JP2010511377A - 油生産微生物およびその改変方法 - Google Patents

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Abstract

精製かつ使用し得る不飽和脂肪酸を産生できる油産生微生物に関連する組成物および方法が開示される。また、油産生微生物内に存在すると考えられる古典的な脂肪酸産生経路の特定成分を阻害するかまたは刺激する脂肪酸産生アンタゴニストを用いる全脂質組成物内の該脂肪酸濃度を改変する方法が開示される。

Description

本出願は２００６年８月１日付け米国特許仮出願第６０／８２１，０８４号の利益および優先権を主張するものであり、両者の全体を引用により本明細書に含める。
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の（ｎ−３）高度不飽和脂肪酸が心臓循環器疾患、慢性炎症および脳疾患に積極的な効果があるという膨大な科学的実証がある。一方、エイコサペンタエン酸、（ｎ−３）脂肪酸はまた、プロスタグランジン、ロイコトリエン等のエイコサノイドステロイドにおける中間代謝物として注目されている。
現在、これらの高度不飽和脂肪酸の主な源は魚であり、ＤＨＡおよびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が様々な青魚（イワシ、マグロ等）内にそれぞれ約２０％および１０％の量で含まれている。このような脂肪酸プロファイルは、各魚種の内において最適性能のための最適比率の自然選択により生じると考えられる。しかし、これらの脂質の唯一の資源として魚油を使用することを意図する場合、悪い風味、利用可能性における制御不能な変動、天然の魚の油含有量の変動性の他、有害な環境汚染物質の蓄積の問題等のいくつかの不利益が存在する。さらに、これらの資源から高度に精製された（ｎ−３）または（ｎ−６）油を得ようとする場合、選択的に分離精製することが非常に困難である。
［発明の要約］
培養によりある量のオメガ３（ｎ−３）および／またはオメガ６（ｎ−６）油等の不飽和脂肪酸、例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡ等を生産するスラウストキトリアレス（Thraustochytriales）目およびスラウストキトリアセアエ（Thraustochytriaceae）科の真核生物に関連する組成物および方法であって、それらの生産手段によりこれらの組成物全てがそれ自体使用される以上に、精製および利用が可能である組成物および方法が開示される。
培養によりある量のオメガ３（ｎ−３）および／またはオメガ６（ｎ−６）油等の不飽和脂肪酸、例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡ等を生産する油産生微生物に関連する組成物および方法であって、それらの生産手段によりこれらの組成物全てがそれ自体使用される以上に、精製および利用が可能である組成物および方法が開示される。
また、油産生微生物内に存在すると考えられる古典的な脂肪酸産生経路の特定成分を阻害または刺激する脂肪酸産生アンタゴニストを用いて、全脂質組成物内の脂肪酸濃度を改変する方法を開示する。
本明細書に採用されその一部を構成する付属の図面はいくつかの実施形態を説明すると同時に、開示の組成物および方法を例示するものである。
図１は、開示された油産生微生物についてポリ不飽和脂肪酸産生(ＰＵＦＡ)のための提案された代謝経路を示す。
図２は、３つの異なるタイプの培養：アガープレート(１.５％アガー、２５℃、２７日)、フラスコ(２５０ ml フラスコ中に５０ ml、１２０ＲＰＭ、２５℃、３日)およびバイオリアクター（５Ｌ）(４lpm 空気、ｐＯ2 ９０％、２５℃、３日)にて、酵母抽出物(２gＬ−１)、Ｌ−グルタメート(８gＬ−１)、海塩（６gＬ−１)およびグルコース(６０gＬ−１)を含有する培地で生育したＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸プロファイルを示す。
図３は、グルコース（６０gＬ−１）、酵母抽出物（２gＬ−１）、グルタミン酸（８gＬ−１)および塩(６gＬ−１)(４ lpm 空気、ｐＯ2 ９０％、２５℃、ｐＨ７−９)で構成した培地を含むバイオリアクター（５Ｌ）内で１６８時間維持したスラウストキトリウム種(Thraustchytrium sp) ＯＮＣ−Ｔ１８の典型的なバイオマス、全脂肪酸(ＴＦＡ)、ＤＨＡ産生およびグルコース利用を示す。
図４は、日本を起源とする数種のスラウストキトリウム科(Thraustchytrid)(Thraustchytrium CHN-1、 Thraustchytriidae MBIC 11093 および Thraustchytriidae N1-27) および スラウストキトリウム・ストリアタム(T. striatum)株Ｔ９１−６に対する１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を基準としたスラウストキトリウム(Thraustchytrium)種 ＯＮＣ−Ｔ１８の進化的関係を示す。
図５は、様々な窒素源、例えば様々な等級のＬ−グルタメート、コーンスティープリカー(corn steep liquor)等と共に酵母抽出物にて生育されたＯＮＣ−Ｔ１８を示す。Ｌ−グルタメート単独では、バイオマス、全脂肪酸(ＴＦＡ)またはＤＨＡ産生を促進しなかった。しかしながら、Ｌ−グルタメートの存在下において、酵母抽出物およびコーンスティープリカーを含む様々なＮ源は、Ｌ−グルタメートを含まないものよりも良好な結果を与えた(実施例１１、表７と関連する)。
図６は、高いバイオマス、ＴＦＡおよびＤＨＡを提供する様々な炭素源、および単糖類、例えばグルコース等、スクロースおよび糖液にて生育させたＯＮＣ−Ｔ１８を示す(表６＆７と関連する)。
図７は、水溶性抗酸化物質、植物ホルモンまたは酢酸ナトリウム(単体炭素)は、標準的な培地単独の結果と比較して、バイオマス、ＴＦＡまたはＤＨＡを促進しなかったということを示す。
図８は、１８℃および２５℃でのＯＮＣ−Ｔ１８の培養間の差違を示す。最も低い温度(即ち１８℃)では、有意に高いグルコースの取込み、半量のＴＦＡレベルおよびコントロール培養物のものと同等のバイオマスおよびＤＨＡレベルをもたらした。従って、２５℃での培養は、１８℃よりもより有効であることが見出された。
図９は、純粋なオレイン酸を用いて生育されたＯＮＣ−Ｔ１８を示す。ＯＮＣ−Ｔ１８(純粋なオレイン酸を用いて生育された)の脂肪酸プロファイルは、大部分のオレイン酸がＤＨＡに変換され、グルコース生育ＯＮＣ−Ｔ１８と比較してＥＰＡレベルが上昇したことを示した。
図１０は、ＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸プロファイルに対するトルイル酸の効果を示す。ＯＮＣ−Ｔ１８(０．２ g/L トルイル酸を用いて生育された)の脂肪酸プロファイルは、該化合物がそのプロファイルにおけるＥＰＡの割合を増加させることが出来るが、一方でＤＰＡ（ｎ６)の割合を低下させることが出来ることを示した。値は、０.２ｇ／Ｌ のトルイル酸とコントロールとの比べた４回の実験の平均である。
図１１は、例示した脂肪酸産生アンタゴニストを用いてＯＮＣ−Ｔ１８を培養した、ガスクロマトグラフィーの結果を示す。
図１２は、ＯＮＣ−Ｔ１８脂肪酸プロファイルに対するノルフルラゾンの添加効果を示す。図１２は、添加したノルフルラゾンの量と共に増加したＰＵＦＡの割合が増加したことを示した。
図１３は、ノルフルラゾンに暴露した場合、カロテノイド含量がＤＨＡ増加と平行して低下したことを示す。
図１４は、オレイン酸をＯＮＣ−Ｔ１８の培地に加えると、特に増殖と関連した場合に(高いＮおよび低いＮの存在によって示された)、より高いＤＨＡ含量が観察されることを示した。
図１５は、ＯＮＣ−Ｔ１８の培地にセルレニンを加えた場合に、全脂肪酸含量に対する各脂肪酸の％における変化は観察されなかったが、バイオマス(mg/g)に関連した全脂肪酸濃度に着眼した場合に、Ｃ１６：０およびＤＨＡの両方における増加が認められたことを示す。
［詳細な説明］
本発明の化合物、組成物、製品、装置および／または方法を開示し記述する前に、特に断りのない限りそれらは特定の合成法または特定の生物工学法に制限されず、また特に断りのない限り特定の試薬に限定されず、その結果当然変化し得ることを理解する必要がある。本発明で用いた用語は特定の実施形態を記述する目的のためのみであり、本発明を制限することを意図するものではないことも理解すべきである。
当業者は、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態に等価な多くのものを認識するか、または通常の実験を用いて確認することができる。この様な等価なものは特許請求の範囲に包含されることを意図している。
Ａ．定義
本明細書および付属のクレームに用いた用語は、特定の実施態様のみを説明する目的のためのものであり、限定すること意図するものではない。
明細書と付属のクレームに用いられる単数形「ある」、「１つの」および「その」には、文脈上特に断らない限り、複数の対象も含む。従って、例えば「医薬担体」とはこの様な担体の複数の混合物等も含む。
本発明では、範囲は「約」特定の数値から、および／または「約」他の特定の数値までとして表される。かかる範囲が示される場合、他の実施形態にはある特定の数値から、および／または別のある特定の数値までが含まれる。同様に、数値が「約」を用いて近似値として表される場合、その特定の数値は他の実施形態も形成すると理解されると思われる。さらに、各範囲の終点は他の終点との関連する、および他の終点とは独立であるという双方の意味があることも理解されると思われる。また、本明細書に開示された数値はいくつもあり、本明細書では、各数値はその数値そのものに加えて「約」その特定の数値として開示される。例えば、数値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。ある数値が「その数値より小さい、またはその数値と等しい」、「その数値より大きい、またはその数値と等しい」として開示されている場合、当業者が理解し得る様にそれらの数値の間の可能な範囲も開示されていることも理解される。例えば、数値「１０」が開示されている場合、「１０より小さい、または１０に等しい」の他、「１０より大きいまたは１０に等しい」も開示されている。本出願を通じて、データはいくつかの異なったフォーマットで提供され、このデータは終点および出発点を表し、データポイントの任意の組み合わせの範囲であることも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示されている場合、１０および１５より大きいまたは等しい、より小さいまたは等しい、および等しいの他、１０と１５との間も開示されていると考えられる。また、２つの特定の単位の間の各単位も開示されると理解される。例えば、１０および１５が開示されている場合、１１、１２、１３および１４も開示されている。
「減少」または減少の他の形は、ある事象または特性の低下を意味する。これは典型的には、ある標準または期待値との関連である、言い換えれば相対的であるが、その標準または相対値を必ずしも参照する必要がないことが理解される。例えば、「全脂肪組成物内での脂肪酸濃度の減少」とは、標準またはコントロールと比較して油産生微生物内で全脂肪組成物内の脂肪酸濃度の量の低下を意味する。特に断らない限り、ある化合物または組成物または条件を他の化合物または組成物または条件に対して減少することができる。
「増加」または増加の他の形とは、ある事象または特性の増加を意味する。これは典型的には、ある標準または期待値との関連である、言い換えれば相対的であるが、その標準または相対値を必ずしも参照する必要がないことが理解される。例えば、「全脂肪組成物内での脂肪酸濃度の増加」とは標準または対照と比較して油産生微生物内で全脂肪組成物内の脂肪酸濃度の量の増加を意味する。特に断らない限り、ある化合物または組成物または状態を他の化合物または組成物または状態に対して増加することができる。
「阻害」または阻害の他の形は、特定の特性を妨害するかまたは制限することを意味する。これは典型的には、ある標準または期待値と関連する、言い換えれば相対的であるが、その標準または相対値を必ずしも参照する必要はないことが理解される。例えば、「不飽和化酵素を阻害する」とは、標準または対照と比較して生じる該酵素の不飽和化酵素の活性の量において、活性の妨害、制限または停止の誘発を意味する。特に断らない限り、ある化合物または組成物または状態を他の化合物または組成物または状態に対して阻害することができる。
「阻止」または防止の他の形は、特定の特性または状態を停止することを意味する。これは典型的には、例えば減少または阻害よりも絶対的であるので、阻止はコントロールとの比較を必要としない。本明細書で用いられる様に、あるものを減少し得るが阻害または阻止し得ないが、減少するあるものを阻害または阻止することもできる。減少、阻害または阻止が使用される場合、特に断らない限り、他の２つの用語の使用も明白に開示されることが理解される。従って、不飽和化酵素の不飽和化酵素活性の阻害が開示されている場合、不飽和化酵素の不飽和化酵素活性の減少または阻止も開示されている。
用語「治療上有効」とは、使用される組成物の量が疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するに十分な量であることを意味する。この様な改善は減少または変化のみを必要とし、必ずしも除去を必要としない。
用語「担体」とは、ある化合物または組成物と組み合わせる場合に、その意図する使用または目的のために化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性または任意の他の特性を補助または促進する、ある化合物、組成物、物質または構造を意味する。例えば、ある担体を活性成分のどの様な劣化も最小にし、被検体に対するどの様な副作用も最小にする様に選ぶことができる。
本発明の記述とクレームとを通じて、用語「含む」および「含んでいる」等のその用語の変形は「を含むがそれに限定されない」を意味し、例えばその他の添加物、成分、整数または工程を除外することを意図するものではない。
本発明で用いる用語「細胞」は個々の微生物細胞、個々の油産生微生物細胞またはこの様な細胞由来の培養物も指す。「培養物」は同じまたは異なったタイプの単離細胞を含む組成物を指す。
用語「代謝物」は、ある化合物を生物環境、例えば患者に導入される場合に産生される活性誘導体を指す。
医薬品および栄養剤組成物に関連して用いられた場合、用語「安定」とは定められた期間中、特定の貯蔵条件下で活性成分のある量以下、通常１０％の活性成分の損失を意味すると当該技術分野で一般的に理解されている。ある組成物が安定と考えられるに必要な時間は各製品の使用に相対的なものであり、その製品を製造し、品質管理または検査のために保存し、その製品が実際に使用される前に再度貯蔵される卸売業者または消費者に直接出荷する商業上の実用性により決定される。数ヶ月の安全係数を含めて、医薬品に対する最低製品寿命は通常１年であり、好ましくは１８ヶ月以上である。本明細書に用いる用語「安定」とは、これらの市場の現実と、冷凍条件２℃、８℃等の容易に達成し得る環境条件における製品の貯蔵および輸送能力とを参考にする。
明細書およびそれを総括する特許請求の範囲における特定の要素または組成物または商品中の成分の重量部とは、重量部で表される組成物または商品中の要素または成分と、任意の他の要素または成分との重量関係を表す。従って、２重量部の成分Ｘと５重量部の成分Ｙとを含む化合物において、ＸとＹとは重量比２：５で存在し、更なる成分が化合物中に含まれるかどうかに係わらずこの様な比率で存在する。
特に断らない限り、ある成分の重量パーセントはその化合物が含まれる調合物または組成物の全重量を基準としている。
「単離する」および「単離」等の任意の形は、あるものが取扱い得る、またはさらに精製され得る形にある状態を指す。「単離された」および単離された形は、あるものが前の状態とは異なった現在の状態にあることを示す。例えば、有機体から取り出し、合成または組み替え的に製造された場合、リボソームＲＮＡ分子を「単離」し得る。多くの場合、あるものの「単離」とは他のものとの関連である。本明細書で議論する油産生微生物を、本明細書で記載した様に、例えば油産生微生物を培養することにより、該油産生微生物が相当量の（検出可能な）他の微生物がなく生存できる様に、単離され得る。特に断らない限り、任意の開示された組成物を本明細書で開示する様に単離し得る。さらに、油産生微生物から産生された脂質は、油産生微生物の全てまたは一部から単離され得る。
「精製」および「精製する」等の他の形は、物質または化合物または組成物が、その以前の状態より均一性が大きい状態であることを指す。特に断らない限り、本明細書で示す様にあるものは少なくとも純度１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％であり得る。例えば、ある組成物Ａが純度９０％である場合、これは組成物の９０％がＡであり、組成物の１０％が分子、化合物または他の物質等の１つ以上のものであることを意味する。例えば、開示された真核微生物が例えば３５％のＤＨＡを生産する場合、最終脂質組成がＤＨＡ９０％以上である様にさらに「精製」することができる。特に断らない限り、純度は組成物内の成分の相対「重量」で決定される。特に断らない限り、任意の開示された組成物を本発明で開示の通りに精製できる。
「随意」または「随意に」とは、続いて記載する事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、その記載は、その事象または状況が生じる場合、および生じない場合が含まれる。
「プライマー」はあるタイプの酵素的操作を支援することが可能で、酵素的操作が起こり得る様に標的核酸とハイブリダイズ出来るプローブのサブセットである。プライマーはヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体、または酵素的操作を妨害しない、当業界で入手し得るアナログから製造できる。
用語「オメガ-３」、「ｎ−３」、「オメガ-３」、「オメガｎ−３」および「ｎ−３ 系」は、オメガ-３位置にて、共通して、炭素-炭素二重結合を有するポリ不飽和脂肪酸ファミリーを指す。例えば、用語「オメガ-３」とは、最初の二重結合が炭素鎖のメチル末端(オメガ)から第三番目の炭素-炭素結合として存在することを意味する。
用語「オメガ−６」、「ｎ−６」、「オメガ−６」、「オメガｎ−６」、および「ｎ−６系」は、オメガ−６位置にて、共通して、炭素-炭素二重結合を有するポリ不飽和脂肪酸のファミリーを指す。例えば、オメガ−６は、最初の二重結合が炭素鎖のメチル末端(オメガ)から第６番目の炭素-炭素結合として存在することを意味する。
用語「オメガ−９」、「ｎ−９」、「オメガ−９」、「オメガｎ−９」、および「ｎ−９系」は、共通して、オメガ−９位置にて炭素-炭素二重結合を有するポリ不飽和脂肪酸のファミリーを指す。例えば、オメガ−９は、最初の二重結合が、炭素鎖のメチル末端(オメガ)から第９番目の炭素-炭素結合として存在するということを意味する。全ての二重結合は、cis-配置で存在する、即ち２つの水素原子が二重結合の同じ側にある。
用語「油産生微生物」は、そのバイオマスの一部として油を産生出来る微生物を指す。「油産生微生物」は、真核性または原核生物であり得る。例えば、油産生微生物は、乾燥バイオマスの２０％を超える油および／または脂質を蓄積することが出来る油脂性生物であり得る。油産生微生物とは、珪藻、微細藻類、真菌、細菌、原生生物、酵母、植物(陸生および海洋性の両方)または海藻であり得る。
用語「油脂性生物(oleaginous organism)」とは、脂質としてそのバイオマスを２０％以上産生出来るあらゆる生物を指す。例えば、「油脂性生物」は、珪藻、微細藻類、真菌、細菌、原生生物、酵母、植物(陸生および海洋性の両方)または海藻であってよい。
用語「ケトカロテノイド」とは、ケト基含有カロテノイドを指す。
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」とは、１０個の炭素テルペノイドおよびその誘導体、例えばカロテノイドおよびキサントフィルを包含するイソプレノイド経路から得られた化合物またはあらゆる分子を指す。
用語「カロテノイド」とは、５つの炭素イソプレンユニットから縮合されたポリエンバックボーンから構成される化合物を指す。カロテノイドは、非環式であるか、または１つ(単環式)または２つの(二環式)環式末端基にて終結され得る。用語「カロテノイド」とは、カロテンおよびキサントフィルの両方を含み得る。「カロテン」とは、炭化水素カロテノイドを指す。ヒドロキシ-、メトキシ-、オキソ-、エポキシ-、カルボキシ-またはアルデヒド官能基の形態において、またはグリコシド、グリコシドエステルまたはスルフェートのなかで１以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、総合して「キサントフィル」として知られている。本発明において特に適切であるカロテノイドは、単環式および二環式カロテノイドである。
用語「ケト基」または「ケトン基」とは、互換可能に使用され、カルボニル基が２つの炭素原子に結合される基を指す：Ｒ２ＣＯ(いずれのＲもＨであり得ない)。
用語「脂肪酸産生のアンタゴニスト(fatty acid production antagonists)」とは、本明細書で使用したとおりに、脂肪酸サブユニットおよび脂肪酸経路モジュレーターを指す。
用語「脂肪酸サブユニット」または「脂肪酸サブユニット(複数)」は、本明細書で使用したとおりに、開示された油産生微生物に対してＰＵＦＡの産生のための代謝経路に関わる１６、１８、２０、２２または２４個の炭素の脂肪酸のいずれかを指す。例えば、「脂肪酸サブユニット」とは、図１に示されたとおりの１６、１８、２０、２２または２４個のあらゆる炭素脂肪酸を包含し得る。
「脂肪酸サブユニット」とは、また開示された油産生微生物に対してＰＵＦＡの産生のための代謝経路に関する１、２、３、４、５または６つの不飽和を有するあらゆる１６、１８、２０、２２または２４個の炭素の脂肪酸を指す。さらなる実施態様は、海洋生物内で見出された、例えば、１５、１７、１９および２１個の炭素の脂肪酸等の不飽和物を有するかまたは有さない、奇数の炭素脂肪酸を包含し得る。
