细胞沉淀物冷冻干燥、称重并从这些细胞中提取油。
提取脂质并将其派生成脂肪酸甲酯(FAME)以用于气相色谱分析(GC)。通过以下方式进行酯交换及提取，即使用200mg冷冻干燥的细胞并以C19:0作为内标，添加酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿，10∶1∶1)，混合并于90℃下加热2小时，然后将其在室温下冷却。通过如下步骤提取FAME：添加1ml水和2ml己烷∶氯仿(4∶1)，并且使有机相和水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理，以除去颗粒和残留的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME再悬浮于5ml异辛烷中并用GC-FI D进行分析。转化率的计算是：用总和(产生的产物+添加的底物)除以产生的产物，然后乘以100。结果在图11中显示。这些结果还显示，油酸的补充导致了ONC-T18中积累的DHA含量和比例的增加。
d)实施例4：辣椒素的补充
将含6g/l海盐和10g/l酵母提取物的培养基在120℃下高压灭菌20分钟。然后将灭菌的D(+)-葡萄糖以40g/l的浓度添加至该培养基中。将50ml这种培养基置于250ml的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中。将辣椒素(Sigma)以10g/l的浓度溶解在乙醇中，并以0.1g/l的终浓度添加至培养基中。然后将来自平板培养物的ONC-T18添加至该培养基中，并且于振荡器(130rpm)中在室温下培养4天。在培养期结束后，通过以4300rpm离心10分钟收集细胞，用蒸馏水洗涤一次，并再次以4300rpm离心10分钟。然后将所述细胞沉淀物冷冻干燥、称重并从这些细胞中提取油。
提取脂质并将其派生成脂肪酸甲酯(FAME)以用于气相色谱分析(GC)。通过以下方式进行酯交换及提取，即使用200mg冷冻干燥的细胞并以C19:0作为内标，添加酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿，10∶1∶1)，混合并于90℃下加热2小时，然后将其在室温下冷却。通过如下步骤提取FAME：添加1ml水和2ml己烷∶氯仿(4∶1)，并且使有机相和水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理，以除去颗粒和残留的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME再悬浮于5ml异辛烷中并用GC-FID进行分析。转化率的计算是：用总和(产生的产物+添加的底物)除以产生的产物，然后乘以100。结果在图11中显示。这些结果还显示，辣椒素暴露导致了ONC-T18中C16:0含量的降低和C16:1含量的增加。
e)实施例5：甲基苯甲酸的添加
将含20g/l海盐和10g/l酵母提取物的培养基在120℃下高压灭菌20分钟。然后将灭菌的D(+)-葡萄糖以20g/l的浓度添加至该培养基中。然后将50ml这种培养基置于250ml的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中，并将以20g/l的浓度溶解在乙醇中的甲基苯甲酸(Sigma)以0.2g/l的终浓度添加至培养基中。然后将来自平板培养物的ONC-T18添加至该培养基中，并且于振荡器(130rpm)中在室温下培养4天。在培养期结束后，通过以4300rpm离心10分钟收集细胞，用蒸馏水洗涤一次，并再次离心。然后将所述细胞沉淀物冷冻干燥、称重并从这些细胞中提取油。(实施例19)。
提取脂质并将其派生成脂肪酸甲酯(FAME)以用于气相色谱分析(GC)。通过以下方式进行酯交换及提取，即使用200mg冷冻干燥的细胞并以C19:0作为内标，添加酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿，10∶1∶1)，混合并于90℃加热2小时，然后将其在室温下冷却。通过如下步骤提取FAME：添加1ml水和2ml己烷∶氯仿(4∶1)，并且使有机相和水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理，以除去颗粒和残留的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME再悬浮于5ml异辛烷中并用GC-FID进行分析。转化率的计算是：用总和(产生的产物+添加的底物)除以产生的产物，然后乘以100。结果在图11中显示。这些结果还显示，油酸导致了ONC-T18中EPA和DPA n-3比例的增加，以及DPA(n-6)和DHA(可能为Δ4-去饱和酶抑制剂)比例的降低。
f)实施例6：氟草敏的添加
将含20g/l海盐和1g/l酵母提取物的50ml培养基在120℃下高压灭菌20分钟。然后将灭菌的D(+)-葡萄糖以9g/l的浓度添加至该培养基中。将50ml这种培养基置于250ml的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中，并将以20g/l的浓度溶解在二甲基亚砜中的氟草敏(Supleco)以0.2g/l的终浓度添加至培养基中。加入1ml在相同培养基(25g/l海盐、10g/l酵母提取物和9g/l葡萄糖)中培养24小时的ONC-T18预培养物(接种物)。培养于振荡器(130rpm)中在室温下进行4天。在培养期结束后，通过以4300rpm离心10分钟收集细胞，用蒸馏水洗涤一次，并再次以4300rpm离心10分钟。然后将所述细胞沉淀物冷冻干燥、称重并从这些细胞中提取油。
提取脂质并将其派生成脂肪酸甲酯(FAME)以用于气相色谱分析(GC)。通过以下方式进行酯交换及提取，即使用200mg冷冻干燥的细胞并以C19:0作为内标，添加酯交换反应混合物(甲醇∶氢氯酸∶氯仿，10∶1∶1)，混合并于90℃加热2小时，然后将其在室温下冷却。通过如下步骤提取FAME：添加1ml水和2ml己烷∶氯仿(4∶1)，并且使有机相和水相分离。萃取有机层并用0.5g无水硫酸钠处理，以除去颗粒和残留的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME再悬浮于5ml异辛烷中并用GC-FID进行分析。转化率的计算是：用总和(产生的产物+添加的底物)除以产生的产物，然后乘以100。结果在图11中显示。这些结果还显示，氟草敏暴露导致了ONC-T18中积累的DHA含量和比例的增加。

Claims (60)

1.一种制备脂质组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养产油微生物。
2.根据权利要求1的方法，还包括分离所述脂质组合物。
3.根据权利要求1的方法，其中ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率增大。
4.根据权利要求3的方法，其中总脂肪酸含量没有变化。
5.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为硅藻、微藻、真菌、细菌或原生生物。
6.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物具有18S序列，其中所述18S序列与SEQ ID NO：1中列出的序列有至少94％的同一性。
7.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物具有18S序列，其中所述18S序列与SEQ ID NO：1中列出的序列有至少80％的同一性。
8.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自网黏菌门(phylumLabyrinthulomycota)。
9.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自网黏菌纲(classLabyrinthulomycetes)。
10.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌亚纲(subclass Thraustochytridae)。
11.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌目(order Thraustochytriales)。
12.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌科(family Thraustochytriaceae)。
13.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌属(genus Thraustochytrium)。
14.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为破囊壶菌属种。
15.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为金黄破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)。
16.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为粉红破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)。
17.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)。
18.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自裂殖壶菌属(genus Schizochytrium)。
19.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)。
20.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌科，并具有PTA-6245、20888、20889、20890、20891或20892的ATCC编号。
21.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为ONC-18。