用語「脂肪酸経路モジュレーター」とは、本明細書で使用したとおりに、開示された油産生微生物に対してＰＵＦＡ産生のための代謝経路に関与する１以上の酵素を阻害出来る化合物を指す。
本出願を通じて、様々な出版物が参照される。本発明が係わる最新技術をより完全に記載するため、これらの出版物の開示を本明細書中に引用により含める。開示された参照文献も、参考文献に依存する文章中で議論された、その中に含まれる内容について、個別かつ具体的に引用により含める。
開示された組成物を調製するために使用される成分に加え、本発明で開示された方法で使用される組成物そのものも開示される。これらの材料およびその他の材料が開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されるが、これらの化合物の個々の、および全体的な様々な組み合わせおよび順序の入れ替えの具体的な記載が本明細書に明白に開示されないことがあることが理解される。例えば、スラウストキトリアセアエ科の特定の種が開示され、議論され、スラウストキトリアセアエ科の種を含むいくつかの微生物に加えられるいくつかの修飾が議論される場合、具体的に示されない限り、各々および全てのスラウストキトリアセアエ科由来のこれらの種の組み合わせおよび順序の入れ替え、および可能な修飾が想定される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスの他に分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスが開示され、分子の組み合わせの一例であるＡ−Ｄが開示された場合、それぞれが個別に列挙されなくても、それぞれが個別に全体的な組み合わせを意味すると想定され、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されたものと考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示されている。従って、例えばサブグループＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅが開示されているものと考えられる。この概念は、開示された組成物の製造および使用法の工程を含むがそれに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。従って、実行され得る様々な別な工程がある場合、これらの追加工程のそれぞれは、開示された任意の具体的な実施形態または実施形態の組み合わせで実行できると理解される。
Ｂ．組成物
（ｎ−３）系のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等、（ｎ−６）系のＤＰＡおよび（ｎ−９）系のパルミチン酸およびステアリン酸等の、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸およびオメガ−９脂肪酸等の不飽和脂肪酸等の脂肪酸等の脂質産生能を有する、スラウストキトリアレス目の油産生微生物、好ましくはスラウストキトリウムまたはシゾキトリウム（Schizochytrium）種が開示される。
開示された油産生微生物は、カロテノイド化合物であるカロテン（例えばβ−カロテン）、およびキサントフィル化合物であるアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチンおよびエキネノン等であるがそれらに限定されない抗酸化剤も生産し得る。
また、油産生微生物の単離および生育条件も開示される。例えば、開示された脂質と抗酸化物質とを個々に、および累積的に産生するための従属栄養生育条件である。従って、この開示された油産生微生物の使用により、栄養剤、食品添加物、医薬品として、または産業で有用である（ｎ−３）系のＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡおよび／または（ｎ−６）系のＤＰＡおよび／またはカロテノイド系の抗酸化化合物および／またはキサントフィル系の抗酸化化合物を効果的に製造することが可能である。
スラウストキトリウム種を含むかそれらで構成される油産生微生物を含む組成物が開示され、本明細書に開示される一例はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２４５の寄託番号を有するＯＮＣ−Ｔ１８株である。
油産生微生物、および任意のクローン、改変微生物、またはＯＮＣ−Ｔ１８で示される上記微生物から単離された遺伝子も開示されることが理解される。開示された微生物は、オメガ−３系のＤＨＡおよびＥＰＡ、およびオメガ−６系のＤＰＡ等の脂質などの不飽和脂肪酸、およびカロテノイド、キサントフィルおよびフェノール類等の様々な抗酸化物質を生産する能力を有する。
また、上記化合物を含むバイオマスの産生プロセスも開示される。さらに、油産生微生物を利用するオメガ−３、オメガ−６およびカロテノイド化合物の調製プロセスも開示される。また、微生物由来（または単細胞）の油の生産プロセスも開示される。
さらに、開示された油産生微生物およびその任意の子孫（遺伝的に改変されるかその他）により生産される脂肪酸およびカロテノイド、脂質および抗酸化物質を補充された様々な食品素材、栄養剤、医薬品および食品の他、これらの化合物を様々な食品素材および食品用の添加剤として使用するプロセスも開示される。
Ｂａｒｃｌａｙの米国特許第５,１３０,２４２号は、オメガ−３脂肪酸の生産のために、以下の特性を有する微生物株を単離するための収集およびスクリーニングプロセスを開示している：（１）従属栄養生育が可能；（２）高い含有量のオメガ−３脂肪酸を生産；（３）単細胞性；（４）低含有量の標準およびオメガ−６脂肪酸を生産；（５）色素を含まず、白色または無色の細胞；（６）耐熱性（例えば３０℃以上での生育能）；および（７）塩適応性（広い範囲の塩分で生育する能力を有するが、低塩分が好ましい）。
また、‘２４２開示は、その後動物またはヒト用食品に使用できる高濃度のオメガ−３脂肪酸を有する全細胞または抽出微生物生成物の従属栄養生産プロセスを開示している。このプロセスは、その開示された収集およびスクリーニングプロセスで同定された微生物を使用する。スラウストキトリアレス目であるこれらの微生物を穀粒粕中で培養する。オメガ−３脂肪酸の生産を増大するため、低温ストレスおよび高濃度溶存酸素が用いられる他、抗酸化物質、成長因子、ビタミンおよび燐が添加される。抽出された生成物は高濃度のオメガ−３脂肪酸（例えばＣ２０：５ｗ３、Ｃ２２：５ｗ３およびＣ２２：６ｗ３）と、低濃度のオメガ−６脂肪酸（例えばＣ２０：４ｗ６およびＣ２２：５ｗ６）を含む。具体的には、Ｃ２０：５ｗ３とＣ２２：６ｗ３脂肪酸の比率は１：１〜１：３０の範囲になる。Ｃ２２：５ｗ３とＣ２２：６ｗ３脂肪酸の比率は１：１２から微量のＣ２２：５ｗ３の範囲である。また、その微生物は全脂肪酸に対する重量％で０．６〜０．７２％のＤＨＡ、０〜５％のＤＰＡおよび０〜１８．９％のＥＰＡを生産する。
Ｂａｒｃｌｅｙの米国特許第６，４５１，５６７号は、ナトリウム塩を含む非塩素培地（＜３ｇ／Ｌ）中のスラウストキトリウムおよびシゾキトリウムを生育するためのプロセスを開示している。該非塩素培地により、細胞凝集体のサイズが１５０μｍ以下になる。開示されたプロセスは、水産養殖用の飼料に有用である微生物と抽出物とを生産する。飼料の成分はさらに亜麻仁、菜種、大豆およびアボガドミールを含む。その微生物は、１日あたり１．０８ｇ／１Ｌ培地までのオメガ−３脂肪酸を生産できる。‘５６７の開示はさらに、海水、グルコース（１、３、５または１０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．０１、０．２、０．４および５ｇ／Ｌ）、タンパク質加水分解物（１ｇ／Ｌ）、肝臓抽出物（１ｇ／Ｌ）、グルタメート（５ｇ／Ｌ）、グルタミン酸一ナトリウム(ＭＳＧ)（３ｇ／Ｌ）等の追加窒素源、および追加塩、微量のビタミンおよびミネラル（例えばＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４およびゼラチン抽出物）を含む様々な培地を開示している。
Ｙｏｋｏｃｈｉらの米国特許第６、５８２，９４１号は高濃度のオメガ−３ＤＨＡおよび／またはオメガ−６ＤＰＡ、および低濃度のＥＰＡを有する脂肪酸分画を産生する能力を有するシゾキトリウム種ＳＲ２１株および同じ種に属する他のシゾキトリウム種を開示している。また、この様な微生物を培養し、この様な脂肪酸を単離する方法も開示されている。用いられた培地は海塩、酵母抽出物（０．２、１．０または１０ｇ／Ｌ）、コーンスティープリカー（０．５、１．０または１０ｇ／Ｌ）、グルコース（１０〜１２０ｇ／Ｌ）プラス追加の塩（ＮＨ４ＯＡｃ、リン酸塩等）を含む。脂肪酸組成物はバイオマスに対し１５〜２０重量％のＤＨＡを含む（全脂肪酸の約２８重量％）。その組成物を食品（例えば乳児用ミルク）に使用できる。
Ｂａｉｌｅｙらの米国特許第６，６０７，９００号は、少なくとも２０％のバイオマスをポリ不飽和脂質（特にオメガ−３および−６脂肪酸）として生産し得る油産生微生物（例えばシゾキトリウム種ＡＴＣＣ番号２０８８８）を生育させるプロセスを開示している。そのプロセスには炭素および窒素源を含む培地中で微生物を培養する工程を含む。また、生産を増大するための低溶存酸素レベル（３％以下）と低塩素イオンレベル（３ｇ／Ｌ以下）との使用も開示されている。その微生物は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／ｈの脂質産生速度を有している。脂質分画はバイオマスあたり１５〜２０重量％のＤＨＡである（全脂肪酸メチルエステルの約３５重量％）。
Ｋｏｍａｚａｗａらの米国特許公開公報第２００４／０１６１８３１号は、ＤＨＡ生産能を有するスラウストキトリウム株（LEF1：ATCC No．FERM BP−08568；the Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Japan）を開示している。通常の培地中で培養することにより、微生物は少なくとも５０重量％のＤＨＡを含む油を生産することができる。ＤＨＡの単離前に油をリパーゼで処理することができる。その油は食品または飲料中で使用することができ、ＤＨＡを加水分解してベヘン酸を製造することができる。
１．脂肪酸
脂肪酸は末端にカルボキシル基を有する炭化水素鎖であり、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む場合は不飽和と呼ばれ、複数のこの様な結合を含む場合はポリ不飽和と呼ばれる。長鎖ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）または高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）はこれらの二重結合の位置により、（ｎ−３）および（ｎ−６）系に分類され得る。ＤＨＡ等の（ｎ−３）高度不飽和脂肪酸は心臓循環疾患、慢性炎症および脳障害に有益な効果を示すという圧倒的な具体的事実がある。一方、（ｎ−６）脂肪酸はプロスタグランジン、ロイコトリエン等のエイコサノイドステロイドの中間代謝物として注目されてきた。
ポリ不飽和脂肪酸は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の二重および／または三重炭素-炭素結合を含むことができる。例えば、ポリ不飽和脂肪酸は３−８、４−７または５−６二重および／または３重炭素-炭素結合を含み得る。
現在、これらの高度不飽和脂肪酸の主な資源は魚であり、ＤＨＡおよびＥＰＡは様々な魚種（例えば、イワシ、カタクチイワシ、ピルチャードおよびマグロ等）中にそれぞれ約２０％および１０％の量である。しかしながら、これらの脂質の単なる資源として魚油を使用することを意図する場合、悪臭の問題、入手可能性の制御不能な変動、天然の魚油含有量の変動性の他、有害な環境汚染物蓄積の可能性等のいくつかの不利な点がある。さらに、上記資源から高度に精製された（ｎ−３）または（ｎ−６）油を得ようとする場合、選択的に分離し精製することが非常に困難である。特に、ＤＨＡの高度に濃縮された形に対する新生児栄養補助剤の市場で大きな需要がある。魚油が上記製品の資源である場合、ＥＰＡよりＤＨＡを大量に選択的に単離しなければならない。これらの高度不飽和脂肪酸の高度に精製された代替資源および生産または顧客の注文に適した資源が必要であることは明らかである。あるその様な資源は、脂質代謝経路または脂肪酸産生と関連する経路、例えば油産生微生物中でその抗酸化物質特性のために脂質と平行して産生されるカロテノイド経路に直接的に影響する脂肪酸産生アンタゴニストの使用である。
Ｓｈｉｒａｓａｋａら(2005)（Mycoscience 46:358-363）は、シアノコバラミンおよびp-トルイル酸の両方を使用して、シアノコバラミンの場合(ビタミンＢ１２の活性成分)にはプロピオン酸のコハク酸への変換に関与するコバラミン依存性メチルマロニル-ＣｏＡムターゼを上方調節することによって、またｐ−トルイル酸の添加に関して、用量依存様式において、オメガ−６のＤＰＡ濃度を低下することおよびＥＰＡ濃度を増加することによって、シズキトリウム・リマシナム（Schizchytrium limacinum）ＳＲ２１の脂肪酸組成物を改変した。
魚油に加えて、様々な微生物（主として海洋微生物）が（ｎ−３）系のドコサヘキサエン酸を生産および／または蓄積することが可能である。微生物生産が季節性、天候および食物供給等の外部変数で生じる変動を受けないという事実は特に興味のあることである。例えば、以下の油産生微生物がＤＨＡ生産能を有するとして知られている：深海由来のバクテリアであるビブリオ・マルチナス［Vibrio martinus（ＡＴＣＣ１５３８１）］、ビブリオ種(Vibrio sp)Ｔ３６１５、フォトバクテリウム・プロファンダム(Photobacterium profundum) ＳＳ９、モルティエレラ・マリナ(Mortierella marina) ＭＰ−１およびフィクロモナス・カイカエ(Phychromonas kaikaoe)（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３６３Ｔ）；クリストリジウム・コリ(Crypthecodinium cohmi)、キクロテラ・クリプティカ(Ctclotellla cryptica)およびモルティエレラ・アルピナ（Mortieralla alpine)(１Ｓ−４）等の微小藻類；および原生生物であるスラウストキトリウム種（ＡＴＣＣ２０８９２）、スラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）（ＡＴＣＣ３４３０４）およびスラウストキトリウム・ロゼウム（Thraustochytrium roseum）。しかしながら、これらの精製した生物を利用するプロセスによれば、リッターあたりバイオマスのグラムあたり生産される、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸の量は低く、１０〜５００ｍｇの範囲である。いくつかの例と代表的な微生物である油生産生物とが図５に示される。
オメガ−３は有益な効果を有することが示され、本明細書に開示された油と組成物とを嚢胞性線維症（Cochrane Database Sys Rev．3）、関節リュウマチ（Drugs 63：845−53）、喘息（Ann Allergy Asthma Immunol:371−7）および血栓性脳卒中（Prev Cardiol 6：38−1）に対する抗炎症効果、心臓保護剤の他、粥状硬化症および不整脈（Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids、63：351−62）、乳癌および前立腺癌細胞株の癌増殖阻害ならびに動物実験における減少に対する直接効果（AM J Clin Nutr 77：532−43）、精神分裂症（Ｊ Neural Transm Suppl 64：105−17)および他の精神医学疾患（Can Ｊ Psychiatry 48：195−203）に対する抗精神病効果、通常の新生児発達および新生児感染に対して用いられる免疫栄養補助剤（Eur J Pediatr 162：122−8）、および神経障害および炎症性の痛みの元になる神経および神経節プロセスを直接改善することによる病理学的痛みの治療（Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acid 68：219−24）に使用できる。
２．スラウストキトリアセアエ属
（ａ）ＯＮＣ−Ｔ１８
油産生微生物の一つの例示は、海洋微生物ＯＮＣ−Ｔ１８である。本明細書に開示する海洋微生物ＯＮＣ−Ｔ１８をＰＵＲＦ生産微生物単離ストリップ（trip）の一部として採集し、６０以上の純粋な培養物を単離した（詳細は表７）。さらに、ＯＮＣ−Ｔ１８をカナダのＮｏｖａ Ｓｃｏｔｉａ、Ａｄｖｏｃａｔｅ Ｈａｒｂｏｒ、Ｆｕｎｄｙ湾の塩水湖海草の葉から単離した。顕微鏡観察および連続培養精製技術により、その株はスラウストキトリウム属に属する単一微生物であると考えられた。全ての株と２つのＡＴＣＣ比較培養物（ＡＴＣＣ２０８９１およびＭＹＡ−１３８１）を海水（ｓｗ）中に０．５％グルコース、０．２％ペプトン、０．２％酵母抽出物で生育させ、ＧＣ分析を行った（脂肪酸メチルエステル）。
図６は、高度に保存される１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を使用して得られた配列の比較を基にした、ＯＮＣ−Ｔ１８と他のラビリンチュラ(Labyrinthulida)目近縁生物との関係に関する提案された系統発生学的系統樹を示す。
図４は、ＯＮＣ−Ｔ１８とThraustochytriidae科の他の近縁生物との関係性を決定するために、近隣結合法およびブートストラップ解析技術を用いて作成した一つの微生物系統樹を示し、また１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を用いて直接配列決定して、類似の母型を用いるパブリック・ドメイン内で他の配列と比較した。
ＯＮＣ−Ｔ１８は、当初、古典的マツ花粉刺激技術を使用し、その後の選択培地での培養することにより単離された。具体的には、１Ｌの０．２μｍフィルターで濾過した海水中に５ｇＬ−１のグルコース、２ｇＬ−１のペプトン、２ｇＬ−１の酵母抽出物を含む栄養培地を調製した。次にＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ抽出法とＰＵＦＡガスクロマトグラフィー技術とを用いてＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸プロファイルを測定した。クロマトグラフィーの結果から、全脂肪酸量（ＴＦＡ）、ＤＨＡの増加した量に加え、大量のＥＰＡおよびＤＰＡ（ｎ−３およびｎ−６脂肪酸）を産生する能力が示された。
開示された油産生微生物をＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡを含む脂質または脂肪を調製するプロセスに使用できるが、その微生物は、上記ＯＮＣ−Ｔ１８またはＰＴＡ−６２４５株に限定するものではなく、遺伝的修飾、化学突然変異体誘発、培養適応または任意の他の突然変異体株生産手段によるこれら株の変異株であってもよく、これらの修飾により生じたものは本明細書に開示される油産生微生物等の遺伝的または形態的および／または機能的特徴を有する。
独特な脂質クラスの性質を有する脂質組成物を産生できる油産生微生物と、高い機能性およびそれに基づく付加価値を有するこの様な脂質に関して安定かつ信頼でき、経済的な資源を維持する問題の解決とが開示される。従って、（ｎ−３）系のＤＨＡおよび（ｎ−６）系のＤＰＡを大量に生産する野生株、およびこれらのポリ不飽和脂肪酸を大量に生産する様に設計された変異体および組み替え株が本明細書に開示される。この様な変異体または組み替え微生物には、同じ条件および培地を用いて培養した場合に元の野生型株が産生する脂質よりも高い上記脂質の含有率を有する様に設計されたものが含まれる。さらに、優れた費用効率を示す基質を効果的に使用して、対応する野生型株と比較して同様な量の（ｎ−３）系のＤＨＡ、ＥＰＡおよび（ｎ−６）系のＤＰＡを含む脂質を産生する様に設計された微生物を選択し得ることも含まれる。
スラウストキトリアレス目の油産生微生物を含み、その油産生微生物が不飽和脂肪酸を生成する組成物が開示される。そのポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＨＡおよびＤＰＡ等のオメガ−３またはオメガ−６脂肪酸であってよい。
また、スラウストキトリアレス目の１以上の油産生微生物を含む組成物が開示され、ここで該油産生微生物の生育が脂肪酸産生のアンタゴニストにより追加される場合に、該油産生微生物が特定の脂肪酸を産生する。
また、スラウストキトリアレス目の１以上の油産生微生物を含む、ここで油産生微生物が、標準的培養培地を１以上の脂肪酸産生アンタゴニストによって補充することによって、特定の不飽和脂肪酸、例えばオメガ-３脂肪酸、例えばＥＰＡの量を上昇させる、組成物が開示される。かかる様式におけるオレイン酸の使用は、図９および実施例１４(c)に図示される。
脂質を産生する油産生微生物を含む組成物が開示される。
また、油産生微生物を含む組成物を開示するものであって、ここで該真核生物組成物は脂質を産生し、ここで該脂質は本明細書に開示したような脂質を含んでいる。
また、スラウストキトリアレス目の１以上の油産生微生物を含む組成物を開示するものであって、ここで油産生微生物がケトカロテノイド化合物を生成する。ケトカロテノイド化合物には、これらに限定しないが、カロテンおよびキサントフィル、例えばβ-カロテンおよびアスタキサンチンを包含する。
カロテノイドは、天然脂質可溶性化合物であり、偏在するＣ５イソペンテニルピロリン酸塩前駆体およびその構造異性体ジメチルアリルピロリン酸塩から合成される。カロテノイドは、豊富に、高度に派生した化合物の群を含む。化合物のこの群内では、２つの分類が存在し、炭化水素カロテノイド、カロテン、およびカロテンの含酸素誘導体、キサントフィルである。
カロテノイドは、また、地球上の天然化合物の最も豊富かつ多様な群の一つである。我々が生存する世界の活力に関与している。昔から、カロテノイドは、食餌、食品および栄養食品産業に使用されてきた。それらは、シアノバクテリアを包含する光合成生物により偏在的に産生されるが、また非光合成細菌および真菌(Goodwin、The Biochemistry of Carotenoids. New York: Chapman and Hall(1980))において広範囲に存在する。カロテノイドは、二次代謝物として分類されるが、それらは植物成長および光合成のために不可欠であると知られている。カロテノイドはまた、ヒトを含む多くの高等生物にも重要であり、多くの生物は、これらの化合物を合成することが出来ない。従って、食物摂取が、多くの生物にとってカロテノイド唯一の供給源である。結果として、食物起源およびカロテノイド実際の消費量における研究は、近年さらに注目を集めている。2006年には、カロテノイドに関する世界市場は、US$ 954.7 百万の価値があると見積もられ、この予測により2010にはUS $1069.2百万に増加すると見積もられている（Carotenoids: A Global Strategic Business Report、2006)。
食物用カロテノイドの一つの役割は、ビタミンＡへの前駆体(レチノイド)の役割である。ビタミンＡの欠損は子供の予防可能な失明の主な原因であるとして重要であり、また重篤な感染(ＷＨＯ)由来の疾患および死亡のリスクを増加させる。食用抗酸化物質として、カロテノイド、例えばβ-カロテン、リコペン、アスタキサンチン、カンタキサンチンおよびルテインは、有意な抗癌活性を示し、慢性疾患の予防における重要な役割を担う(Edge、B-Biology 4、41、189-200 (1997); Singh、Oncology-New York、12、1643(1998); Smith、British Journal of Biomedical Science、55、268-275 (1998))。さらに、カロテノイドの消費量の増加は、変性疾患、例えば加齢性黄斑変性症、加齢関連性盲目の主な原因に加えて、ある種の癌および慢性心臓疾患(Basu、JACS、78(7)、665−675(2001); Mares-Perlman et al.、J Nutr、132(3)、518S-524S (2002))の発症低下と関連している。
共有二重結合のそのバックボーンを理由として、カロテノイドは、カロテノイド分子の分解をもたらすが、損傷をうける他の分子または組織を守る、カロテノイド鎖上で一重項酸素の励起エネルギーを吸収できる強力な生物学的抗酸化物質である(Schagerl and Muller、 J Plant Physiol 2005)。カロテノイドは、２つの構造的に異なる分類、即ちカロテンおよびキサントフィルに分けられる。カロテンは炭化水素骨格を持つが、キサントフィルは１以上の酸素含有官能基を含有する(Armstrong and Hearst、 Faseb J、10 (2)、 228-3(1996); Armstrong、 Annu Rev Microbiol、 51、 629-59 (1997))。カロテンは、生合成に関して高度に保存された様式を有する多くの生物に共通している。一方で、キサントフィルは、生物の小さなクラッチ（clutch）により産生される。最終生成物および合成経路は、種特異的であることが多い。カロテノイドのなかで、最も興味を引き付けるものがキサントフィルであって、特にβ-カロテン、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンである。β-カロテンは世界市場の最大の部分を占めるが、一方カンタキサンチンおよびアスタキサンチンは、市場の各々14.92%および21.58%を占める(Carotenoids: A Global Strategic Business Report、2006)。
キサントフィルは、様々な化合物、例えばケトカロテノイド、エチネノンおよびカンタキサンチンを含んでおり、β-カロテンのβ−イノン環の各々４および４’位置にて１または２のカルボニル基の添加によって合成される。反応は、全体的にβ-カロテンケトラーゼ遺伝子として知られる遺伝子類により触媒した。β-クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンは、キサントフィルとしても分類され、これらは、ヒドロキシル基を有するβ-カロテンのβ-イオノン環の３および３'位置で水素原子の直接置換により合成される(Tian and DellaPenna、Arch Bichem Biophys、430(1)、22−9(2004))。さらに、多数の組み合わせたケトおよびヒドロキシル化カロテノイド、例えば３-ヒオロキシエチネノン、３'-ヒオロキシエチネノン、アドニキサンチンおよびアドニルビンが存在する。ここで挙げた全ての化合物は、重要な特性を有する化合物自体価値のある化合物であるが、重大なことは、それらはアスタキサンチンの生合成に対して重要な前駆体を構成する。アスタキサンチンは、β-カロテン骨格のβ−イノン環の３,３'および４,４'炭素で両方ヒドロキシル化およびケト化されているこの経路の最終産物である。しかし、β-カロテンからアスタキサンチンへの実際の経路は十分に特徴づけられていないが、種特異的であることが判明し得る(Tao et al., Metab Eng. (2006))。
また、油産生微生物を含む組成物も開示され、該組成物は抗酸化物質を生成する。
また、油産生微生物がスラウストキトリアレス(Thraustchytriales)目のメンバーを含む組成物も開示される。
また、油産生微生物が、配列番号：１と少なくとも８０％同一性を有する１８ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子配列を持つ組成物も開示される。
また、油産生微生物が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ３７４１４９と少なくとも８０％同一性を有する１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列を持つ組成物も開示される。
遺伝学、脂質の特徴または分類による、油産生微生物に対する本明細書に記載した特徴付けのあらゆる形を、本明細書に開示した油産生微生物の特徴付けに使用し得ることが理解される。油産生微生物はスラウストキトリアセアエ科由来の１つ以上の微生物を含み得、その例はＡＴＣＣ受託番号２０８８８、２０８８９、２０８９０、２０８９１、２０８９２およびＰＴＡ−６２４５である。微生物およびそれらが産生する不飽和脂肪酸またはカロテノイドに関連して利用されうる様々な特性がある。例えば、生物または油または抗酸化物質のセット（単数または複数）を規定するためのあらゆる組み合わせまたは順序の変更にこれらの特性を使用し得ることが理解される。例えば、１つの特性は生物自体の分類、生物の遺伝的同定、生物の脂質および抗酸化物質のプロファイル、および生物の生育条件である。
（ｂ）分類
本明細書に記載した方法において使用され得る油産生微生物はフィラム・ラビリンツロマイコタ（Phylum Labyrinthulomycota）由来であり得る。油産生微生物は、ラビリンツロマイセテス（Labyrinthulomycetes）綱由来であり得る。油産生微生物はスラウストキトリダエ（Thraustochytridae）亜綱由来であり得る。油産生微生物はスラウストキトリアレス目由来であり得る。油産生微生物はスラウストキトリアセアエ科由来であり得る。油産生微生物はスラウストキトリウム属由来であり得る。油産生微生物はスラウストキトリウム種であり得る。油産生微生物はスラウストキトリウム・アウレウムであり得る。油産生微生物はスラウストキトリウム・ロゼウムであり得る。油産生微生物はスラウストキトリウム・ストリアツム（Thraustochytrium striatum）であり得る。油産生微生物はシゾキトリウム属由来であり得る。油産生微生物はシゾキトリウム種であり得る。油産生微生物は任意の列記した油産生微生物の修飾バージョンであることができる。油産生微生物とは、上記の真核生物の綱、亜綱、目、科または属の現在知られていない、または単離されていない任意のメンバーも含むことができる。油産生微生物の組み合わせは、１つ以上のスラウストキトリウム種、シゾキトリウム種、スラウストキトリウム・アウレウム、スラウストキトリウム・ストリアツムおよびスラウストキトリウム・ロゼウムを含む、本発明に開示された任意の生物の任意の組み合わせでありうる。
スラウストキトリアセアエ科由来の油産生微生物は、上記に開示したあらゆるものであり得る。油産生微生物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２４５を有する生物を含むことができる。
（ｃ）遺伝学
油産生微生物は配列番号１の１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を有することができる。油産生微生物は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３７４１４９に記載した１８ＳリボソームＲＮＡ配列を有し得る。該油産生微生物は、配列番号１と、例えば約９０％の相同性またはその他の同一性を有する１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列を持ち得る。該油産生微生物は、ストリンジェントな条件、または本明細書に開示したあらゆるその他の条件下に、配列番号１または配列番号１の一部とハイブリダイズする１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する。
生物の核酸の配列類似性／同一性および核酸ハイブリダイゼーションは本発明に記載の通りである。具体的には、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムを用いた、配列番号１とゲノムデータベースＧｅｎｅｂａｎｋ（National Centre For Biotechnology Information、National Institute of Health、Bethesda、MD、USA）中に見出された核酸配列との比較により、配列番号１がいくつかの真核スラウストキトリド（Thraustochytrid）種と関連し（９１％の類似性）、スラウストキトリウム種ＣＨＮ−１［ＡＢ１２６６６９］（９４．５％の類似性）およびスラウストキトリダエ（Thraustochytridae）種Ｎ１−２７［ＡＢ０７３３０８］（９５．５％の類似性）と密接に関連し、スラウストキトリウム・ストリアツム［ＡＦ６５３３８］（９７．５％の類似性）と最も密接に関連しているとして同定された。
３．植物
脂肪酸産生アンタゴニストを使用して、遺伝子組換えおよび天然種の両方を含み、また例えば、菜種、フラックス・シード、ダイズおよびヒマワリなどの代表的な植物を含む油産生植物における油産生比率に影響することが出来る。該アンタゴニストの導入方法は、例えば根類を介して植物中へに導入するために植物周辺エリアに水をやること、植物細胞中に直接導入するためにスプレー中に活性成分として添加することを含む。さらに、気孔または皮下のいずれかを介する植物細胞中へのこれらの化合物の直接浸積、気化または注射も有効な方法と考えられ得る。
３．（１）配列類似性
本明細書で議論した様に、相同性および同一性という用語の使用は類似性と同じであることが理解される。従って、例えば用語相同性の使用が２つの非天然配列間で用いられる場合、これは必ずしもこれらの２つの配列間の進化の関係を示すのではなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目している。２つの進化上関連する分子間の相同性を決定する多くの方法は、それらが進化上関連しているかどうかに係わらず、配列の類似性を測定する目的で任意の複数の核酸またはタンパク質に日常的に適用される。
一般に、開示された遺伝子およびタンパク質の任意の既知の変異体および誘導体、または生じ得る変異体および誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性を考慮して変異体および誘導体を定義することで行われる。本明細書に開示された特定の配列のこの同一性は、本明細書の他の場所でも議論される。一般に、本発明に開示された核酸およびタンパク質の変異体は、上記の配列または天然の配列に対して少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の相同性を有する。当業者は２つのタンパク質または遺伝子等の核酸の相同性をどのように決定するかを知っている。例えば、相同性が最高のレベルになる様に２つの配列を整列することにより、該相同性を計算することができる。
相同性を計算する他の方法を、公開されたアルゴリズムを用いて行うことができる。比較のための最適整列をＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの部分相同性アルゴリズム（Adv．Appl．Math．、2：482、1981）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム（J．Mol．Biol．48：443、1970）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：2444、1988）、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（Wisconsin Genetic Software Package、Genetic Computer Group、575 Science Dr., Madison、WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、または目視で行うことができる。
同じタイプの相同性を、例えばＺｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２、１９８９；Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０、１９８９；Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６、１９８９に開示されたアルゴリズムにより、核酸に対して得ることができ、少なくとも核酸整列に関係した問題に対して本明細書に引用により含める。これらの方法のいずれもが典型的には使用され、ある場合はこれらの様々な方法の結果は異なることもあるが、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見出された場合、その配列は言及した同一性を有すると言われ、本明細書に開示されることを当業者は理解すると思われる。
例えば、本明細書で用いる様に、他の配列と特定の割合の相同性を有するとされる配列とは、任意の１つ以上の上記計算法で計算されたその相同性を有する配列を指す。例えば、第１配列が第２配列に対し他の計算法の任意の１つで計算された８０％の相同性を持たなくても、第１配列がＺｕｋｅｒ計算法を用いて第２配列に対し８０％の相同性を有すると計算された場合、本明細書で定義した様に第１配列は第２配列に対して８０％の相同性を有する。他の例としては、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ計算法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法または任意の他の計算法で計算された様に第１配列が第２配列に対して８０％の相同性を持たなくても、Ｚｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算法の双方を用いて第１配列が第２配列に対して８０％の相同性を有すると計算された場合、本明細書で定義した様に第１配列は第２配列に対して８０％の相同性を有する。また別な例として、各計算法（実際には異なった計算法は異なった相同性の割合を計算する結果になるが）を用いて第１配列が第２配列に対して８０％の相同性を有すると計算された場合、本明細書で定義した様に第１配列は第２配列に対して８０％の相同性を有する。
（２）ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
典型的には、ハイブリダイゼーションという用語はプライマーまたはプローブおよび遺伝子等の少なくとも２つの核酸分子間の配列で駆動される相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、ヌクレオチド特異的様式において２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは配列駆動相互作用である。具体的には、配列駆動相互作用はヌクレオチドのワトソン・クリック（Watson-Crick）面またはフーグステイン(Hoogsteen)面で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは当業者に公知のいくつかの条件およびパラメーターに影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨおよび温度の全ては、２つの核酸分子がハイブリダイゼーションするかどうかに影響する。
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションに対するパラメーターは当業者に公知である。例えば、ある実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の何れかまたは双方の温度および塩濃度の双方で制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを行うためのハイブリダイゼーション条件にはＴｍ（半分の分子がそのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融点）より低い約１２〜２５℃である温度における高イオン強度溶液（６×ＳＣＣまたは６×ＳＳＰＥ）中のハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄温度がＴｍより低い約５〜２０℃である様に選ばれた温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄が含まれる。温度および塩条件は、フィルター上に固定化された参照ＤＮＡ試料が関連する標識核酸とハイブリダイゼーションし、異なったストリンジェンシーの条件下に洗浄される予備実験で実験的に容易に決定される。典型的には、ハイブリダイゼーション温度はＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションでより高くなる。ストリンジェンシーを達成するためにこれらの条件を上記の様に、または公知の様に使用できる（Sambrookら、Molecular Cloning:A laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989；Kunkelら、Methods Enzymol．154：367、1987、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する内容に対して引用により含める）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに対する好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は６×ＳＣＣまたは６×ＳＳＰＥ中約６８℃（水溶液中）、それに続く６８℃での洗浄であり得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄は、必要あれば所望の相補性の程度が減少すればそれに応じて、さらに可変性をサーチする任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの多さに応じて減少させることができる。同様に、公知の様に必要あればハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは所望の相同性が増加するにつれて、さらに高い相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの多さに応じて増加させることができる。
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別な方法は、他の核酸に結合した１つの核酸の量（割合）を調べることである。例えば、ある実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが非限定核酸に結合している場合である。典型的には、非限定プライマーは例えば１０または１００または１０００倍過剰である。限定プライマーおよび非限定プライマーの双方が例えばそのｋｄより１０、１００または１０００倍小さい場合、または核酸分子の１個のみが１０、１００または１０００倍である場合、または１つまたは２つの核酸分子がそのｋｄより大きい場合にこのタイプの分析を行うことができる。
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別な方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素操作を促進することが要求される条件下で酵素的に操作されるプライマーの割合を求めることによる。例えば、ある実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマーが酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合、例えば酵素操作がＤＮＡの延長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマー分子が延長される場合である。好ましい条件には酵素が操作を行うに適当であると製造業者が示唆した条件、またはその技術分野で示されている条件が含まれる。