22.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸生产拮抗剂选自油酸、浅蓝菌素、甲基苯甲酸、姜黄素、环丙烯、没食子酸烷基酯、没食子酸丙酯、芝麻油、花生油、菜籽油、哒嗪酮、氟草敏、二苯胺、稀禾定和辣椒素。
23.一种包含权利要求1的脂质组合物的送递装置。
24.权利要求23的送递装置，其中所述送递装置可包括微囊、微球、纳米球或纳米颗粒、脂质体、非离子表面活性剂囊泡(noisome)、纳米红质体、固体-液体纳米颗粒、亮丙瑞林、凝胶、凝胶胶囊、片剂、洗剂、膏剂、喷雾剂、乳剂或粉剂。
25.一种包含基本微囊的聚集物和负载物质的微囊，各个基本微囊个体均具有主壳，其中所述负载物质含有权利要求1的组合物，并被主壳包封，并且其中所述聚集物被外壳包封。
26.权利要求25的微囊，其中所述主壳和/或外壳包含表面活性剂、明胶、聚磷酸酯、多糖或它们的混合物。
27.权利要求25的微囊，其中所述负载物质包含来自破囊壶菌属、裂殖壶菌属或它们的混合物的油。
28.权利要求25的微囊，其中所述外壳具有约1μm至约2000μm的平均直径。
29.权利要求25的微囊，其中所述外壳具有约20μm至约1000μm的平均直径。
30.权利要求25的微囊，其中所述外壳具有约30μm至约80μm的平均直径。
31.权利要求25的微囊，其中所述主壳具有约40nm至约10μm的平均直径。
32.权利要求25的微囊，其中所述主壳具有约0.1μm至约5μm的平均直径。
33.权利要求25的微囊，其中所述装载物质以重量计为微囊的约20％至约90％。
34.权利要求25的微囊，其中所述装载物质以重量计为微囊的约50％至约70％。
35.一种包含权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置或权利要求25-34任一项的微囊的营养补充剂。
36.权利要求35的营养补充剂，其中所述补充剂为片剂、凝胶胶囊、胶囊、液体或糖浆形式。
37.一种包含权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊或权利要求35-36任一项的营养补充剂的食品。
38.权利要求37的食品，其中所述食品为烘焙食品、面食、肉制品、冷冻乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、调味品、汤粉、点心、坚果制品、植物蛋白制品、硬糖、软糖、家禽制品、经加工的果汁、砂糖、酱油、肉汁、糖浆、营养棒、饮料、饮料干粉、果酱或果冻、婴儿配方奶粉或婴儿食品。
39.权利要求37的食品，其中所述食品为鱼肉制品、伴侣宠物食品、家畜饲料或水产养殖饲料。
40.权利要求37的食品，其中所述食品为面包、玉米饼、谷物食品、香肠、鸡肉、冰淇淋、酸奶、乳、沙拉调味料、米糠、果汁、饮料干粉、面包卷、饼干、薄脆饼干、水果馅饼或蛋糕。
41.一种送递组合物至受试者体内的方法，包括给予所述受试者权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品。
42.权利要求41的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
43.权利要求41的方法，其中所述受试者为人。
44.权利要求25-34任一项的微囊用于制备用于将负载物质送递给受试者的药物的用途。
45.一种降低受试者体内胆固醇水平、甘油三酯水平或它们的组合的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
46.一种补充受试者体内必需微量元素的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤，其中所述组合物、送递装置、微囊、添加剂和食品含有必需微量元素。
47.一种提高受试者体内胰岛素敏感度的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
48.一种减轻受试者体内高血糖症的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
49.一种减轻受试者体内高胆固醇血症的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
50.一种减少受试者体内体脂肪的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
51.一种促进受试者减肥的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
52.一种治疗或预防受试者体内糖尿病的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
53.一种药物制剂，所述制剂包含权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置或权利要求25-34任一项的微囊，以及药物载体。
54.一种包含权利要求1的组合物的药物制剂。
55.一种制备类胡萝卜素组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养一种产油微生物。
56.权利要求55的方法，还包括分离所述类胡萝卜素组合物。
57.一种包含权利要求55的组合物的药物制剂。
58.一种制备抗氧剂组合物的方法，所述方法包括：在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养一种产油微生物。
59.权利要求58的方法，还包括分离所述抗氧剂组合物。
60.一种包含权利要求58的组合物的药物制剂。
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593428A (zh) * 2014-12-11 2015-05-06 湖南省土壤肥料研究所 一种甲烷细菌酶活剂
CN105164230A (zh) * 2013-03-08 2015-12-16 索拉兹米公司 产油微生物润滑剂
CN105189740A (zh) * 2013-03-13 2015-12-23 帝斯曼营养品股份公司 工程化微生物
CN105400836A (zh) * 2015-11-24 2016-03-16 武汉武达博硕园科技有限公司 提高不饱和脂肪酸含量的生产方法
CN105476015A (zh) * 2014-10-02 2016-04-13 日健化学株式会社 饮食物
CN106074619A (zh) * 2016-06-23 2016-11-09 武汉华士特工业生物技术开发有限公司 一种富含dha的微生物油脂在2型糖尿病中的应用
CN106687605A (zh) * 2014-10-16 2017-05-17 玛拉可再生能源公司 半连续培养方法
CN107075538A (zh) * 2014-05-22 2017-08-18 合成基因组股份有限公司 用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株
CN107429217A (zh) * 2015-03-26 2017-12-01 玛拉可再生能源公司 使用粗甘油高密度产生生物质和油
CN108366585A (zh) * 2015-12-17 2018-08-03 马斯公司 用于调节脂质代谢物的食品和方法
CN109022284A (zh) * 2018-09-03 2018-12-18 杭州园泰生物科技有限公司 提高球等鞭金藻生物量以及dha产量的方法
CN109072169A (zh) * 2015-07-17 2018-12-21 费尔曼塔格公司 富含油和蛋白质的破囊壶菌生物质、培养方法及用途
US10435725B2 (en) 2005-06-07 2019-10-08 Dsm Nutritional Products Ag Eukaryotic microorganisms for producing lipids and antioxidants
CN112961785A (zh) * 2014-10-16 2021-06-15 玛拉可再生能源公司 重复补料分批培养方法
CN114807256A (zh) * 2022-04-25 2022-07-29 南京师范大学 海藻酸钠和阿魏酸在提高产油微生物的epa产量中的应用和微生物油脂的制备方法
CN115551358A (zh) * 2020-04-03 2022-12-30 玛拉可再生能源公司 含高水平ω-3脂肪酸的微生物油脂

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI350854B (en) 2001-04-16 2011-10-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US9023616B2 (en) 2006-08-01 2015-05-05 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and method of modification thereof
TWI504749B (zh) 2009-03-16 2015-10-21 Dsm Ip Assets Bv 於網黏菌門微生物中生產蛋白質之技術
US8207363B2 (en) * 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
CA2754952C (en) 2009-03-19 2018-11-06 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
WO2010118362A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and compositions for inducing physiological hypertrophy
US8859235B2 (en) * 2009-08-14 2014-10-14 Basf Se Methods in cell cultures, and related inventions, employing certain additives
JP2013505024A (ja) 2009-09-18 2013-02-14 フィコイル バイオテクノロジー インターナショナル，インコーポレイテッド 制御された照明を用いた微小藻類の発酵