相同性と全く同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションレベルを決定するために本明細書に開示された様々な方法があることが理解される。これらの方法および条件は２つの核酸分子間で異なった割合のハイブリダイゼーションを提供し得るが、特に断らない限り任意の方法のパラメーターが一致することで十分である。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが要求された場合、これらの方法の任意の１つで要求されたパラメーターの範囲でハイブリダイゼーションが生じる限り、本明細書で開示されたと考えられる。
組成物または方法が全体的または単独でハイブリダイゼーションを決定するこれらの基準の何れか１つと合致する場合、それは本明細書で開示された組成物または方法であることを当業者は理解し得ると思われる。
（ｄ）産生された分子の組成
本発明に開示した油産生微生物が多数の化合物と組成物とを産生出来ることが理解される。化合物および組成物を１つのサイン、または油産生微生物を同定する１つの方法として用いることができる。例えば、ある油産生微生物を特徴付ける方法は、その油産生微生物が産生する脂質のプロファイルによるものである。本明細書に開示する様に、これらの様々な脂質プロファイルを、油産生微生物を特徴付けると同時に、様々な理由のために精製し、操作し採集するために使用できる。
（１）脂質
本明細書に開示する様に、各油産生微生物はあるプロファイルの不飽和脂肪酸を製造することができることが理解される。これらのプロファイルは油産生微生物に特徴的である。以下に生物の不飽和および他の脂質プロファイルのいくつかの例を示す。
例えば、油産生微生物は少なくとも約４ｗｔ％〜６ｗｔ％（例えば約５ｗｔ％）の脂質または脂肪酸分画を産生可能で、その分画は、乾燥細胞バイオマスあたり約０ｗｔ％〜約２ｗｔ％のミリスチン酸（例えば約１ｗｔ％）、約１６ｗｔ％〜約２０ｗｔ％のパルミチン酸（例えば約１８ｗｔ％）、約０ｗｔ％〜約２ｗｔ％のパルミトレイン酸（例えば約１ｗｔ％）、約４ｗｔ％〜約８ｗｔ％のステアリン酸（例えば約６ｗｔ％）、約３０ｗｔ％〜約３４ｗｔ％のオレイン酸（例えば約３２ｗｔ％）、約４０ｗｔ％〜約４４ｗｔ％のリノール酸（例えば約４２ｗｔ％）、および約０ｗｔ％〜約３ｗｔ％のｎ−３ＥＰＡ（例えば約２ｗｔ％）を含む。
例えば、油産生微生物は少なくとも約１ｗｔ％〜３ｗｔ％（例えば約１．２５ｗｔ％）の脂質または脂肪酸分画を生産可能で、その分画は乾燥細胞バイオマスあたり約２ｗｔ％〜４ｗｔ％（例えば約３ｗｔ％）のミリスチン酸、約５０ｗｔ％〜約６０ｗｔ％（例えば約５５ｗｔ％）のパルミチン酸、約２ｗｔ％〜約４ｗｔ％（例えば約３ｗｔ％）のパルミトレイン酸、約１６ｗｔ％〜約２０ｗｔ％（例えば約１８ｗｔ％）のステアリン酸、約９ｗｔ％〜約１３ｗｔ％（例えば約１１ｗｔ％）のオレイン酸、約１ｗｔ％〜約３ｗｔ％（例えば約２ｗｔ％）のエイコサジエン酸、および約６ｗｔ％〜約１０ｗｔ％（例えば約８ｗｔ％）のｎ−３ＥＰＡを含む。
例えばＯＮＣ−Ｔ１８等の真核微生物は、乾燥細胞バイオマスあたり少なくとも約３０ｗｔ％、４０ｗｔ％、５０ｗｔ％、６０ｗｔ％、７０ｗｔ％または８０ｗｔ％（例えば約８０ｗｔ％）の脂質組成物を生産できる。例えば、油産生微生物は、約２５ｗｔ％〜４０ｗｔ％（例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０重量％）のオメガ−３脂肪酸である例えばｎ−３ＤＨＡ、約０〜約３％（例えば少なくとも１または２重量％）のオメガ−３脂肪酸である例えばＥＰＡ、および約４％〜１２％（例えば少なくとも４、５、６、７、８、９または１０重量％）のオメガ−６脂肪酸である例えばｎ−６ＤＰＡ等を含む脂質組成物を生産することができる。
油産生微生物が産生する脂質組成物は、油産生微生物が増殖する生育条件に基づいて操作され得ることが理解される。様々なパラメーターを変えることにより、本明細書に開示のように、組成物を操作して、例えばより高い収率でＤＨＡまたはＤＰＡを生成することができる。例えば、その操作により、より多くのグラム数で製造し得ないかも知れないが、その操作により、ＥＰＡに対するＤＨＡまたはＤＰＡのより良好な比率、および他の所望のＰＵＦＡを製造し得、これは精製の観点から望ましいと思われる。ＤＨＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡの収量を増加するために使用され得る可変条件が本明細書で議論される。
油産生微生物が産生する脂質組成物は、油産生微生物が増殖する生育培地の組成に基づいて操作できることが理解される。炭素と窒素源の比率および型の両方、使用した塩の化学組成を変えることにより、および脂肪酸産生に影響を与える特定の化学化合物を添加することにより、選択された魚油のものと類似した特定の脂肪酸プロファイルが生成され得る。例えば、この操作は、現実のグラム数以上を生成し得ないが、この操作により、例えばタラ肝臓油、マグロまたはカツオ油または典型的な１８:１２魚油のものに類似したＴＦＡプロファイルを生成できる。
１以上の脂肪酸産生アンタゴニストで油産生微生物が増殖する生育培地組成物を補うことによって、油産生微生物により産生される脂肪酸比率を変更する方法が、本明細書に開示されている。該脂肪酸割合は、油産生微生物の全脂肪酸含量の変更を伴うか、または伴わずに変更できる。例えば、オメガｎ−３および／またはｎ−６油対オメガｎ−９油の割合は、油産生微生物の培地を脂肪酸産生アンタゴニストで補うことによって増加され得る。
また、油産生微生物が増殖する生育培地組成物に、１以上の脂肪酸産生アンタゴニストを補うことによって、油産生微生物により産生される全脂肪酸含量を変更させずに、油産生微生物により産生される脂肪酸比率を変更する方法が、本明細書に開示されている。
図１は開示された真核微生物により生産される様々なＰＵＦＡに対する代謝経路を示し、これは脂肪酸メチルエステル代謝物の追跡と矛盾がない。例えば、変性プライマー試験を用いる本発明で開示された経路内で同定できるタンパク質はポリケタイドシンセターゼである（Metzら（2001）、Scinece 293：290−3、およびKaulman & Hertweck（2002）、Angew．Chem．Chem．Int．Ed．41：1866-9）。例えば、ハイブリダイゼーションプローブおよび／または変性または標的化プライマーを用いてエロンガーゼおよびデサチュラーゼも同定できる。また、例えばハイブリダイゼーションプローブおよび／または変性プライマーを用いて脂肪酸シンターゼも同定できる。
４．生育と培養
炭素、窒素（ペプチド窒素）、燐および硫黄、浸透圧およびｐＨを含む表現型マイクロプレートの研究を行った。
最適培地構成および窒素、炭素および塩濃度の変化を決めるために、直交アレー（Taguchi）法を用いた（Joseph & Piganatiells JR（1988）、Trans．20：247-254）。
ＯＮＣ−Ｔ１８を培養する場合に、攪拌またはｄＯ２を増加すれば、バイオマスの生産およびＴＦＡは増えるがＤＨＡは減少することが判った。攪拌またはｄＯ２を減少させれば、細胞バイオマス（ｇ）およびＴＦＡが減少しＤＨＡが増加するが、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１およびＣ１８：１も減少する。
温度を上げた場合、バイオマスの生産およびＴＦＡが増えるがＤＨＡは減少する。温度を下げた場合、細胞バイオマス（ｇ）およびＴＦＡが減少するがＤＨＡは増加し、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１およびＣ１８：１が減少する。
開示された油産生微生物由来の細胞バイオマスを、約２％〜約１００％の海水を含む適当な天然または人工海水培地に接種することにより得ることができる。この油産生微生物は、この培地中の様々な栄養成分を利用することができる。培地中に用いられる炭素源の例は、グルコース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、デンプン（コーンまたはコムギ）等の炭水化物の他、アセテート、ｍ−イノシトール（コーンスティープリカー由来）、ガラクチュロン酸（ペクチン由来）、Ｌ−フコース（ガラクトース由来）、ゲンチオビオース、グルコサミン、α−Ｄ−グルコース−１−燐酸（グルコース由来）、セロビオース（セルロース誘導体）、デキストリン（コーン誘導体）およびα−シクロデキストリン（デンプン由来）等の糖誘導体、マルチトール、エリトリトール、アドニトール等のポリオール、グリセロール等のオレイン酸、ｔｗｅｅｎ８０、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−β−マンノサミン等のアミノ糖である。窒素源の例はペプトン、酵母抽出物、モルト抽出物および魚肉等の天然窒素源、またはグルタミン酸ナトリウム等の有機窒素源であるが、それらに限定されない。さらに、必要であれば燐酸カリウムおよび燐酸ナトリウム等の燐酸塩、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウム、クロム酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガンおよび塩化カルシウム等の無機塩を、微量栄養物として使用し得、キレート化合物であるエチレンジアミン四酢酸を単独またはピリドキシン塩酸塩、チミン塩酸塩、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸およびビタミンＢ１２等のビタミンと組み合わせて使用できる。培地を調製後、ｐＨを酸または塩基を用いて３．０〜１０．０の間、適当な場合は例えばｐＨ４．０〜６．５の間に調節し、例えばオートクレーブによって培地を滅菌する。通気振盪培養、振盪培養、静置培養、バッチ培養、連続培養、ローリングバッチ培養または波動培養等により、４〜３０℃、好ましくは１８〜２８℃の間の温度で１〜３０日間、１〜２１日間、１〜１５日間、１〜１２日間、１〜９日間、または好ましくは３〜５日間、培養を行うことができる。
以下の条件は、１組の脂質を製品として使用可能な収率で生産できる条件の例である。ＯＮＣ−Ｔ１８に対する培養条件の研究から、本明細書で開示した油産生微生物は天然または人工海水中、または５％までの濃度の天然または人工海水を含む培地中でよく生育することが明らかとなった。培地に添加する炭素および窒素源は、上記の様な通常用いられるものであり得る。天然または有機窒素源は相対的に等しく、培地中の全窒素濃度は一定に保たれる。これらの栄養源を標準の濃度で培地に添加する。この様な条件に合致した場合、本発明に開示する様に産生される脂質含有量、蓄積するＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡの比率または量に殆ど影響がない。
ＯＮＣ−Ｔ１８の高濃度培養では、細胞バイオマスと脂質産生率との双方を増加するいくつかの方法を用いることができる。これらには培地中の炭素および窒素濃度（６：１〜１５：１の間の比、好ましくは６：１〜１３：１の間の比、および４〜３０℃、好ましくは１８〜２８℃の間の温度）を、それぞれ５ｇＬ−１〜６０ｇＬ−１の範囲から１００ｇＬ−１〜１６０ｇＬ−１の範囲へ、および４ｇＬ−１〜１０ｇＬ−１の範囲から４０ｇＬ−１〜６０ｇＬ−１の範囲へ増加することが含まれる。この方法を用いると、バイオマスと生産される脂質との比率も同等な比率で増加する。さらに、窒素源を一定にして、５ｇＬ−１〜６０ｇＬ−１の範囲から１００ｇＬ−１〜１６０ｇＬ−１の範囲に増加した炭素源を用いることにより、脂質産生量を増加することが可能である。さらに、炭素源を一定にして、１０ｇＬ−１〜６０ｇＬ−１の範囲から窒素源の量を増加することにより、脂質含有量を維持しながらバイオマス生産量を増加することが可能である。さらに、攪拌を１００〜１０００ｒｐｍの範囲、より好ましくは３５０〜６００ｒｐｍの範囲、最適条件としては３５０〜４５０ｒｐｍの範囲から増加すると、脂質含有量は僅かに減少するのみで脂肪酸プロファイルには変化がなく、バイオマスおよび脂質の生産量が大きく増加することが実験で分かったが、従属栄養培養の初期段階では攪拌が特に重要であった。また、培養培地の溶存酸素量がこれらの微生物の伝統的な供給バッチ培養の脂質蓄積段階中に１〜１０％、最適条件としては５％に維持される場合に、脂質の最適生産が達成されることが実験でも示された。最後に、産生培地（上記のとおり）へのアセテート、微量元素、金属およびビタミンの添加は、全脂質値を減少させずに他の脂肪酸に対するＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡの生産を増加させる。
上記のような従属栄養培養を行うことにより、５ｇ以上の高濃度、より好ましくは２０ｇ／Ｌ培地以上の濃度の高い濃度の培養で（ｎ−３）系のＤＨＡを含む脂質を生成する細胞バイオマスを常に一貫して生成することが可能である（図８参照）。さらに、最大バイオマスレベルに達した後にこれらの脂質の殆どが培養の後期対数期／転移期中に蓄積されることが、実験により示された。しかしながら、培養プロセス中、脂質含有量は典型的には全バイオマスの２５％以下に減少せず、典型的には約８０％で最大になる。上記条件下での培養を通常の攪拌培養器を用いて行うことができる。気泡塔型培養器（バッチまたは連続培養）または波動培養器を使用することも可能である。
脂質分離のために処理する前に、細胞バイオマスの収集を遠心分離（固体排出遠心分離機等）または濾過（クロスフロー濾過等）の様々な通常の方法を用いて行うことができ、細胞バイオマスの収集を促進するための沈殿剤（燐酸ナトリウム、塩化カルシウムまたはポリアクリルアミド等）の使用も含まれ得る。
ａ．脂肪酸産生アンタゴニスト
開示された油産生微生物を生育させるために使用した培地もまた、脂肪酸産生アンタゴニストを含み得る。脂肪酸産生アンタゴニストは、脂肪酸サブユニットまたは脂肪酸経路モジュレーターであり得る。例えば、脂肪酸産生アンタゴニストには、次のものに限定するものではないが、オレイン酸、セルレニン、トルイル酸、クルクミン、シクロプロペン、アルキル没食子酸塩、プロピル没食子酸塩、ゴマ油、ピーナッツ油、キャノーラ油、ピリダジノン、ノルフルラゾン、ジフェニルアミン、セトキシジム、およびカプサイシンが含まれる。
本明細書で使用される「脂肪酸サブユニット」または「脂肪酸サブユニット」とは、開示された油産生微生物についてＰＵＦＡの産生に対する代謝経路に関与する１６、１８、２０、２２または２４個の炭素脂肪酸を指し得る。例えば「脂肪酸サブユニット」は、図１に示したとおり１６、１８、２０、２２または２４個の炭素脂肪酸のいずれかを包含し得る。
本明細書において使用される「脂肪酸サブユニット」とは、開示された油産生微生物についてＰＵＦＡの産生に対する代謝経路に関与する１、２、３、４、５または６個の不飽和物を有する１６、１８、２０、２２または２４個の炭素脂肪酸のいずれかを指し得る。さらなる実施態様は、海洋生物において見出された不飽和物、例えば、１５、１７、１９および２１個の炭素脂肪酸を有するかまたは有さない奇数の炭素脂肪酸を包含し得る。
脂肪酸経路モジュレーターは、開示された油産生微生物についてＰＵＦＡの産生に対する代謝経路に関与する１以上の酵素を阻害出来る化合物であり得る。開示された油産生微生物についてＰＵＦＡの産生のための代謝経路に関与する１以上の酵素の阻害は、特記されなければ、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％阻害である。
脂肪酸経路モジュレーターは、開示された油産生微生物についてＰＵＦＡの産生のための代謝経路に関与する１以上のデサチュラーゼまたはエロンガーゼを阻害出来る化合物であり得る。脂肪酸経路モジュレーターは、開示された油産生微生物のフィトエン・デサチュラーゼ（phytone desaturases）、β-カロテンＣ４-オキシゲナーゼ、脂肪酸シンターゼまたはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを阻害出来る化合物であり得る。
５．脂質の単離
図２は、開示された油産生微生物についての一般的な脂肪酸プロファイルを示す。図５-７は、単独か、またはＬ−グルタメートもしくは酵母抽出物(ＹＥ)、炭素源(単独で)、もしくは様々な抗酸化物質、植物ホルモンもしくは単純炭素源を補充した培地(即ち、全体として窒素および炭素源両方に添加)の存在下の両方において、窒素源に対して、振盪フラスコ内での培養の関数としてのバイオマス(ｇ／Ｌ)、脂質(ＴＦＡ)およびＤＨＡプロファイル含量(両方ｍｇ／ｇバイオマス)を示す。このデータの全ては、開示された油産生微生物についての特異的な特徴を推論するために使用され得る。
（ｎ−３）系のＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡおよび（ｎ−６）系のＤＰＡを含む脂肪を、例えば、磨砕、超音波処理により収集した細胞バイオマスを破壊または崩壊させ、クロロホルム、ヘキサン、メタノール、エタノールなどの溶媒で抽出、または超臨界流体抽出法により得ることができる。乾燥細胞バイオマスのグラムあたりの（ｎ−３）系のＤＨＡおよび（ｎ−６）系のＤＰＡを含む得られた脂肪含有量は、好ましくは０．２５ｇより大きく、より好ましくは０．６ｇより大きい。
開示された油産生微生物には、ＯＣＮ−Ｔ１８等の油産生微生物が含まれるが、その任意の変異体および真核細胞の同種のメンバー間の任意の関連群は、この様にして得られる脂質を生成することが可能であり、その脂質プロファイルは以下の通りである。中性脂質の割合は全脂質の少なくとも９５重量％であり得る。例えば、中性脂質中のＯＮＣ−Ｔ１８に対する典型的な脂肪酸組成は以下の通りである：ミリスチン酸１５％、ペンタデカン酸８％、パルミチン酸３５％、パルミトレイン酸７％、ステアリン酸１％、オレイン酸２％、エイコサペンタエン酸１％、ドコサペンタエン酸６％およびドコサヘキサエン酸２５％。培地への１以上の脂肪酸産生アンタゴニストの添加により、オメガｎ−９油（例えばステアリン酸）に対する、オメガｎ−３およびオメガｎ−６油［例えばドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸およびドコササペンタエン酸（両方ｎ−３およびｎ−６)］の全体の比率が増加され得る。例えば、図１１は、脂肪酸産生アンタゴニストが培地に添加されていないコントロールと比較して、オメガｎ−３とオメガｎ−６油の比率におけるおこりうる変化を示す。別の例示は図１２-１５において見ることが出来る。
ＯＮＣ−Ｔ１８等の開示された油産生微生物、その任意の変異体および同じ種の真核微生物の同じ種のメンバー間の任意の関連群は、この様にして得られる脂質を産生することができ、その脂質プロファイルは以下の通りである。ＯＮＣ−Ｔ１８の中性脂質分画中のモノ、ジおよびトリグリセリドの割合はそれぞれ０〜約２％、０〜約２％および９６〜約１００％である。極性脂質分画は脂質分画の５％〜約１０％であるが、それらにはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよび中性脂質に結合した、または結合しないホスファチジン酸が含まれる。
これらの脂質が生物内の任意の組み合わせまたは置換において見出し得ることが理解される。また、これらの脂質の濃度を、本発明で議論した様な生育条件および培地条件を変化することにより操作し得ることも理解される。
（１）脂質濃度
開示された油産生微生物は、培地１Ｌ当たり約４．０ｇより多いか等しいｎ−３ＤＨＡ、ＥＰＡおよびｎ−６ＤＰＡを含む脂質分画を産生できる。開示された油産生微生物は、培地１Ｌ当たり約２０．０ｇより多いか等しいｎ−３ＤＨＡ、ＥＰＡおよびｎ−６ＤＰＡを含む脂質組成物を産生できる。開示された油産生微生物は、培地１Ｌ当たり約１４．０ｇより多いか等しいｎ−３ＤＨＡ、ＥＰＡおよびｎ−６ＤＰＡを含む脂質組成物を産生できる。開示された油産生微生物は約１．５ｇＬ−１〜約５．０ｇＬ−１（例えば約４．６ｇＬ−１）のｎ−３ＤＨＡ、約０．５ｇＬ−１〜約１．５ｇＬ−１（例えば約０．２２ｇＬ−１）のｎ−３ＥＰＡ、および約０．５ｇＬ−１〜約１．５ｇＬ−１のｎ−６ＤＰＡを生産できる。さらに、開示された油産生微生物は、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、エイコサジエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸を含む脂質分画を、細胞バイオマス１ｇに対し３０１．２〜３６０．３ｍｇの濃度で、または７９０ｍｇの濃度まで産生できる。開示された油産生微生物はまた、４４．３〜５７ｍｇｇ−１のミリスチン酸（１１３４．５〜１４５８．１ｍｇＬ−１に等しい）、０．５〜０．６５ｍｇｇ−１のミリストレイン酸（１３．３〜１６．６３ｍｇＬ−１に等しい）、３３．５〜３４．６ｍｇｇ−１のペンタデカン酸（８５６．９〜８８５．１ｍｇＬ−１に等しい）、１２１．９〜１６５．１ｍｇｇ−１のパルミチン酸（３１１８．２〜４２２３．３ｍｇＬ−１に等しい）、７．９〜２８．５ｍｇｇ−１のパルミトレイン酸（２０２．１〜７２９ｍｇＬ−１に等しい）、４．３８〜５．９ｍｇｇ−１のステアリン酸（１１２〜１５１ｍｇＬ−１に等しい）、６．９４〜９．９ｍｇｇ−１のオレイン酸（１７７．５〜２５３．２ｍｇＬ−１に等しい）、０．４〜１．３ｍｇｇ−１のリノール酸（１１．２６〜３３．３ｍｇＬ−１に等しい）、０．５〜１．０ｍｇｇ−１のエイコサジエン酸（１２．８〜２５．６ｍｇＬ−１に等しい）、０．４〜０．５ｍｇｇ−１のアラキドン酸（１０．２〜１３ｍｇＬ−１に等しい）、７５〜１００ｍｇｇ−１のドコサヘキサエン酸（１９１８〜２５６０ｍｇＬ−１に等しい）、１．９〜６ｍｇｇ−１のエイコサペンタエン酸（４８．６〜１５３．５ｍｇＬ−１に等しい）、および１７．１〜３３．７ｍｇｇ−１のドコサペンタエン酸（４３７．４〜８６２．１ｍｇＬ−１に等しい）を含む、細胞バイオマス内に３０１〜７９０ｍｇｇ−１（７７００〜２０，２０９ｍｇＬ−１に等しい）全脂肪酸含有量を有する分画を生産することができる。
全脂肪酸の％としての脂質：脂肪酸産生のアンタゴニストであるセトキシジムの存在により、脂肪酸組成物を変更することが出来る、例えば１１.２７％〜１０.９７％ミリスチン酸、０.２３％〜０.０３％ミリストレイン酸、３.９２％〜５.５％ペンタデカン酸、０.４３％〜０.５３％ペンタデセン酸、４５.５７％〜４０.５２％パルミチン酸、１１.６３％〜９.１８％パルミトレイン酸、１.１６％〜１.４９％マルガリン酸、１.８４％〜１.４５％ステアリン酸、０.００％〜０.１８％オレイン酸、２.８９％〜２.４８％ バクセン酸、０.３６％〜０.２％アラキジン酸、０.１２％〜０.００％ エイコセン酸、０.３８％〜０.１４％ エイコサジエン酸、０.１４％〜０.１０％ホモ-γ-リノレン酸、０.１３％〜０.２０％ アラキドン酸、終始０.００％エイコサトリエン酸、０.２６％〜０.３７％ エイコサテトラエン酸、０.３８％〜０.７８％ エイコサペンタエン酸、終始０.００％ベヘン酸、１.１２％〜１.０９％ヘネイコサペンタエン酸（heneicosapentaenoic）、０.２０％〜０.００％ドコサジエン酸、０.１６％〜０.００％アドレン酸、３.８８％〜５.２６％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.３５％〜０.２４％ドコサペンタエン酸ｎ−３、終始０.００％リグノセリン酸、１３.５４％〜１９.３１％ドコサヘキサエン酸、終始０.００％ネルボン酸、および０.２７％〜０.２０％ヘキサコサン酸。
全脂肪酸の％としての脂質：脂肪酸産生アンタゴニストであるセルレニンの存在により、脂肪組成を変更することが出来る、例えば１１.１０％〜１１.０３％ミリスチン酸、終始０.００％ミリストレイン酸、３.８４％〜３.２３％ペンタデカン酸、０.１１％〜０.１０％ペンタデセン酸、５０.５２％〜４８.９８％パルミチン酸、１.９３％〜２.２２％パルミトレイン酸、０.８５％〜０.７４％マルガリン酸、１.５５％〜１.８６％ステアリン酸、０.１３％〜０.２９％オレイン酸、０.９３％〜１.２４％バクセン酸、０.３８％〜０.４１％アラキジン酸、０.００％〜０.１９％エイコセン酸、終始０.１７％エイコサジエン酸、０.１５％〜０.２０％ホモ-γ-リノレン酸、０.１６％〜０.３０％アラキドン酸、終始０.００％エイコサトリエン酸、０.３４％〜０.３６％エイコサテトラエン酸、０.７２％〜１.１７％エイコサペンタエン酸、０.１０％〜０.１１％ベヘン酸、１.２７％〜１.２４％ヘネイコサペンタエン酸、０.１３％〜０.１４％ドコサジエン酸、終始０.００％アドレン酸、５.４７％〜５.８３％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.１６％〜０.２３％ドコサペンタエン酸ｎ−３、終始０.００％リグノセリン酸、１９.９８％〜１９.９７％ドコサヘキサエン酸、終始０.００％ネルボン酸、および０.１６％〜０.２３％ヘキサコサン酸である。
全脂肪酸の％としての脂質：脂肪酸産生のアンタゴニストであるオレイン酸の存在により、脂肪酸組成を変更することが出来る、例えば、２４.４６％〜１.３８％のミリスチン酸、０.０３％〜０.００％のミリストオレイン酸、２.４３％〜０.４６％ペンタデカン酸、終始０.００％ペンタデセン酸、４２.８２％〜１６.６７％パルミチン酸、０.４６％〜１.０６％パルミトレイン酸、０.３１％〜０.２８％マルガリン酸、１.２６％〜１.５６％ステアリン酸、０.１５％〜２５.３６％オレイン酸、０.２６％〜２.６８％バクセン酸、０.３６％〜０.００％アラキジン酸、終始０.００％エイコセン酸、０.０６％〜０.５１％エイコサジエン酸、０.１３％〜０.６１％ホモ-γ-リノレン酸、０.２２％〜０.７２％アラキドン酸、終始０.００％エイコサトリエン酸、０.２７％〜０.００％エイコサテトラエン酸、０.６２％〜５.４７％エイコサペンタエン酸、０.１０％〜０.００％ベヘン酸、１.０１％〜０.２０％ヘネイコサペンタエン酸、０.１４％〜０.６８％ドコサジエン酸、０.１４％〜０.６０％アドレン酸、５.８５％〜７.５８％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.１４％〜０.３９％ドコサペンタエン酸ｎ−３、終始０.００％リグノセリン酸、１８.７７％〜３３.１６％ドコサヘキサエン酸、終始０.００％ネルボン酸、および終始０.００％ヘキサコサン酸である。
全脂肪酸の％としての脂質：グルコースとの組合せにおける脂肪酸産生アンタゴニストであるオレイン酸の存在により、脂肪酸組成を変更することが出来る、例えば２４.４６％〜８.０４％ミリスチン酸、０.０３％〜０.００％ミリストレイン酸、２.４３％〜０.７３％ペンタデカン酸、終始０.００％ペンタデセン酸、４２.８２％〜３３.１８％パルミチン酸、０.４６％〜４.２２％パルミトレイン酸、０.３１％〜０.１７％マルガリン酸、１.２６％〜１.６０％ステアリン酸、０.１５％〜９.４９％オレイン酸、０.２６％〜４.４５％バクセン酸、０.３６％〜０.３４％アラキジン酸、０.００％〜０.３０％エイコセン酸、０.０６％〜０.３６％エイコサジエン酸、０.１３％〜０.３０％ホモ-γ-リノレン酸、０.２２％〜０.４６％アラキドン酸、終始０.００％エイコサトリエン酸、０.２７％〜０.２４％エイコサテトラエン酸、０.６２％〜２.６０％エイコサペンタエン酸、０.１０％〜０.００％ベヘン酸、１.０１％〜０.７９％ヘネイコサペンタエン酸、０.１４％〜０.４３％ドコサジエン酸、０.１４％〜０.２８％アドレン酸、５.８５％〜６.４６％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.１４％〜０.３９％ドコサペンタエン酸ｎ−３、終始０.００％リグノセリン酸、１８.７７％〜２４.６５％ドコサヘキサエン酸、終始０.００％ネルボン酸、および終始０.００％ヘキサコサン酸である。
全脂肪酸の％としての脂質:脂肪酸産生アンタゴニストのカプサイシンの存在により、脂肪酸組成を変更することが出来る、例えば９.７％〜２１.８６％ミリスチン酸、０.００％〜０.２８％ミリストレイン酸、９.８３％〜０.９１％ペンタデカン酸、０.１１％〜０.２３％ペンタデセン酸、４３.４８％〜２４.１９％パルミチン酸、１.５２％〜１７.９８％パルミトレイン酸、２.２９％〜０.１９％マルガリン酸、１.５９％〜１.６０％ステアリン酸、０.１０％〜０.００％オレイン酸、１.２７％〜６.６７％バクセン酸、０.２６％〜０.２０％アラキジン酸、終始０.００％エイコセン酸、０.０３％〜０.２３％エイコサジエン酸、０.２５％〜０.２２％ホモ-γ-リノレン酸、０.１７％〜０.７８％アラキドン酸、終始０.００％エイコサトリエン酸、０.３０％〜０.２７％エイコサテトラエン酸、０.４８％〜１.３８％エイコサペンタエン酸、０.０８％〜０.００％ベヘン酸、０.００％〜０.００％ヘネイコサペンタエン酸、０.１３％〜０.１７％ドコサジエン酸、０.０７％〜０.４６％アドレン酸、６.５３％〜５.１９％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.２２％〜０.３１％ドコサペンタエン酸ｎ−３、終始０.００％リグノセリン酸、２１.４８％〜１６.８６％ドコサヘキサエン酸、終始０.００％ネルボン酸、および終始０.００％ヘキサコサン酸である。
全脂肪酸の％としての脂質：脂肪酸産生アンタゴニストのトルイル酸の存在により、脂肪酸組成を変更することが出来る、例えば８.９５％〜１１.１９％ミリスチン酸、終始０.００％ミリストレイン酸、９.７９％〜１４.９３％ペンタデカン酸、０.１３％〜０.２７％ペンタデセン酸、３２.８０％〜２６.９０％パルミチン酸、１.９４％〜２.３６％パルミトレイン酸、１.８９％〜２.６９％マルガリン酸、１.２８％〜１.５９％ステアリン酸、０.１０％〜０.１１％オレイン酸、１.６４％〜３.６８％バクセン酸、０.２２％〜０.２３％アラキジン酸、０.０１％〜０.１４％エイコセン酸、０.２０％〜０.７９％エイコサジエン酸、０.１２％〜０.１７％ホモ-γ-リノレン酸、０.３８％〜０.９０％アラキドン酸、０.０８％〜０.０３％エイコサトリエン酸、０.３８％〜０.３６％エイコサテトラエン酸、１.１６％〜２.９５％エイコサペンタエン酸、終始０.００％ベヘン酸、０.４３％〜０.３９％ヘネイコサペンタエン酸、０.０９％〜０.０６％ドコサジエン酸、０.１９％〜０.４６％アドレン酸、９.４３％〜５.９５％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.２７％〜０.５４％ドコサペンタエン酸ｎ−３、０.０７％〜０.０３％リグノセリン酸、２８.４８％〜２３.０３％ドコサヘキサエン酸、０.０３％〜０.１８％ネルボン酸、および終始０.００％ヘキサコサン酸である。
全脂肪酸の％としての脂質：脂肪酸産生アンタゴニストのノルフルラゾンの存在は、脂肪酸組成を変更することが出来る、例えば１２.３６％〜１１.０８％ミリスチン酸、終始０.１２％ミリストレイン酸、２.７１％〜３.１６％ペンタデカン酸、０.３５％〜０.３３％ペンタデセン酸、４３.２４％〜４０.６１％パルミチン酸、１５.５４％〜１０.６５％パルミトレイン酸、０.８０％〜１.０３％マルガリン酸、１.６１％〜１.５２％ステアリン酸、０.０４％〜０.００％オレイン酸、３.２２％〜３.５３％バクセン酸、０.２３％〜０.１６％アラキジン酸、０.００％〜０.０２％エイコセン酸、０.１５％〜０.１３％エイコサジエン酸、０.１１％〜０.１８％ホモ-γ-リノレン酸、０.１４％〜０.１９％アラキドン酸、終始０.００％エイコサトリエン酸、０.１３％〜０.２４％エイコサテトラエン酸、０.５２％〜０.７６％エイコサペンタエン酸、０.０７％〜０.０５％ベヘン酸、終始０.００％ヘネイコサペンタエン酸、０.１１％〜０.０３％ドコサジエン酸、０.２３％〜０.１７％アドレン酸、３.９８％〜５.２３％ドコサペンタエン酸ｎ−６、０.１３％〜０.１９％ドコサペンタエン酸ｎ−３、０.０９％〜０.００％リグノセリン酸、１４.１３％〜２０.６１％ドコサヘキサエン酸、終始０.００％ネルボン酸、および終始０.００％ヘキサコサン酸である。
（２）他の分子
開示された油産生微生物はさらにカロテノイドとキサントフィルとを産生することができる。この様なカロテノイドおよびキサントフィルの例にはβ−カロテン、リコペン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、フェニコキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノン、βクリプトキサンチン、カプサンチン、ルチン、アナット（annatto）、β−アポ−８−カロテナールおよびβ−アポ−８−カロテナールエステルが含まれる。
開示された油産生微生物が産生するキサントフィルを、開示された油産生微生物によりまた生産される様々なＰＵＦＡと接合させることができる。
（ａ）抗酸化物質
一般に、抗酸化物質は酸素と反応し、典型的には酸素により消費される化合物である。通常、抗酸化物質は酸素と反応するので、抗酸化物質はまた典型的には遊離ラジカル発生剤および遊離ラジカルと反応する（“The Antioxidants-The Nutrients that Guard Your Body”、Richard A．Passwater、PhD、1985、Keats Publishing Inc．、少なくとも抗酸化物質に関連する内容について、本明細書に引用により含める）。組成物は任意の抗酸化物質を含み、その非限定リストにはマルチカロテン、β−カロテン、α−カロテン、γ−カロテン、リコペン、ルテインおよびゼアキサンチン等、セレン、α、βおよびγを含むビタミンＥ［トコフェロール、特にαトコフェロール、ビタミンＥスクシナートおよびトロロックス（trolox）（可溶性ビタミンＥアナログ）］、ビタミンＣ(アスコルビン酸)およびナイアシン（ビタミンＢ３、ニコチン酸およびニコチンアミド）、ビタミンＡ、１３−シス−レチノイン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、アスコルビン酸ナトリウム、ピロリジン-エディチオ-カルバメートおよび補酵素Ｑ１０；Ｈ２Ｏ２および有機過酸化物に作用するグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨＰＸ）、Ｈ２Ｏ２に作用するカタラーゼ（ＣＡＴ）、Ｏ２Ｈ２Ｏ２を不均一化するスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＨＴｘ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、グルコース６燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）およびその類似体、アナログおよびポリマー（ＳＯＤ等の抗酸化酵素のアナログおよびポリマーは例えば米国特許第５，１７１，６８０号に記載され、少なくとも抗酸化物質および抗酸化酵素に関連する内容を本明細書に引用により含める）等のペルオキシダーゼを含む遊離ラジカルの分解を触媒する酵素；グルタチオン；セルロプラスミン；システインおよびシステアミン（βメルカプトエチルアミン）、フラベノイドおよび葉酸および葉酸塩等のフラベノイド様分子を含む遊離ラジカルを直接消去できる非フラボノイド抗酸化物質および栄養剤が含まれるが、それらに限定されない。抗酸化酵素およびその類似体、および抗酸化栄養物質の概説をＫｕｍａｒら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．３９：３０１、１９８８およびＭａｃｈｌｉｎ Ｌ．Ｊ．およびＢｅｎｄｉｃｈ、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、１：４４１−４４５、１９８７に見出すことができ、抗酸化物質に関連する内容について本明細書に引用により含める。
「フェニルクロモン」としても知られるフラボノイドは、抗酸化特性を有する天然起源水溶性化合物である。フラボノイドは維管束植物に広く分布し、様々な野菜、果物および茶およびワイン等の飲料（特に赤ワイン）中に見出される。フラボノイドは接合芳香族化合物である。最も広く見られるフラボノイドはフラボンおよびフラボノール［例えば、ミリセチン、（３，５，７，３’，４’，５’−ヘキサヒドロキシフラボン）、ケルセチン（３，５，７，３’，４’−ペンタヒドロキシフラボン）、ケンフェロール（３，５，７，４’−テトラヒドロキシフラボン）、フラボンアピゲニン（５，７，４’−トリヒドロキシフラボン）、ルテオリン（５，７，３’，４’−テトラヒドロキシフラボン）およびそれらのグリコシドおよびケルセチン］である。
カロテノイドは多くの微生物および植物で生成される重要な天然色素であり、通常その色は赤、オレンジまたは黄色である。伝統的にカロテノイドは飼料、食物および栄養食品産業で使用されてきた。それらは植物の成長および光合成に必須であることが知られ、ヒトにおけるビタミンＡの主な食物源である。カロテノイド等の食物抗酸化物質（β−カロテン、リコピン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、カプサンシン、ルテイン、アンナット、β−アポ−８−カロテナールおよびβ−アポ−８−カロテナールエステル）は顕著な抗癌活性を示し、慢性疾患の予防に重要な役割を果たす。カロテノイドは、一重項酸素の励起エネルギーをカロテノイド鎖上に吸収できる強力な生物学的抗酸化物質であり、カロテノイド分子の劣化をもたらすが他の分子または組織の損傷を防止する。
代謝機能に酸素は必要であるが、細胞を攻撃もする。細胞から酸素派生分子を排除するため、ヒトの体は広範囲の代謝酵素と抗酸化物質とを有する。この酸化ストレスは関節リューマチ、虚血性心臓病および卒中、アルツハイマー痴呆、癌および加齢の病状に寄与する因子であると考えられる。従って、抗酸化物質は広い疾患スペクトルに対し防御する潜在能を有する。海洋微生物源からいくつかの抗酸化物質化合物が単離されているが、それらにはアスタキサンチン、β−カロテンその他のカロテノイドが含まれる。
カロテノイドは天然起源色素の広く分布するグループであり、７００種以上の天然の脂溶性色素が微細藻類、マクロ藻類、バクテリアおよび真菌類により主に生産され、アスタキサンチンおよびその誘導体が商業的に特に関心が高い。アスタキサンチンはきわめて効果的な抗酸化保護剤である。しかし、β−カロテンと異なり、アスタキサンチンは血液−脳／網膜障壁を容易に通過し、従って脳および目の疾患から守る能力がある。前臨床実験は（ｉ）膀胱、結腸、肝臓、乳房および口腔の癌の形成および成長の阻害、（ｉｉ）目の網膜を酸化障害から保護し、加齢に関連する黄斑疾患に対し効果がある、（ｉｉｉ）免疫活性を高める、（ｉｖ）紫外線損傷からの保護を提供する、（ｖ）筋肉の耐久性の増加を提供する等のアスタキサンチンを摂取する様々な有用な効果を示唆している。
（ｂ）微生物の単離
栄養（vegetative）試料を塩水（天然海水または人工海水）中で花粉刺激してインキュベーションする工程と；粒子を分離して従属栄養培地に移しインキュベーションする工程と；脂肪酸を生産する単離体を同定する工程と；同定された単離体からスラウストキトリアセアエ科由来の微生物を単離する工程とを含む方法で得られたスラウストキトリアセアエ科由来の油産生微生物が開示される。単離の別な形式には適当な抗生物質を補充した培地と、上記の顕微鏡法または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーまたはプローブの使用による同定が含まれる。従属栄養培地は以下に記載する通りである。
５．真核微生物により生産される脂質および他の分子
約２５ｗｔ％〜約４０ｗｔ％のｎ−３ＤＨＡ、約６ｗｔ％〜約１０ｗｔ％のｎ−６ＤＰＡおよび約０ｗｔ％〜約１０ｗｔ％のｎ−３ＥＰＡを含む脂質組成物が開示される。
脂質組成物はさらに約１１ｗｔ％〜約１５ｗｔ％（例えば約１３ｗｔ％）のミリスチン酸、約７ｗｔ％〜約１１ｗｔ％(例えば約９ｗｔ％)のペンタデカン酸、約３７ｗｔ％〜約４１ｗｔ％（例えば約３９ｗｔ％）のパルミチン酸、約３ｗｔ％〜約７ｗｔ％（例えば約５ｗｔ％）のパルミトレイン酸、約０ｗｔ％〜約３ｗｔ％（例えば約１ｗｔ％）のステアリン酸、または約１ｗｔ％〜約４ｗｔ％（例えば約２ｗｔ％）のオレイン酸を含むことができる。
脂質組成物はバイオマスの約４００ｍｇを越える濃度のｎ−３ＤＨＡおよびバイオマスの１００ｍｇを越える濃度のｎ−６ＤＨＡを含むことができる。
脂質組成物はさらにカロテノイドを含むことができる。この様なカロテノイドの例にはβ−カロテン、リコピン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、フェニコキサンチン、カプサイシン、ルテイン、アンナット、β−アポ−８−カロテノールおよびβ−アポ−８−カロテノールエステルが含まれる。
ある態様では、組成物は少なくとも約２４ｗｔ％のｎ−３ＤＨＡ、約１ｗｔ％のｎ−３ＤＰＡ、約６ｗｔ％のｎ−６ＤＰＡおよび約１ｗｔ％のｎ−３ＥＰＡを含み得る。
６．真核微生物によって産生される分子を含む組成物
ヒトおよび動物（海洋動物を含む）用の食品、栄養補助剤、医薬組成物は本組成物（脂質、抗酸化物質および脂質または抗酸化物質単独）を含むことができる。
また、本組成物（脂質、抗酸化物質および脂質または抗酸化物質単独）を含む幼児用配合食も開示される。
Ｃ．方法
１．脂質の製造法
脂質組成物の調製方法を開示するが、該方法は、スラウストキトリアセアエ科由来の１つ以上の微生物を含む油産生微生物を培養し、脂質組成物を単離する工程を含んでいる。。
また、脂質組成物を調製する方法を開示するが、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでいる。
また、脂質組成物を調製する方法を開示するが、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニスト、さらに脂質組成物を単離することを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでいる。
また、脂質組成物を調製する方法を開示するが、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでおり、ここでオメガ−９脂肪酸に対するオメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の比率が増加される。
また、脂質組成物を調製する方法を開示するが、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでおり、ここでオメガ−９脂肪酸に対するオメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の比率が、図１１に示されるようにコントロールと比較して変化する。
また、脂質組成物を調製する方法を開示するが、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでおり、ここでオメガ−９脂肪酸に対するオメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の比率が増加され、該全体の脂肪酸含量は変化しない。
また、ＯＮＣ−Ｔ１８の代謝経路に直接影響を及ぼす栄養補助剤、化学刺激物質または阻害剤を用いる、オメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の培養および産生で使用した培養培地またはかかる化学組成物の添加により、例えばＥＰＡ濃度を増加させるように該生物の脂肪酸プロファイルを改変させ得る方法が開示されている。これらの酵素は、エロンガーゼ、デサチュラーゼまたは脂肪酸シンターゼの活性を有するものとして明記する。発明者の知るところでは、これは培養培地と組み合わせた場合に(培養の間中または特定の時点いずれか)脂肪酸プロファイルを改変する化学物質が、具体的に同定された初めての例である。かかる化合物の例示には、この特定微生物の脂質生合成経路内に存在する脂肪酸中間体、例えばオレイン酸(図１４を参照されたい)が包含され、これは培養培地に添加された場合に、該細胞内のＥＰＡ含量の増加をもたらす。