EP2519642B1 (en) * 2009-12-28 2017-10-25 DSM IP Assets B.V. Recombinant thraustochytrids that grow on xylose, and compositions, methods of making, and uses thereof
JP5920890B2 (ja) * 2010-01-19 2016-05-18 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． エイコサペンタエン酸生成微生物、脂肪酸組成物、ならびにそれらを作る方法およびそれらの使用
US10479969B2 (en) 2010-10-11 2019-11-19 Phycoil Biotechnology International. Inc. Utilization of wastewater for microalgal cultivation
WO2012092033A1 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 Exxonmobil Research And Engineering Company Enhancement of biomass production by disruption of light energy dissipation pathways
CN103649313B (zh) 2011-03-07 2017-10-24 Dsm营养产品股份公司 工程化破囊壶菌属微生物
CN102839129A (zh) * 2011-06-23 2012-12-26 法国罗凯特兄弟公司 一种裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株
AU2012285803B2 (en) 2011-07-21 2016-08-25 Dsm Ip Assets B.V. Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
US9222112B2 (en) 2011-07-21 2015-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
US20130025860A1 (en) * 2011-07-26 2013-01-31 Halliburton Energy Services, Inc. Composite Particulates and Methods Thereof for High Permeability Formations
US9441149B2 (en) 2011-08-05 2016-09-13 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for monitoring the formation and transport of a treatment fluid using opticoanalytical devices
US9395306B2 (en) 2011-08-05 2016-07-19 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for monitoring fluids within or produced from a subterranean formation during acidizing operations using opticoanalytical devices
US9206386B2 (en) 2011-08-05 2015-12-08 Halliburton Energy Services, Inc. Systems and methods for analyzing microbiological substances
US9297254B2 (en) 2011-08-05 2016-03-29 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for monitoring fluids within or produced from a subterranean formation using opticoanalytical devices
US9222348B2 (en) 2011-08-05 2015-12-29 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for monitoring the formation and transport of an acidizing fluid using opticoanalytical devices
US9182355B2 (en) 2011-08-05 2015-11-10 Halliburton Energy Services, Inc. Systems and methods for monitoring a flow path
US8960294B2 (en) 2011-08-05 2015-02-24 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for monitoring fluids within or produced from a subterranean formation during fracturing operations using opticoanalytical devices
US9261461B2 (en) 2011-08-05 2016-02-16 Halliburton Energy Services, Inc. Systems and methods for monitoring oil/gas separation processes
US9464512B2 (en) 2011-08-05 2016-10-11 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for fluid monitoring in a subterranean formation using one or more integrated computational elements
US9222892B2 (en) 2011-08-05 2015-12-29 Halliburton Energy Services, Inc. Systems and methods for monitoring the quality of a fluid
US8997860B2 (en) 2011-08-05 2015-04-07 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for monitoring the formation and transport of a fracturing fluid using opticoanalytical devices
WO2013048591A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-04 The Regents Of The University Of Colorado Methods and compositions for inducing physiological hypertrophy based on fatty acid levels in fasted versus fed pythons
WO2014074772A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Heliae Development, Llc Mixotrophic, phototrophic, and heterotrophic combination methods and systems
WO2014074770A2 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Heliae Development, Llc Balanced mixotrophy methods
FR3001736B1 (fr) 2013-02-06 2016-03-04 Roquette Freres Biomasse de la microalgue schizochytrium mangrovei et son procede de preparation
EP2826384A1 (de) * 2013-07-16 2015-01-21 Evonik Industries AG Verfahren zur Trocknung von Biomasse
WO2015133305A1 (ja) * 2014-03-03 2015-09-11 花王株式会社 β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法
CA2958457C (en) 2014-10-02 2022-10-25 Evonik Industries Ag Process for producing a pufa-containing biomass which has high cell stability
US11464244B2 (en) 2014-10-02 2022-10-11 Evonik Operations Gmbh Feedstuff of high abrasion resistance and good stability in water, containing PUFAs
CN106793803B (zh) 2014-10-02 2021-03-09 赢创运营有限公司 通过挤压含pufa的生物质来制备含pufa的饲料的方法
EP3200604B1 (de) 2014-10-02 2021-11-03 Evonik Operations GmbH Verfahren zur herstellung eines futtermittels
JP6486072B2 (ja) * 2014-11-04 2019-03-20 株式会社シー・アクト 微生物由来の奇数脂肪酸又は高度不飽和脂肪酸含有するトリグリセリドの製造方法