Metzら(2001)の実験データとは反対に、実験ではシゾキトリウム(Schizochytrium)種へのオレイン酸の取込みが記載されていたが、この生成物のポリ不飽和脂肪酸への変換がおこることは見出されなかった。本願の場合では、13Ｃ標識したオレイン酸の使用により、富化したオレイン酸に由来する13Ｃ炭素が、後続のポリ不飽和脂肪酸に見出され、上昇したＥＰＡ濃度の残量に相当した。これは、培養培地中に中間体脂肪酸を導入することにより、細胞への取込みの成功をもたらすだけでなく、活性なデサチュラーゼ、エロンガーゼおよび脂肪酸シンターゼ脂質合成系への導入の成功をももたらすことを示す。
様々な方法を、様々な培地中の培養物から得られた細胞バイオマスの回収に用い得る、例えば濾過または遠心分離等である。次に細胞を洗浄し、凍結、凍結乾燥または噴霧乾燥し、加工食品または飼料製品中に添加する前に残存酸素を除去するために非酸化性雰囲気中で保存される。
（ｎ−３）ＤＨＡ、ＥＰＡおよび（ｎ−６）ＤＰＡ ＰＵＦＡを含む細胞脂質を、超臨界液体抽出またはクロロホルム、ヘキサン、塩化メチレンまたはメタノール等の溶媒抽出法により細胞バイオマスから抽出し、得られた抽出物を減圧下に蒸発させて濃縮脂質材料の試料を製造することができる。脂質を加水分解し、尿素内転または分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の伝統的な方法を用いて、または超臨界液体分画で高度不飽和分画を濃縮することにより、オメガ−３およびオメガ−６ＰＵＦＡをさらに濃縮してよい。細胞を破壊または溶菌に、脂質を植物油または動物油（例えば魚油）中に抽出することもできる。抽出された油を、植物油を精製するために通常用いられる周知の方法で精製することができる（化学的または物理的精製により）。これらの精製プロセスは、それらが食用油として使用または販売される前に抽出油から不純物を除去する。精製後、油を飼料または食品添加物として直接使用し、オメガ−３および／またはオメガ−６強化製品を製造することができる。または、油を以下に概説する様にさらに加工精製し得、上記用途および医薬用途に使用し得る。
強化（濃縮）オメガ−３またはオメガ−６油の他の製造プロセスでは、収集した細胞バイオマス（新鮮または乾燥）を超音波処理、液体剪断破壊法、ビーズミリング、高圧圧縮、凍結解凍または細胞壁の酵素消化等の周知の技法で破裂または浸透させることができる。破壊された細胞から、脂質をヘキサン、クロロホルム、エーテルまたはメタノール等の溶剤または混合溶剤を用いて抽出する。溶剤を除去し、遊離脂肪酸または脂肪酸エステルにトリグリセリドを変換する塩基、酸または酵素加水分解を含む周知の方法を用いて、脂質を加水分解する。加水分解終了後、非鹸化化合物をエーテル、ヘキサンまたはクロロホルム等の溶剤中に抽出し除去する。残った溶液に酸を加えて酸性にし、遊離の脂肪酸をヘキサン、エーテルまたはクロロホルム等の溶剤中に抽出する。遊離脂肪酸を含む溶剤溶液を次に非ＰＵＦＡ化合物が結晶化するに十分な低温に冷却し、結晶を濾過、遠心分離または静置により除去することができる。得られたＰＵＦＡ化合物を濃縮し、ヒトに対する栄養補充剤、食品添加物または医薬用途として使用する。
また、上記の方法により調製した脂質組成物も開示される。
スラウストキトリアセアエ科由来の微生物は上記の任意の微生物であり得る。
（ａ）培地
従属栄養培地は海塩（人工または天然）、１つ以上の炭素源および１つ以上の窒素源を含み得る。海塩の量は約２．０〜約４０．０ｇＬ−１で存在し得る。標準培養条件下（高濃度でなく、コスト効率の良い培養）で用いられる炭素および窒素源の濃度はそれぞれ、５ｇＬ−１〜６０ｇＬ−１および４ｇＬ−１〜１０ｇＬ−１の範囲である。高濃度培養では、標準培養条件下で用いられる炭素および窒素源の濃度はそれぞれ、１００ｇＬ−１〜１６０ｇＬ−１および４０ｇＬ−１〜６０ｇＬ−１の範囲である。油蓄積の方向では、油産生微生物は窒素の供給が約２４〜約４８時間後に制約される培養培地（上記の様な）中で生育するが、炭素は豊富に供給される。この油産生微生物は炭素を同化し続ける（単糖の形で）が、関連するタンパク質と核酸との生成のための窒素を欠くため、細胞分裂を続けることができない。その結果、Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ｃ．（Lipid Tech．16：34−39、2004）により説明され、図１がこの生物に対する現象を図解するとほぼ同様の様式で、これらの糖が貯蔵油に変換される。
窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、モルト抽出物およびグルタミン酸ナトリウムの１つ以上であり得る。窒素源はコーンスティープリカーまたは綿実抽出物でもよい。窒素源は酵母抽出物および／またはペプトンまたはグルタミン酸１ナトリウムを含むことができる。例えば、窒素源はＥＭＤ（商標）ＹＥ−ＭＳＧ、ＥＭＤ（商標）ＹＥ、ＥＭＤ（商標）ペプトン−ＭＳＧ、Sigma（商標）ＹＥ−ＭＳＧ、Sigma（商標）ＹＥ、Fermtech（商標）ＹＥ−ＭＳＧ、Fermtech（商標）ＹＥまたは魚肉（タンパク質６２％）を含み得るが、それらに限定されない。酵母抽出物の量は約２ｇＬ−１であり得る。グルタミン酸１ナトリウムの量は約８ｇＬ−１であり得る。
炭素源はＤ−トレハロース、グリセロール、Ｄ−グルコン酸、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−リボース、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｄ−フルクトース、酢酸塩、酢酸、α−Ｄ−グルコース、マルトース、チミジン、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−キシロース、Ｔｗｅｅｎ４０、α−ケトグルタル酸、スクロース、Ｌ−グルタミン、Ｔｗｅｅｎ８０、βメチル−Ｄ−グルコシド、マルトトリオース、アデノシン、フマル酸、ブロモコハク酸、Ｌ−セリン、Ｄ−セロビオース、Ｌ−アラニルグリシン、ピルビン酸メチル、Ｌ−リンゴ酸、グリシル−Ｌ−プロリン、Ｄ−パルコース、Ｌ−キシロース、ピルビン酸、α−Ｄ−ラクトース、デキストリン、Ｄ−アラビノース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、ゼラチン、デキストロース、デンプン、３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−アラビノース、Ｄ−タガトース、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、オキサロリンゴ酸、ソルビン酸、Ｌ−オルニチンおよびジヒドロキシアセテートの１つ以上であり得る。ある態様では、炭素源はＤ，Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシロース、フマル酸、Ｄ−セロビオース、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、ピルビン酸、α−Ｄ−ラクトース、コーンデキストリン、ゼラチン、コーンデンプンまたはコムギデンプンであり得る。炭素源の量は約１ｇＬ−１〜約６０ｇＬ−１であり、約２００ｇＬ−１までであり得る。
ある例では、該培地は塩水（天然または人工）１リッターあたり約５ｇのＤ−グルコース、約２ｇのペプトンおよび約２ｇの酵母抽出物を含むことができる。他の例では、塩水（天然または人工）１リッターあたり培地は約６０ｇのＤ−グルコース、約１０ｇの酵母抽出物を含むことができる。他の例では、培地は１リッターあたり約８ｇの酵素抽出物、３２ｇのＭＳＧ、２４ｇの海塩（天然または人工）および３００ｇのＤ−グルコースを含むことができる。
培地はさらにリン酸塩（例えば燐酸カリウムおよび燐酸ナトリウム）を含むことができる。培地はさらに無機塩（例えば硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジウム酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン）を含むことができる。培地はさらにキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を含むことができる。培地はさらにビタミン（例えばピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸およびビタミンＢ１２）を含むことができる。培地のｐＨは約４．０〜約６．５であり得る。
インキュベーション時間は約１〜約９日（例えば約３〜約５日）であり得る。インキュベーション温度は約１８〜約３０℃（例えば約８〜約２５℃）であり得る。図８は、ＯＮＣ−Ｔ１８を、１８および２５℃両温度で８８時間流加培養法にて培養槽内で培養した場合、バイオマス産生、細胞のＴＦＡおよびＤＨＡ含量およびグルコース摂取比率の差違を示す。この場合には、該グルコース(または炭素代謝)とＴＦＡとの産生比率は、８.１から３.０に変化する。１８℃では８.１gのグルコースが、１gのＴＦＡを生成するために必要とされるが、一方２５℃では３.０gのグルコースしか必要とされないことを意味する。インキュベーションには、さらに振盪または通気が含まれる。
脂質の単離には微生物を抽出溶剤と接触させる工程が含まれ得る。溶剤はクロロホルム、ヘキサン、メタノールまたはエタノール、または超臨界ＣＯ２から選ばれた１つ以上の溶剤であり得る。
本方法で上記した任意の組成物を製造し得る。
油産生微生物は、ｎ−３ＤＨＡを含む脂質組成物を培地１Ｌ当たり約２０ｇより大きいか等しい濃度で産生できる。油産生微生物はｎ−３ＤＨＡを含む脂質組成物を培地１Ｌ当たり約４０ｇより大きいか等しい濃度で生産できる。油産生微生物はｎ−３ＤＨＡを含む脂質組成物を培地１Ｌあたり約８０ｇＬより大きいか等しい濃度で生産できる。
２．スクリーニングおよび同定法
本明細書に開示した油産生微生物は、（ｎ−３）系のドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸、および（ｎ−６）系のＤＰＡを含む脂質を産生できる。これらの油産生微生物を、例えば以下のスクリーニング法で選択できる。それぞれ３００および５００ｍｇＬ−１でペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、１０ｍｌの滅菌した０．２μｍにて濾過した天然海水を含む２０ｍＬバイアル中に増殖期試料を入れることができる（入れた）。バイアルを滅菌花粉粒で刺激し、１８〜２５℃で４８時間インキュベーションした。次に花粉粒を、抗生物質を含む寒天プレート上に移し（上記の通り）、同じ条件でインキュベーションした。球状またはウミウシ様細胞で構成され、変則的な酵母またはバクテリアコロニー状の単一の不規則なガラス状コロニーをつまみ上げ、上記と同じ培地上および同じ条件下で継代培養した。次に５ｇＬ−１のグルコース、２ｇＬ−１のペプトンおよび２Ｌ−１の酵母抽出物を含む０．２μｍにて濾過した天然海水で調製した栄養液体培地を用いて、これらの単離体を生育および脂肪酸についてスクリーニングし、得られた細胞バイオマスを遠心分離または液体培地内の沈降で集めた。定法を用いてエステル交換により脂肪酸を直接エステル化し、脂肪酸メチルエステル組成をガスクロマトグラフィーで分析し、適当な量のｎ−３系のＤＨＡおよびｎ−６系のＤＰＡを生産する株を以後の実験のために選択した。
油産生微生物を同定する方法を開示するが、その方法は塩水（天然または人工）中の増殖期試料（vegetative sample）を花粉粒で刺激し、インキュベーションする工程と；粒子を従属栄養培地に移しインキュベーションする工程と；脂肪酸を生産する単離体を同定する工程とを有する。
上記の同定された油産生微生物により生産される脂質組成物も開示される。
本発明に開示した油産生微生物を用いる方法と本発明に開示した方法とで生産される脂質組成物も開示される。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＰＴＡ−６２４５を有する油産生微生物も開示される。
配列番号１等の１８Ｓ ｒＲＮＡを有し、スラウストキトリウム種であると同定されたスラウストキトリアレス目（ＯＮＣ−Ｔ１８）に属する油産生微生物も開示される。
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３７４１４９等の１８Ｓ ｒＲＮＡを有し、スラウストキトリウム種であると同定されたスラウストキトリアレス目（ＯＮＣ−Ｔ１８）に属する油産生微生物も開示される。
それぞれ４００ｍｇＬ−１および１００ｍｇＬ−１を越える濃度でＤＨＡおよびＤＰＡを生産し得るスラウストキトリウム種の油産生微生物も開示される。
上記の様な従属栄養培養によりカロテノイドを５０〜１２５０ｍｇｋｇ−１の範囲で、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネニンおよびβ−カロテンをそれぞれ１〜２０ｍｇｋｇ−１、０．２５〜１０ｍｇｋｇ−１、１〜２０ｍｇｋｇ−１、１〜２０ｍｇｋｇ−１および１〜２００ｍｇｋｇ−１の範囲で産生できる油産生微生物スラウストキトリウム種も開示される。
人工海水（栄養海水）としての２．０〜１５．０ｇＬ−１の塩化ナトリウム、それぞれ酵母抽出物およびグルタミン酸１ナトリウムとしての２．０〜８．０ｇＬ−１の窒素源、およびグルコースとしての１３０ｇｌ−１までの炭素源を含む培地を有する条件下で、油産生微生物を培養する工程を有する油産生微生物の培養プロセスも開示される。また、人工海水（栄養海水）としての２．０〜１５．０ｇＬ−１の塩化ナトリウム、それぞれ酵母抽出物およびグルタミン酸１ナトリウムとしての２．０〜８．０ｇＬ−１の窒素源、およびグルコースとしての１３０ｇＬ−１までの炭素源を含み、さらに１以上の脂肪酸アンタゴニストを含む培地を有する条件下で、油産生微生物を培養する工程を有する油産生微生物の培養プロセスも開示される。
開示されたプロセスにより、例えば、全脂肪酸の少なくとも２４重量％がＤＨＡであり、少なくとも６重量％がＤＰＡであり、少なくとも１重量％がＥＰＡである、ＯＮＣ−Ｔ１８を生育することができる。
また、開示された生育プロセスにより、例えば少なくとも１重量％がカロテノイド材であり、その１〜２重量％、少なくとも１．２重量％はアスタキサンチンであり、０．２５〜１重量％、少なくとも０．４５重量％はゼアキサンチンであり、５〜１６重量％、少なくとも９重量％はカンタキサンチンであり、１〜２重量％、少なくとも１．２重量%はエキネノンであり、１２〜１６重量％、少なくとも１４重量％はβ−カロテンである様に、ＯＮＣ−Ｔ１８を生育することもできる。
３．核酸
例えば、ｒＲＮＡをコードする核酸を含む核酸塩基の他、本明細書で開示されるその他のタンパク質および様々な機能性核酸等の様々な分子が本明細書に開示される。開示された核酸は例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換体で構成される。これらの、および他の分子の非限定例を本明細書で議論する。例えば、あるベクターが細胞中で発現した場合、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵ／Ｔで構成されることが理解される。同様に、例えばアンチセンス分子が例えば外因性送達で細胞または細胞環境中に導入された場合、細胞環境中でアンチセンス分子の分解を減少するヌクレオチドアナログでアンチセンス分子が構成されることが有利であることが理解される。
（ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは塩基部分、糖部分および燐酸部分を有する分子である。ヌクレオチドをその燐酸部分で相互に結合し、糖部分がヌクレオシド間結合を生成することができる。ヌクレオチドの塩基部分はアデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分はリボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドの燐酸部分は５価の燐酸である。ヌクレオチドの非限定的な例示は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシンモノホスフェート）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシンモノホスフェート）である。
ヌクレオチドアナログは塩基、糖または燐酸部分にあるタイプの修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は周知であり、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニンの他、糖または燐酸部分に対する修飾も含まれる。
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドと類似の機能性を有するが、燐酸部分を含まない分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン・クリックまたはHoogsteen方式で核酸を認識するが、燐酸部分以外の部分を介して一緒に結合される分子である。ヌクレオチド置換体は、適当な標的核酸と相互作用する場合、二重ヘリックス型に適合できる。
例えば細胞取り込みを促進するために、他のタイプの分子をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと結合（接合）することが可能である。接合体をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に結合することができる。この様な接合体にはコレステロール部分等の脂質部分が含まれるが、それに限定されない（Letsingerら、Proc．Natl．Acad．sci．USA、86：6553−6556、1989）。
ワトソン・クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換体のワトソン・クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換体のワトソン・クリック面にはプリン系ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ１およびＣ６位、およびピリミジン系ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ３およびＣ４位が含まれる。
フーグステイン（Hoogsteen）相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝中に暴露されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのフーグステイン面上でおこる相互作用である。フーグステイン面にはプリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応基（ＮＨ２またはＯ）が含まれる。
（ｂ）配列
例えば配列番号１に関連する配列の他、Ｇｅｎｂａｎｋで開示され得る本発明に記載の他の核酸およびタンパク質は様々であり、これらの配列および他の配列は、その全体、に加えてその中に含まれる個々の部分配列についても引用により本明細書に含める。
様々な配列が本明細書で提供され、それらはｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖでＧｅｎｂａｎｋ中に見出される。当業者は配列の矛盾および差異をどのようにして解決し、特定の配列に関連する組成物および方法を他の関連する配列にどのようにして合わせるかを理解している。本発明に開示され、公知である情報が与えられると、いずれの配列に対してもプライマーおよび／またはプローブを設計することができる。
（ｃ）プライマーおよびプローブ
本明細書に開示した遺伝子と相互作用し得るプライマーおよびプローブを含む組成物は開示される。ある実施形態では、プライマーはＤＮＡ増幅反応を支援するために用いられる。典型的には、プライマーは配列特異的様式で延長できる。配列特異的様式におけるプライマー延長には、核酸分子の配列および／または組成に、該プライマーがハイブリダイゼーションするか、または直接会合するかまたはプライマーの延長により生成する産物の組成または配列に影響するあらゆる方法が含まれる。従って、配列特異的プライマー延長にはＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ延長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写または逆転写が含まれるが、それらに限定されない。配列特異的にプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。ある態様では、プライマーを本発明で述べるスラウストキトリウムに対する種または属特異的プローブとして使用し得る。この場合、真核微生物に特異的である様にプライマーを設計し、その後ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ生成物がうまく得られた場合、標的種の存在が決定されたと考えられる。ある態様ではプライマーをＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応または直接配列決定に用いることができる。ある態様ではプライマーを、非酵素的技術を用いても延長でき、例えばプライマーを延長するために用いたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、それらが化学的に反応してプライマーを配列特異的に延長する様に修飾されることが理解される。典型的には、開示されたプライマーは核酸または核酸領域とハイブリダイゼーションするか、または核酸の相補体または核酸領域の相補体とハイブリダイゼーションする。
（ｄ）核酸の送達