EP3229604A1 (en) * 2014-12-12 2017-10-18 DSM IP Assets B.V. Feed supplement material for use in aquaculture feed
CN104449800B (zh) * 2014-12-24 2016-01-27 广西大学 一种原油或重质原油强化蒸馏的方法
CA2978770A1 (en) * 2015-03-12 2016-09-15 Synthetic Genomics, Inc. Microorganisms for fatty acid production using elongase and desaturase enzymes
CN107849514A (zh) 2015-07-13 2018-03-27 玛拉可再生能源公司 增强木糖的微藻代谢
AU2016333440A1 (en) * 2015-10-01 2017-06-15 Dsm Ip Assets B.V. Supplement material for use in pet food
US9944960B2 (en) * 2015-11-17 2018-04-17 Premier Research Labs, Lp Process for microbial production of dihydrolipoic acid and extraction of dihydrolipoic acid with edible oils
US10851395B2 (en) 2016-06-10 2020-12-01 MARA Renewables Corporation Method of making lipids with improved cold flow properties
US20190218504A1 (en) * 2016-09-30 2019-07-18 Heliae Development Llc Methods of culturing aurantiochytrium using acetate as an organic carbon source
BR112019012421A2 (pt) 2016-12-22 2020-02-27 MARA Renewables Corporation Cultura, microrganismo eucariótico, métodos para fazer uma composição lipídica e para produzir uma biomassa rica em proteínas
BR112020000421A2 (pt) 2017-07-12 2020-09-01 Bunge Global Innovation Llc processo de extração de óleo a partir de biomassa de algas
US10874131B2 (en) 2017-12-22 2020-12-29 Heliae Development Llc Human and non-human animal use of microbial anaplerotic oil
CN111286519B (zh) * 2018-09-25 2021-10-26 杭州园泰生物科技有限公司 富含dha藻油的生产、提取以及纯化工艺
WO2020081637A1 (en) * 2018-10-17 2020-04-23 Archer Daniels Midland Company Enzyme addition to fermentation broth for the reduction of oligosaccharides introduced through sterilized dextrose solution
JP7495066B2 (ja) * 2018-11-02 2024-06-04 マラ リニューアブルズ コーポレーション 栄養価が改善した藻類オイル
WO2020132285A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Heliae Development, Llc Human and non-human animal use of microbial anaplerotic oil
GB201905593D0 (en) * 2019-04-18 2019-06-05 Bavington Charles Compositions and uses thereof
CN110129400B (zh) * 2019-05-25 2023-09-01 华南理工大学 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法
MY201184A (en) * 2019-09-03 2024-02-08 Malaysian Palm Oil Board A sustained release hydrogel composition
EP4096795A4 (en) * 2020-01-30 2024-02-28 Amyris, Inc. METAL OXIDE-BASED SUNSCREEN FORMULATIONS
CN111548942B (zh) * 2020-07-03 2022-02-25 东北师范大学 一种利用苯甲酸培养微藻的方法
CN114891715B (zh) * 2022-04-20 2023-12-22 南京工业大学 一种提高产油微生物合成油脂能力的方法
CN114854800B (zh) * 2022-04-28 2024-03-29 南京师范大学 提高产油微生物的油脂产量的方法和微生物油脂的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1217029A (zh) * 1996-03-28 1999-05-19 吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司 从用巴氏法灭菌的生物量中制备含有微生物多不饱和脂肪酸的油的方法
CN1416320A (zh) * 2000-01-28 2003-05-07 奥米加技术公司 通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2076018A (en) 1934-08-07 1937-04-06 Baltimore Paper Box Company Package
US4295383A (en) 1977-11-11 1981-10-20 W. R. Grace & Co. Variable speed drive
IL57712A (en) 1979-07-03 1984-02-29 Yissum Res Dev Co Cultivation of halophilic algae of the dunaliella species for the production of fuel-like product
US4445495A (en) 1982-12-22 1984-05-01 Jax Products Inc. Portable stove with gimbal mounting
US4680314A (en) 1985-08-30 1987-07-14 Microbio Resources, Inc. Process for producing a naturally-derived carotene/oil composition by direct extraction from algae
NO157302C (no) 1985-12-19 1988-02-24 Norsk Hydro As Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeoljekonsentrat.
US5070018A (en) 1986-11-07 1991-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of controlling gene expression
US4952511A (en) 1987-06-11 1990-08-28 Martek Corporation Photobioreactor
AU2122688A (en) 1987-07-20 1989-02-13 Maricultura, Incorporated Microorganism production of omega-3 (n-3) lipids
US5104803A (en) 1988-03-03 1992-04-14 Martek Corporation Photobioreactor
US5171680A (en) 1988-06-14 1992-12-15 Chiron Corporation Superoxide dismutase analogs having novel binding properties
US6451567B1 (en) 1988-09-07 2002-09-17 Omegatech, Inc. Fermentation process for producing long chain omega-3 fatty acids with euryhaline microorganisms
US5698244A (en) 1988-09-07 1997-12-16 Omegatech Inc. Method for raising animals having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US7033584B2 (en) 1988-09-07 2006-04-25 Omegatech, Inc. Feeding Thraustochytriales to poultry for increasing omega-3 highly unsaturated fatty acids in eggs
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US6977167B2 (en) 1988-09-07 2005-12-20 Martek Biosciences Corporation Mixtures of omega-3 and omega-6 highly unsaturated fatty acids from euryhaline microorganisms
US5130242A (en) 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US20060094089A1 (en) 1988-09-07 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340594A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Food product having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5985348A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Omegatech, Inc. Milk products having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5232565A (en) 1988-09-27 1993-08-03 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University Capillary electrophoretic system
CA2058930C (en) 1989-06-14 2000-08-15 John C. Cox (Deceased) Media for cell growth and method for making them
US5162051A (en) 1989-11-22 1992-11-10 Martek Corporation Photobioreactor
US5151347A (en) 1989-11-27 1992-09-29 Martek Corporation Closed photobioreactor and method of use
US5407957A (en) 1990-02-13 1995-04-18 Martek Corporation Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates
US5244921A (en) 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
US5164308A (en) 1990-05-21 1992-11-17 Martek Corporation Preparation of labelled triglyceride oils by cultivation of microorganisms
US5658767A (en) 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
PH11992043811B1 (en) 1991-01-24 2002-08-22 Martek Corp Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
EP1787532A3 (en) 1991-01-24 2010-03-31 Martek Biosciences Corporation Microbial oil mixtures and uses thereof
US5168056A (en) 1991-02-08 1992-12-01 Purdue Research Foundation Enhanced production of common aromatic pathway compounds
US5211181A (en) 1991-05-17 1993-05-18 Martek Corporation Apparatus and method for collecting human breath samples
JPH0591886A (ja) * 1991-09-30 1993-04-16 Suntory Ltd ８，１１−エイコサジエン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US5272073A (en) 1992-06-30 1993-12-21 Purdue Research Foundation Biocatalytic synthesis of catechol from glucose
US6410281B1 (en) 1992-07-10 2002-06-25 Omegatech, Inc. Reducing corrosion in a fermentor by providing sodium with a non-chloride sodium salt
US5798236A (en) 1992-09-30 1998-08-25 Genencor International, Inc. Synthesis of quinic acid from glucose
US5776736A (en) 1992-12-21 1998-07-07 Purdue Research Foundation Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis
US5393669A (en) 1993-02-05 1995-02-28 Martek Biosciences Corp. Compositions and methods for protein structural determinations
AU6251694A (en) 1993-02-24 1994-09-14 Martek Biosciences Corporation True alveolar breath collecting apparatus and method
JPH078215A (ja) 1993-04-30 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法
US5487987A (en) 1993-09-16 1996-01-30 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
US5629181A (en) 1993-09-16 1997-05-13 Purdue Research Foundation Synthesis of catechol from biomass-derived carbon sources
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
GB9413758D0 (en) 1994-07-07 1994-08-24 Wellcome Found Heterocyclic compounds
US5583019A (en) 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
EP0823475B1 (en) 1995-04-17 2009-06-17 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Novel microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms
MY121221A (en) 1995-05-30 2006-01-28 Suntory Holdings Ltd Domestic fowl eggs having a high content of highly unsaturated fatty acid, their production process and their use
CA2225313A1 (en) 1995-06-21 1997-01-09 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
GB9514649D0 (en) 1995-07-18 1995-09-13 Zeneca Ltd Extraction of triglycerides from microorganisms
US6168912B1 (en) 1996-01-23 2001-01-02 Martek Biosciences Corporation Method and kit for making a multidimensional combinatorial chemical library
US20030143659A1 (en) 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
US6255505B1 (en) 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
US6027900A (en) 1996-04-12 2000-02-22 Carnegie Institution Of Washington Methods and tools for transformation of eukaryotic algae
AU2956397A (en) 1996-05-15 1997-12-05 Gist-Brocades B.V. Sterol extraction with polar solvent to give low sterol, high triglyceride, microbial oil
US5821266A (en) 1996-07-19 1998-10-13 Michigan State University Antioxidant activity of 3-dehydroshinkimates
DE19629433A1 (de) 1996-07-22 1998-01-29 Hoechst Ag Omega-3-fettsäurenenthaltende Zubereitung aus Mikroorganismen als Prophylaktikum bzw. Therapeutikum gegen parasitäre Erkrankungen beim Tier
CA2261231C (en) 1996-07-23 2012-11-27 Nagase Biochemicals, Ltd. Process using ulkenia sp. to prepare docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