被検体の細胞中へ外因性ＤＮＡの投与または取り込みを含む上記の方法（すなわち遺伝子導入またはトランスフェクト）で、開示された核酸は、そのままのＤＮＡまたはＲＮＡの形態にあるか、または核酸を細胞に送達するためのベクター中に存在し得、当業者には十分に理解されるであろうが、抗体をコードするＤＮＡ断片はプロモーターの転写制御下にある。ベクターはアデノウイルスベクター（Quantum Biotechnologies、Inc．（Laval、Quebec、Canada））等の市販製剤であり得る。核酸またはベクターの細胞への送達は様々なメカニズムを介して可能である。１つの例として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（GIBCO-BRL、Inc．、Gaithersburg、MD）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Quiagen、Inc．、Hilden、Germany）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Promega Biotecc Inc．、Madison、WI）の他、当業界の標準法に従って開発されたリポソーム等の市販リポソーム製剤を用いるリポソームで行われる。さらに、開示された核酸またはベクターをエレクトロポーレーションによりインビボで送達できるが、そのための技術はＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．（San Diego、CA）から入手し得る他、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（imarx Pharmaceutical Co．、Tuscon、AZ）により行うことができる。
１つの例として、ベクターの送達を、組み替えレトロウイルスゲノムを含み得るレトロウイルスベクター系等のウイルス系で行うことができる（Pastanら、Proc．Natl．Acad．sci．USA、85：4486、1988；Mullerら、Mol．Cell Biol．6：2895、1986を参照）。次いで組み替えレトロウイルスを使用して感染させ、それにより広く中和する抗体をコードする核酸（またはその活性断片）を感染細胞に送達する。変化させた核酸を哺乳類細胞中へ導入する正確な方法は、当然レトロウイルスベクターの使用のみに限定されない。アデノウイルスベクター（Mitaniら、Hum．Gene Ther．5：941−948、1944）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Goodmanら、Blood84：1492−1500、1994）、レンチウイルスベクター（Naidiniら、Science272：263−267、1966）、シュード型レトロウイルス（Agrawalら、Expr．Hematol．24：738−737、1966）の使用を含め、この方法のために他の技術も広く利用できる。リポソーム送達および受容体媒介および他のエンドサイトーシス過程等の物理的導入法を用いることもできる（例えばSchwartzenbergerら、Blood 87：472−478、1996を参照）。この開示された組成物と方法とを任意の他の通常用いられる遺伝子導入法と組み合わせて使用することができる。
４．発現系
細胞へ送達される核酸は発現制御系を典型的に含む。例えば、ウイルスまたはレトロウイルス系中の挿入遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現制御を助けるためにプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された場所にある場合に機能するＤＮＡ配列（単数または複数）である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素を含み、上流要素と応答エレメントとを含んでよい。
以下に議論する一般的な系に加えて、本明細書に開示される生物で使用できる様々な転写制御系が存在することが理解される。本明細書で開示された微生物は、本明細書で議論する様々な遺伝子、例えばマーカー遺伝子によるか、または他の望ましい特性、例えば増強されたまたは独自の生育特性等を有する遺伝子によりトランスフェクトされ、形質転換できることが理解される。
（ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞中でベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターを、例えばポリオーマウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルス等のウイルスゲノム；または例えばβアクチンプロモーター等の異種哺乳類プロモーター等の様々な起源から得ることができる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製開始点も含むＳＶ４０制限断片として得るのが便利である（Fiersら、Nature、273：113、1978）。ヒトサイロメガロウイルスの最初期プロモーターをＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として得るのが便利である（Greenway、P.J.ら、Gene 18：355-360、1982）。当然、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本発明で有用である。
エンハンサーとは、一般に転写開始部位から一定でない距離で作用するＤＮＡ配列を指し、転写単位に対して５’（Laminis、L．ら、Proc．Natl．Acad．sci．78：993、1981）または３’（Lusky、M．L．ら、Mol．Cell Bio．3：1108、1983）の何れかであり得る。さらに、エンハンサーはイントロン内であるか（Banerji、Ｊ．L．ら、Cell、33：729、1983）、それ自体のコード配列内（Osborne、T．F．ら、Mol．Cell Bio．4：1293、1984）に存在し得る。それらの長さは通常１０〜３００ｂｐであり、シス（ｃｉｓ）で機能する。エンハンサーは近距離のプロモーターからの転写を増加する様に機能する。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答エレメントも含むことが多い。プロモーターは転写の調節を媒介する応答エレメントも含むことができる。エンハンサーは遺伝子発現の調節を決定することが多い。現在では哺乳類遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトタンパク質およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られているが、典型的なエンハンサーは通常の発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを利用する。好ましい例は複製開始点の後ろ側（late side）上のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期エンハンサー、複製開始点の後期側上のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、光またはその機能の引き金となる特定の化学反応により特異的に活性化することができる。系をテトラサイクリンおよびデキサメタゾン等の試薬で調節することができる。γ線等の放射線、またはアルキル化化学療法剤に暴露することにより、ウイルスベクター遺伝子発現を活性化する方法もある。
ある実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は転写される転写ユニットの領域の発現を最大にするための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。ある特定のコンストラクトでは、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、それが特定のタイプの細胞中で特定の時間でのみ発現しても、全ての真核細胞タイプ中で活性である。このタイプの好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーター（６５０ｂｐ）である。他の好ましいプロモーターはＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
全ての特定の調節エレメントをクローニングして、メラノーマ細胞等の特定の細胞型中で選択的に発現する発現ベクターを構築するために使用することができることが示されている。グリア線維性酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞中で遺伝子を選択的に発現するために使用されている。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、動物、ヒトまたは有核細胞）中で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響し得る転写の停止に必要な配列も含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化部分として転写される。３’非翻訳領域には、転写停止部位も含まれる。転写ユニットがポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写されたユニットがプロセシングされ、ｍＲＮＡの様に輸送される可能性を増加することである。発現コンストラクト中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。同種ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子コンストラクト中で使用されることが好ましい。ある転写ユニットでは、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル由来であり、約４００塩基で構成される。転写ユニットが他の標準配列のみを含むか、上記配列と組み合わせた配列を含み、コンストラクトからの発現、またはコンストラクトの安定性を改善することも好ましい。
（ｂ）マーカー
ウイルスベクターはマーカー生成物をコードする核酸配列を含むことができる。マーカー生成物は遺伝子が細胞に送達され、送達された後に発現するかどうかを決定するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子はβ−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子および緑色蛍光タンパク質である。
ある実施形態では、マーカーは選択マーカーであってもよい。哺乳類細胞に対し適当な選択マーカーの例はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイドロマイシンおよびプロミシンである。この様な選択マーカーを哺乳類宿主細胞中へ成功裏に移入した場合、形質転換哺乳類宿主細胞は選択圧力の下に置いた場合も生存することができる。選択的な方法には広く用いられる２つの異なるカテゴリーがある。第１のカテゴリーは細胞の代謝と、補充培地に独立に生育する能力を欠いた突然変異細胞株の使用とに基づいている。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞はチミジンまたはヒポキサンチン等の栄養素の添加なしで生育する能力を持たない。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要なある遺伝子を欠くので、それらは失われたヌクレオチドが補充培地中に提供されなければ生存できない。培地に補足する代わりに、インタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞中に導入し、生育必要条件を変えることもできる。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子にて形質転換されていない個々の細胞は、非補充培地中で生存できないと思われる。
第２のカテゴリーは、任意の型の細胞に用いられ、突然変異細胞系の使用を必要としない選択スキームと呼ばれる優性選択である。これらのスキームは宿主細胞の生育を遅らせる薬品を典型的に使用する。新規遺伝子を有するこれらの細胞は薬剤耐性を有するタンパク質を発現し、選択に打ち勝つと思われる。この様な優性選択の例では、薬剤ネオマイシン（Southern、P．およびBerg、P．、J．Molec．Appl．Genet．、1：327、1982）、マイコフェノール酸（Mulligan、R．C．およびBerg、P．、Science 209：1422、1980）またはハイグロマイシン（Sugden、B．ら、Mol．Cell．Biol．5：410−413、1985）が使用される。この３つの例では、適当な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネクチン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する抵抗性をそれぞれ有するために、真核性制御下にあるバクテリア遺伝子が用いられる。その他の例ではネオマイシンアナログＧ４１８およびプラマイシンが含まれる。
５．ペプチド
（ａ）タンパク質変異体
本明細書で議論する様に、既知であり本明細書に意図する開示された生物タンパク質の突然変異体は多数ある。さらに、既知の機能的なスラウストキトリアレス株に対し、開示された方法および組成物でも機能するスラウストキトリアレス・タンパク質の誘導体が存在する。タンパク質の変異体および誘導体は当業者に十分に理解され、アミノ酸配列の修飾も含まれる。例えば、アミノ酸配列の修飾は典型的には置換、挿入または欠失変異体の１つ以上に分類される。挿入にはアミノおよび／またはカルボキシ末端融合の他、１個または複数個アミノ酸残基の配列間挿入が含まれる。挿入は通常、アミノまたはカルボキシ末端の融合より小さい挿入であり、例えば１〜４残基のオーダーである。実施例に記載される様な免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロ架橋または融合をコードするＤＮＡで形質転換された組み換え細胞培養により、標的配列を免疫原性にするために十分に大きいポリペプチドを融合することにより作成される。欠失の特徴は、タンパク質配列から１つ以上のアミノ酸残基の除去である。典型的には、約２〜６以下の残基がタンパク質分子内の任意の１つの部位にて除かれる。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により作成され、その結果、変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後組み替え細胞培養でそのＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換突然変異体を作成する技術は、例えばＭ１３プライマー突然変異体誘発およびＰＣＲ突然変異体誘発等が周知である。アミノ酸置換は典型的には１個の残基の置換であるが、いくつかの異なった位置で同時に生じることもあり、一方、挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、欠失は約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は好ましくは隣接したペアで生じる、すなわち２個の残基の欠失または２個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはその任意の組み合わせにより最終的なコンストラクトに到達し得る。突然変異は読み取り枠の外に配列を置いてはならず、ｍＲＮＡの２次構造を作成できる相補領域を生成しないことが好ましい。置換変異体とは、少なくとも１個の残基が除去され、その場所へ異なった残基が挿入されたものである。この様な置換は通常、以下の表１、２に従って行われ、保存的置換と呼ばれる。
表２のものより保存性の少ない置換、すなわち（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシート状または螺旋状空間配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する上でその効果がより顕著に異なる残基を選択することにより、機能または免疫的同一性が実質的に変化する。タンパク質の性質に最大の変化を生じると一般に期待される置換は（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニル残基が疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル基に対して（またはそれらにより）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが任意の他の残基に対して（またはそれらにより）置換される；（ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジル基が電気的に陰性の残基、例えばグルタミルまたはアスパルチル基に対して（またはそれらにより）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが側鎖を持たない残基、例えばグリシンに対して（またはグリシンにより）置換される様な置換であると思われるが、この場合、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化に対する部位数を増加することにより変化を生じる。
表１：アミノ酸の略号
Figure 2010511377
 表２：アミノ酸の置換
Figure 2010511377
＊その他は当分野では公知
例えば、１つのアミノ酸残基を生物学的および／または化学的に類似の他のアミノ酸残基で置き換えることは、保存性置換として当業者にはよく知られている。例えば、保存性置換とは１つの疎水性残基を他の残基で、または極性残基を他の残基で置き換えることである。この置換には、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｅ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせが含まれる。各々明白に開示された配列のこの様な保存的に置換された変異体は、本明細書で提供するモザイクポリペプチドの範囲に含まれる。
置換または欠失突然変異体誘発を、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するために用いることができる。システインまたは他の反応性残基の欠失も望ましい。潜在的タンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１つの欠失、または１つの残基のグルタミルまたはヒスチジル残基の置換により行われる。
ある種の翻訳後誘導体化は、組み換え宿主細胞の発現ポリペプチドに対する作用の結果である。グルタミニルまたはアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後に脱アミノ化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基となる。または、これらの残基は若干酸性の条件下に脱アミノ化される。他の翻訳後修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基の燐酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（T．E，Greighton、Proteins:Structure and Molecular Properties、W．H．Freeman & Co．、San Fransisco、pp79-86、1983）、Ｎ−末端アミンのアセチル化およびある場合はＣ−末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
本明細書に開示されたタンパク質の変異体および誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知配列に対する相同性／同一性に関して変異体および誘導体を定義することにより行われる。具体的に開示されるものは、記載した配列に対して少なくとも６０％、７０％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する本明細書に開示されたタンパク質の変異体である。当業者は２つのタンパク質の相同性をどの様に決定するかを容易に理解し得ると思われる。例えば、相同性が最高のレベルになる様に２つの配列を整列した後に、相同性を計算することができる。
相同性を計算する別な方法を、公開されたアルゴリズムにより行うことができる。比較のための最適整列を、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１の局所相同性アルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０の相同性整列アルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＢｕｎｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８の類似性検索法；これらのアルゴリズムの実行（Wisconsin Genetics Software Package、Genetic Computer Group、575 Science Dr．、Madison、WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）；または目視により行うことができる。
同じタイプの相同性を、例えばＺｕｃｋｅｒ、Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２、１９８９；Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：７７０６−７７１０、１９８９；Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｍｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６、１９８９に開示されたアルゴリズムにより得ることができる。これらは少なくとも核酸整列に関連する内容に対して本明細書に含める。