US6140486A (en) 1997-06-04 2000-10-31 Calgene Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
ATE305048T1 (de) 1997-08-01 2005-10-15 Martek Biosciences Corp Dha-enthaltende naehrzusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung
HUP0003079A3 (en) 1997-08-14 2001-02-28 Martek Biosciences Corp Columb A method for increasing incorporation efficiency of omega-3 highly unsaturated fatty acid in poultry meat
US6111066A (en) 1997-09-02 2000-08-29 Martek Biosciences Corporation Peptidic molecules which have been isotopically substituted with 13 C, 15 N and 2 H in the backbone but not in the sidechains
JP3931219B2 (ja) * 1997-09-04 2007-06-13 独立行政法人産業技術総合研究所 高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
US6100385A (en) 1998-05-21 2000-08-08 Texaco Inc. Catalytic method for the preparation of lignin phenol surfactants in organic solvents
US6350890B1 (en) 1998-07-22 2002-02-26 Axiva Gmbh Method for obtaining fatty acids from biomass by combined in/situ extraction, reaction and chromatography using compressed gases
DE19832784A1 (de) 1998-07-22 2000-02-03 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Verfahren zur präparativen Gewinnung von Fettsäuren aus Biomasse durch in situ-Extraktion-Reaktion-Chromatographie mit verdichteten Gasen
JP4283351B2 (ja) * 1998-08-27 2009-06-24 サントリー酒類株式会社 新規な油脂組成物の製造方法および用途
JP2976027B1 (ja) 1998-08-27 1999-11-10 工業技術院長 海生菌の分離方法
AU6043399A (en) 1998-09-18 2000-04-10 Board Of Trustees Of Michigan State University Synthesis of vanillin from a carbon source
US6166231A (en) 1998-12-15 2000-12-26 Martek Biosciences Corporation Two phase extraction of oil from biomass
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US6613552B1 (en) 1999-01-29 2003-09-02 Board Of Trustees Operating Michigan State University Biocatalytic synthesis of shikimic acid
US6600077B1 (en) 1999-01-29 2003-07-29 Board Of Trustees Operating Michigan State University Biocatalytic synthesis of quinic acid and conversion to hydroquinone
DE60012934T2 (de) 1999-02-26 2005-08-25 Martek Biosciences Corp. Verfahren zum Abtrennen von einem Docosahexaensäure enthaltenden Triglycerid aus einem Triglyceridgemisch
WO2000051444A1 (fr) 1999-03-04 2000-09-08 Suntory Limited Utilisation d'une matiere contenant de l'acide docosapentaenoique
WO2000054575A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Martek Biosciences Corporation Infant formulas and other food products containing phospholipids
US6750049B1 (en) 1999-03-23 2004-06-15 Board Of Trustees Operating Michigan State University Synthesis of 1,2,3,4-tetrahydroxybenzenes and 1,2,3-trihydroxybenzenes using myo-inositol-1-phosphate synthase and myo-inositol 2-dehydrogenase
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6395778B1 (en) 2000-01-11 2002-05-28 Omegatech, Inc. Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters
WO2001050884A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Baldur Hjaltason Marine lipid composition for feeding aquatic organisms
CZ303446B6 (cs) 2000-01-19 2012-09-19 Martek Biosciences Corporation Zpusob získávání lipidu z mikroorganismu
AU2001227953A1 (en) 2000-01-20 2001-07-31 Omegatech Inc. Methods for raising rabbits
JP2003523765A (ja) 2000-02-24 2003-08-12 ロング，トーマス・ビーチ，ザセカンド 真核微生物を利用したカロテノイド、キサントフィルおよびアポ−カロテノイドの生産法
US6472190B1 (en) 2000-03-16 2002-10-29 Board Of Trustees Operating Michigan State Univerisity Biocatalytic synthesis of galloid organics
US6410282B1 (en) 2000-03-30 2002-06-25 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi
JP3425622B2 (ja) 2000-03-30 2003-07-14 独立行政法人産業技術総合研究所 ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
EP1178103A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Purifying crude pufa oils
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
CA2424570A1 (en) 2000-09-07 2002-03-14 University Of Maryland Biotechnology Institute Use of arachidonic acid for enhanced culturing of fish larvae and broodstock
DK1911837T3 (da) 2000-09-28 2011-08-29 Bioriginal Food & Science Corp FAD5-2 fedtsyredesaturasefamiliemedlem og anvendelser deraf
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
TWI350854B (en) 2001-04-16 2011-10-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
MX281182B (es) 2001-05-14 2010-11-22 Martek Biosciences Boulder Corp Produccion y uso de una fraccion rica en lipidos polares, que contienen acidos grasos altamente insaturados omega-3 y/u omega-6, procedentes de microbios, de semillas de plantas y de organismos marinos geneticamente modificados.
AU2002303744B2 (en) 2001-05-14 2008-04-17 Dsm Ip Assets B.V. A method of improving the flavor, tenderness and overall consumer acceptability of poultry meat
AU2002323409A1 (en) 2001-08-24 2003-03-10 Martek Biosciences Boulder Corporation Products containing highly unsaturated fatty acids for use by women and their children during stages of preconception, pregnancy and lactation/post-partum
EP1443104B1 (en) 2001-10-16 2006-06-07 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Microorganism and production of carotinoid compounds thereby
JP2003319795A (ja) * 2002-05-07 2003-11-11 National Institute Of Advanced Industrial & Technology スラウストキトリウムによるカロチノイドの製造法
US7192751B2 (en) 2001-12-06 2007-03-20 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of amorpha-4,11-diene
US7172886B2 (en) 2001-12-06 2007-02-06 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
EP2239028A1 (en) 2001-12-12 2010-10-13 Martek Biosciences Corporation Extraction and Winterization of Lipids From Oilseed and Microbial Sources
US6974592B2 (en) 2002-04-11 2005-12-13 Ocean Nutrition Canada Limited Encapsulated agglomeration of microcapsules and method for the preparation thereof
ES2347045T3 (es) * 2002-11-04 2010-10-25 Ocean Nutrition Canada Limited Microcapsulas que tienen multiples cortezas, y metodo para su preparacion.
WO2004046334A2 (en) 2002-11-19 2004-06-03 Board Of Trustees Operating Michigan State University Antioxidant and antimicrobial agents and methods of use thereof
JP4310387B2 (ja) * 2002-11-22 2009-08-05 株式会社マルハニチロ水産 ω−３系高度不飽和脂肪酸含有部分グリセリド組成物及びその製造方法
JP4280158B2 (ja) 2002-12-27 2009-06-17 富士フイルム株式会社 ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用
WO2005068642A2 (en) 2003-10-01 2005-07-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Bacterial synthesis of 1,2,4-butanetriol enantiomers
ES2235642B2 (es) 2003-12-18 2006-03-01 Gat Formulation Gmbh Proceso de multi-microencapsulacion continuo para la mejora de la estabilidad y almacenamiento de ingredientes biologicamente activos.
KR100578282B1 (ko) 2004-02-16 2006-05-11 주식회사 바이오앤진 형질전환 아그로박테리움 튜메파시언스 균주를 이용한코엔자임 큐10의 발효 제조방법
US7183089B2 (en) 2004-05-21 2007-02-27 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
US20080269329A1 (en) * 2004-08-24 2008-10-30 Shigeaki Fujikawa Process for Production of Microbial Fat/Oil Containing Discretional Amount of Diacylglycerol and Said Fat/Oil
EP1810536B1 (en) 2004-09-30 2015-05-06 LG Electronics Inc. A method of supporting operation of sleep mode in a wideband radio access system
JP4796787B2 (ja) * 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類への遺伝子導入法
EP1899453B1 (en) * 2005-06-07 2013-12-18 Ocean Nutrition Canada Limited Eukaryotic microorganisms for producing lipids and antioxidants
AU2005339110A1 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd. Docosahexaenoic acid (DHA) producing thraustochytrid strain - SC1
WO2007074479A1 (en) 2005-12-29 2007-07-05 Abl Biotechnologies Ltd Novel strain of schizochytrium limacinum useful in the production of lipids and extracellular polysaccharides and process thereof
US9023616B2 (en) 2006-08-01 2015-05-05 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and method of modification thereof
WO2008060571A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Aurora Biofuels, Inc. Methods and compositions for production and purification of biofuel from plants and microalgae
US7977076B2 (en) 2006-12-29 2011-07-12 Genifuel Corporation Integrated processes and systems for production of biofuels using algae
WO2008089321A2 (en) 2007-01-17 2008-07-24 Joe Mccall Apparatus and methods for production of biodiesel
JP5649785B2 (ja) 2007-01-26 2015-01-07 国立大学法人 宮崎大学 油脂含有物あるいは油脂中のドコサヘキサエン酸含有率を増加する方法
US8993314B2 (en) 2007-07-28 2015-03-31 Ennesys Sas Algae growth system for oil production
WO2009034124A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Novozymes A/S Omega-3 stabilisation towards oxidation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1217029A (zh) * 1996-03-28 1999-05-19 吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司 从用巴氏法灭菌的生物量中制备含有微生物多不饱和脂肪酸的油的方法
CN1416320A (zh) * 2000-01-28 2003-05-07 奥米加技术公司 通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURJA AM等: "Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: screening of strains and optimization of omega-3 production", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
HAUVERMALE A等: "Fatty acid production in schizochytrium sp.: involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type 1 fatty acid synthase", 《LIPIDS》 *
SHIRASAKA N等: "Effect of cyanocobalamin and p-toluic acid on the fatty acid composition of Schizochytrium limacinum (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycota)", 《MYCOSCIENCE》 *
YAMAOKA Y等: "Growth and carotenoid production of Thraustochytrium sp. CHN-1 cultured under superbright red and blue light-emitting diodes", 《BIOSCI.BIOTECHNOL.BIOCHEM.》 *
付红岩，马莺: "微生物发酵生产EPA和DHA的研究进展", 《粮食加工》 *
刘长海等: "微生物发酵法生产EPA及DHA的研究进展", 《食品科技》 *
陈欣: "真菌发酵生产EPA及DHA影响因素的研究进展", 《微生物学杂志》 *

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10435725B2 (en) 2005-06-07 2019-10-08 Dsm Nutritional Products Ag Eukaryotic microorganisms for producing lipids and antioxidants
CN105164230A (zh) * 2013-03-08 2015-12-16 索拉兹米公司 产油微生物润滑剂
CN105189740A (zh) * 2013-03-13 2015-12-23 帝斯曼营养品股份公司 工程化微生物
CN107075538A (zh) * 2014-05-22 2017-08-18 合成基因组股份有限公司 用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株
CN113278529B (zh) * 2014-05-22 2023-10-10 合成基因组股份有限公司 用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株
CN113278529A (zh) * 2014-05-22 2021-08-20 合成基因组股份有限公司 用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株
CN105476015A (zh) * 2014-10-02 2016-04-13 日健化学株式会社 饮食物
CN106687605A (zh) * 2014-10-16 2017-05-17 玛拉可再生能源公司 半连续培养方法
CN106687605B (zh) * 2014-10-16 2022-02-01 玛拉可再生能源公司 半连续培养方法
US11827918B2 (en) 2014-10-16 2023-11-28 MARA Renewables Corporation Repeated fed-batch culture methods
CN112961785A (zh) * 2014-10-16 2021-06-15 玛拉可再生能源公司 重复补料分批培养方法
US11345943B2 (en) 2014-10-16 2022-05-31 MARA Renewables Corporation Semi-continuous culture methods
CN104593428A (zh) * 2014-12-11 2015-05-06 湖南省土壤肥料研究所 一种甲烷细菌酶活剂
CN107429217A (zh) * 2015-03-26 2017-12-01 玛拉可再生能源公司 使用粗甘油高密度产生生物质和油
CN109072169B (zh) * 2015-07-17 2024-04-05 费尔曼塔格公司 富含油和蛋白质的破囊壶菌生物质、培养方法及用途
CN109072169A (zh) * 2015-07-17 2018-12-21 费尔曼塔格公司 富含油和蛋白质的破囊壶菌生物质、培养方法及用途
CN105400836A (zh) * 2015-11-24 2016-03-16 武汉武达博硕园科技有限公司 提高不饱和脂肪酸含量的生产方法
CN108366585B (zh) * 2015-12-17 2021-11-19 马斯公司 用于调节脂质代谢物的食品和方法
CN108366585A (zh) * 2015-12-17 2018-08-03 马斯公司 用于调节脂质代谢物的食品和方法
CN106074619A (zh) * 2016-06-23 2016-11-09 武汉华士特工业生物技术开发有限公司 一种富含dha的微生物油脂在2型糖尿病中的应用
CN109022284B (zh) * 2018-09-03 2021-05-21 杭州园泰生物科技有限公司 提高球等鞭金藻生物量以及dha产量的方法
CN109022284A (zh) * 2018-09-03 2018-12-18 杭州园泰生物科技有限公司 提高球等鞭金藻生物量以及dha产量的方法
CN115551358A (zh) * 2020-04-03 2022-12-30 玛拉可再生能源公司 含高水平ω-3脂肪酸的微生物油脂
CN114807256A (zh) * 2022-04-25 2022-07-29 南京师范大学 海藻酸钠和阿魏酸在提高产油微生物的epa产量中的应用和微生物油脂的制备方法
CN114807256B (zh) * 2022-04-25 2024-04-30 南京师范大学 海藻酸钠和阿魏酸在提高产油微生物的epa产量中的应用和微生物油脂的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008129358A2 (en) 2008-10-30
ES2572833T3 (es) 2016-06-02
JP2010511377A (ja) 2010-04-15
JP5531324B2 (ja) 2014-06-25
WO2008129358A3 (en) 2011-03-03
AU2007351658B2 (en) 2013-05-30
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