保存性突然変異および相同性の記載を、特定の配列に対し少なくとも７０％の相同性を有するが、それらの変異体は保存性突然変異体である実施形態等の任意の組み合わせで行うことができることが理解される。
本出願は様々なタンパク質およびタンパク質配列を議論するが、これらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も開示されていることが理解される。これには特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわちある特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸の他、開示された変異体をコードする縮重核酸およびそのタンパク質配列の誘導体が含まれる。従って、特定の核酸配列のそれぞれを本明細書に列記しないが、各配列および全ての配列が、開示されたタンパク質配列によって実際に本明細書に開示され記載されていることが理解される。どの特定のＤＮＡ配列が生物中のタンパク質をコードするかをアミノ酸配列は示さないが、開示されたタンパク質の特定の変異体が本発明に開示されている場合、そのタンパク質が由来する特定の株中のその蛋白をコードする既知の核酸配列も知られており、本明細書に開示され記載されていることが理解される。
開示された組成物に含まれ得る様々なアミノ酸およびペプチドアナログがあることが理解される。例えば、Ｄ−アミノ酸または異なった官能置換基を有するアミノ酸が存在し、それらのアミノ酸は表１および２に示されている。天然起源ペプチドの反対の立体異性体の他、ペプチドアナログの立体異性体も開示されている。選んだアミノ酸と共にｔＲＮＡ分子を加え、例えばアンバーコドンを利用する遺伝子コンストラクトを操作してアナログアミノ酸を部位特異的にペプチド鎖中に挿入することにより、これらのアミノ酸を容易にポリペプチド鎖中に取り込むことができる（Thorsonら、Methods in Mol．Biol．77：43−73、1991；Zoller、Curr．Opin．Biotech．3：348−354、1992；Ibba、Biotech．Genet．Eng．13：197−216、1995；Cahillら、Trends Biochem．Sci．、14：400−403、1989；Benner、Trends Biotechnol．12：158−163、1994、少なくともアミノ酸アナログに関連する内容について、これらは全て本明細書に引用により含まれる）。
ペプチドに類似するが、天然のペプチド結合で結合していない分子を製造できる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログに対する結合にはＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨＨ２ＳＯ２（これらはSpatola、A．F、Chemistry and Biotechnology OF Amino Acids、Peptides、and Protein、B．Weinstein 編集、Marcel Decker、New York、p267、1983；Spotola、A．F．、Vega Data（March 1983）、Vol I、第3版、Peptide Backbone Modifications（レビュー）；Morley、Trends Pharm．Sci．463−468、1980；Hudson D．ら、Int J Pept．Prot．Res．14：177−185、1979（−ＣＨ２−ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Spatolaら、Life Sci．38：1243−1249、1986（−ＣＨ２Ｈ２−Ｓ−）；Hann、J．Chem．Soc．Perkin Trans．I 307−324、1982（−ＣＨ＝ＣＨ−、シスおよびトランス）；Almquistら、J．Med．Chem．23：1392−1398、1980（−ＣＯＣＨ２−）；Jenning-Whiteら、Tetrahedron Lett．、23：2533、1982（−ＣＯＣＨ２−）；Szelkeら、European Appln．、EP45665、CA:97：39405、1982（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Holladayら、Tetrahedron Lett．24：4401−4404、1983（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびHruby、Life Sci．31：189−199、1982（−ＣＨ２−Ｓ−）に見出され、そのそれぞれを本明細書に引用により含める）が含まれる。特に好ましい非ペプチド結合はＣＨ２ＮＨ−である。β−アラニン、γ−アミノ酪酸等、ペプチドアナログは結合原子間に１つ以上の原子を持ち得ることが理解される。
アミノ酸アナログおよびアナログならびにペプチドアナログは、強化された、または望ましい性質、例えばより経済的な製造、より高い化学安定性、薬学的効果の増大（半減期、吸収、力価、効力等）、特異性の変化（例えば生物活性の広いスペクトル）、抗原性の減少その他の性質を持つことが多い。
Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼ等で認識されないため、より安定なペプチドを作成するためにＤ−アミノ酸を使用することができる。共通配列の１つ以上のアミノ酸を同じタイプのＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）により系統的に置換することにより、より安定なペプチドを生成することができる。２以上のペプチドを一緒に、環化または結合させるためにシステイン残基を使用できる。これは特定の空間配置内にペプチドを閉じ込めるために有益である（Rizo and Gierash、Ann．Rev．Biotech．61：387、1992、引用により本明細書に含める）。
６．補助剤
本明細書には栄養補助剤も開示される。栄養補助剤は栄養素（単数または複数）（例えばビタミン、ミネラル、必須微量元素、アミノ酸、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、コレステロール、ステロイド、炭水化物等）を提供、補給または増加するために被検体に投与または服用される任意の化合物または組成物である。ある態様では、本明細書で開示した任意の化合物を含む栄養補助剤が開示される。例えば、栄養補助剤は本明細書で開示した任意の脂質を含むことができる。これらの脂質の脂肪酸残基は本明細書で開示した任意の脂肪酸であり得る（例えば不飽和または飽和脂肪酸残基）。
栄養補助剤は本明細書に開示した任意の量の化合物を含むことができるが、典型的には被検体に所望の用量のベンゼンジオール誘導体（例えばＣｏＱ１０）および／または脂肪酸を供給するために決定された量を含む。栄養補助剤中に必要な正確な化合物の量は、種、年齢、体重および被検体の全般的な状態、処置される栄養欠陥の重症度、具体的な投与法等によって被検体間で変化すると思われる。従って、全ての栄養補助剤に対して正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、本発明の知見が与えられれば日常的な実験を用いて当業者は適量を決定することができる。ある具体例では、栄養補助剤は約０．０５〜約２０重量％、約１〜約７．５重量％、または約３〜約５重量％の化合物を含み得る。他の例では、栄養補助剤は、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０，７０、０．７５、０．８０．０．８５、０．９０．０．９５、１．０．１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５，０、５．５、６．０、６．５、７．０．７．５、８．０．８．５、９．０、９．５、１０．１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０重量％を含むことができ、ここで述べた任意の値は適当と思われる上限または下限を形成する。他の態様では、栄養補助剤を１００％までの補助剤で構成することができる。
栄養補助剤はまた、ビタミン、微量元素、ミネラル等の他の栄養素（単数または複数）を含むことができる。さらに、栄養補助剤は保存剤、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤および/または結合剤等の他の成分を含むことができる。
栄養補助剤は一般に経口服用され、経口投与に適した任意の形態であり得る。例えば、栄養補助剤は典型的には錠剤、ゲルキャップ、カプセル、液体、小袋またはシロップの形であり得る。
７．送達手段
本発明に記載の任意の化合物を送達手段中に導入することができる。送達手段の例にはマイクロカプセル、ミクロ球体、ナノ球体またはナノ粒子、リポソーム、ノイソーム、ナノエリスロソーム、液体−固体ナノ粒子、ゲル、ゲルカプセル、錠剤、ローション、クリーム、スプレーまたは乳液が含まれるがそれらに限定されない。非経口投与に適した送達手段の他の例にはパルモスフェアが含まれる。本発明で有用な粒子状送達手段の例は以下に記載される。
開示された化合物をリポソーム中に導入することができる。公知の様に、リポソームは一般にリン脂質または他の脂質物質由来である。リポソームは水性媒体中に分散した一重または多重ラメラ水和液晶により生成する。リポソームを形成できる任意の無毒で生理学的に許容され、代謝し得る脂質を使用することができる。リポソーム形態の開示された組成物には、本明細書で開示した化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤等を含むことができる。安定な脂質の例は天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームの形成法は公知である。例えばＰｒｅｓｃｏｔｔ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ３３他、１９７６参照。リポソームおよびその調製の知見に関して、本明細書に引用により含める。
他の例では、リポソームは陽イオン性リポソーム（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣコレステロール）または陰イオン性リポソームであり得る。必要あれば特定の細胞を標的化することを促進するために、リポソームはさらにタンパク質を含むことができる。ある化合物と陽イオン性リポソームとを含む組成物を、標的器官を目標に血液中に投与するか、または気道の細胞を標的とするために気道中に吸入することができる。リポソームに関しては、例えばＢｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１：９５−１００、１９８９；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４：７４１３−７、１９８７；および米国特許第４，８９７，３５５号を参照。リポソームの知見に関して本明細書に引用により含める。一例として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（GIBCO-BRL Inc．、Gaitherburg、MD）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Qiagen Inc．、Madison、WI）の他、当業界で標準の手順に従って開発された他のリポソーム等の市販リポソームを用いてリポソーム経由で送達することができる。リポソームからの化合物の拡散または送達が特定の速度または投与量に対して設計されたリポソームを用いることもできる。
本明細書に記載のように、ノイソームは本明細書に開示した組成物を送達するために使用される送達手段である。ノイソームは非イオン性界面活性剤を含む多重ミセルまたは単一ミセル小胞体である。溶質の水溶液が界面活性剤分子の組織に由来する２重層に封じ込められている。リポソームと同様、ノイソームは、例えばメトトレキサン、ドキソルビシンを含む抗癌剤、および免疫アジュバントの標的送達に用いられる。それらは一般にトランスフェロソームとは異なると考えられ、両親媒性炭水化物およびアミノ基含有ポリマー、例えばキトサンから調製される小胞体である。
本明細書に記載のように、ナノエリスロソームは本明細書に開示した組成物を送達するために用いることのできる送達手段である。ナノエリスロソームは一定の孔径のフィルターを通る透析により調製された赤血球で作成されたナノ小胞体である。これらの小胞体に、タンパク質および本明細書に開示された組成物を含む広範囲の生物活性分子を乗せることができる。それらは一般にブレオマイシン、アクチノマイシンＤ等の抗腫瘍剤に対する理想的な担体となるが、ステロイド、他の脂質等にも使用できる。
本明細書に記載のように、人工赤血球も、本明細書に開示した組成物を送達するために使用できる送達手段である。人工赤血球も、界面重合および複合乳化法で作成することができる。一般に、「細胞」壁をポリフタロイル−Ｌ−リジンポリマー／ポリスチレンで作成し、コアをヒツジ溶血物由来のヘモグロビン溶液で生成する。ヘモグロビン搭載ミクロ球体の典型的な粒径は約１〜約１０ｎｍである。そのサイズ、柔軟性および酸素運搬能は赤血球に類似している。
本明細書に記載のように、固体−脂質ナノ粒子は、本発明に開示した組成物を送達するために使用し得るまた別の送達手段である。固体−脂質ナノ粒子は界面活性剤水溶液中に分散されたナノ粒子である。ナノ粒子はリン脂質被覆の単層を有する疎水性コアで構成され、通常、高圧均質化技術で調製される。免疫調節複合体（ＩＳＣＯＭＳ）は固体−脂質ナノ粒子の例である。ナノ粒子はリン脂質、コレステロールおよび疎水性抗原で構成されるカゴ状の４０ｎｍの超分子集合体であり、ほとんど免疫アジュバントとして使用される。例えば、ＩＳＣＯＭＳは皮下注射シクロスポリンの血漿レベルを延長するために使用される。
本明細書に記載のように、ミクロ球体およびマイクロカプセルとは、本明細書に開示した組成物を送達するために用いることのできるまた別の送達手段である。リポソーム送達系とは対照的に、ミクロ球体およびマイクロカプセルは典型的には水性コアを持たず、固体ポリマーマトリックスまたは膜である。これらの送達手段はポリマーの制御された沈殿、可溶性ポリマーの化学的架橋、および２つのモノマーの界面重合、または高圧均一化技術で得られる。カプセル化化合物は、粒子からの侵食または拡散により貯蔵場所から徐々に放出される。作用時間の短いペプチド、例えば、ロイプロレリンおよびトリプトレインのようなＬＨＲＨアゴニスト等の製剤化の開発に成功している。ポリラクチド−コ−グリコライド（ＰＬＧＡ）ミクロ球体は、進行型前立腺癌、子宮内膜症および他のホルモン応答性病状の治療における１月または３月投与製剤として現在使用されている。ＬＨＲＨスーパーアゴニストであるリュープロライドが、溶剤抽出／蒸発法を用いる様々なＰＬＧＡマトリックス中に取り込まれた。この様に、これらの送達手段を全て本明細書に開示の方法に用いることができる。
パルモスフェアは本発明で用いることのできる送達手段のまた別の例である。パルモスフェアは、密度の低い（約０．１ｍ／ｍＬ以下）中空多孔性粒子である。パルモスフェアは典型的に優れた再分散性を有し、通常は超臨界液体濃縮法で調製される。炭水化物、ヒト血清アルブミン等のあるマトリックスとの共スプレー乾燥は、タンパク質およびペプチド（例えばインスリン）、および肺送達用の他の生物分子の安定性を改善することができる。このタイプの送達を、機械的エネルギーを殆ど加えることなく自発的に生成する微小の薄い透明な水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンであるミクロエマルジョンおよび脂質エマルジョンで行うこともできる。この技術で、系の相反転温度より高い温度でエマルジョンを調製することができる。高い温度では、エマルジョンは油中水（ｗ／ｏ）タイプであり、相反転温度に冷却するとこのエマルジョンは反転してｏ／ｗとなる。その内部相が非常に小さいので、エマルジョンはきわめて安定であり、ステロイドおよびワクチンの持続放出に用いられる。脂質エマルジョンは、卵レシチントリグリセリドおよびミグリトールのような界面活性剤を用いる両親媒性脂質（すなわちリン脂質）の単層により安定化した中性脂質コア（すなわちトリグリセリド）を有する。それらは能動および受動標的化に適している。
浸透圧調節、ｐＨ調節、膨潤調節、密度および浮遊系の変化、皮膚粘着性等に基づく調査において、他の経口送達系がある。現在使用中または調査中の疾患の日周リズムに従う薬剤を送達するためのこれらの製剤、および時間遅延製剤を、本発明に開示の組成物の送達のために応用することができる。
本明細書に開示されたある態様では、栄養補助剤およびその医薬製剤を含む開示された化合物を、本明細書に記載のマイクロカプセル中に取り込むことができる。
本明細書に記載のある態様では、開示された化合物をマイクロカプセル中に導入することができる。ある態様では、マイクロカプセルは１次マイクロカプセルと本明細書に記載のクロム化合物との凝集体を有し、個々の１次マイクロカプセルは１次殻を有し、クロム化合物は１次殻でカプセル化され、凝集体は外殻でカプセル化されている。これらのマイクロカプセルを本明細書では「多重核マイクロカプセル」と称する。
他の態様では、クロム化合物、１次殻および２次殻を有するマイクロカプセルが本明細書に記載され、１次殻がクロム化合物をカプセル化し、２次殻が担持物質と１次殻とをカプセル化している。これらのマイクロカプセルを本明細書で「単一核マイクロカプセル」と称する。
所望により、他の担持物質をクロム化合物とともにカプセル化することができる。担持物質は水性混合物中に完全に溶解しない任意の物質であり得る。ある態様では、担持物質は固体、疎水性液体または固体と疎水性液体との混合物である。他の態様では、担持物質はグリース、油、脂質、薬物（例えば低分子）、生物活性物質、栄養補助剤（例えばビタミン）、風味化合物またはそれらの混合物を含む。油の例には動物油（例えば魚油、海洋動物油）、植物油（例えばカノーラ油またはナタネ油）、鉱物油、その誘導体またはその混合物が含まれるが、それらに限定されない。担持物質は脂肪酸、トリグリセリドまたはそのエステル等の精製または部分精製油状物質であってよい。他の態様では、担持物質はカロテノイド（例えばリコピン）、満腹剤、風味化合物、薬剤（例えば水不溶性薬剤）、粒状体、農薬（例えば除草剤、殺虫剤、肥料）または水産養殖成分（例えば餌、色素）であってよい。
ある態様では、担持物質はオメガ−３−脂肪酸であり得る。オメガ−３−脂肪酸の例にはα−リノレン酸（１８：３ｎ３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４ｎ３）、エイコサペンタエン酸（２０：５ｎ３、ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３、ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ３、ＥＰＡ）、エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ３）、ウンコサペンタエン酸（２１：５ｎ３）、ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ３）、およびそれらの誘導体および混合物が含まれるが、それらに限定されない。オメガ−３−脂肪酸の多くのタイプの誘導体は当分野では公知である。適当な誘導体の例には植物ステロールエステル、分枝または非分枝Ｃ１−Ｃ３０アルキルエステル、分枝または非分枝Ｃ２−Ｃ３０アルケニルエステル、または植物ステロールエステル等の分枝または非分枝Ｃ３−Ｃ３０シクロアルキルエステル、およびＣ１−Ｃ６アルキルエステル等のエステルが含まれるが、それらに限定されない。油の源は水棲生物（例えばアンチョビ、シシャモ、大西洋タラ、大西洋ニシン、大西洋サバ、大西洋メンヘーデン、サケ類、イワシ、サメ、マグロ等）、および植物（亜麻、野菜等）および微生物（例えば真菌類および藻類）由来であり得る。
ある態様では、担持物質は抗酸化物質を含むことができる。抗酸化物質の例にはビタミンＥ、ＣｏＱ１０、トコフェロール、アスコルビル脂肪酸エステル等のより極性の高い抗酸化物質の脂溶性誘導体（例えばパルミチン酸アスコルビル）、植物抽出物（例えばローズマリー、セージおよびオレガノ油）、藻類抽出物、および合成抗酸化物質（例えばＢＨＴ、ＴＢＨＱ、エトキシキン、アルキルガレート、ヒドロキノン、トコトリエノール）が含まれるが、それらに限定されない。
多くの異なったポリマーを単一または多重核マイクロカプセルの殻層を製造するために使用できる。この様なポリマーの例にはタンパク質、ポリ燐酸、多糖またはそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。他の態様では、単一または多重核マイクロカプセルを調製するために用いられる殻材料はさらに含む。他の態様では、単一または多重核マイクロカプセルを調製するために用いられる殻材料はさらに、タイプＡゼラチン、タイプＢゼラチン、ポリ燐酸、アラビアゴム、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、ペクチン、デンプン、修飾デンプン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトアルブミン、オボアルブミン、ポリソルビトン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ミルクタンパク質、ホエータンパク質、大豆タンパク質、カノーラタンパク質、アルブミン、キチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−コ−グリコライド、誘導体化キチン、キトサン、ポリリジン、様々な無機−有機組成物、またはそれらの任意の混合物を含む。これらのポリマーの誘導体も使用し得ると考えられる。他の態様では、ポリマーはコーシャゼラチン、非コーシャゼラチン、ハラールゼラチンまたは非ハラールゼラチンであり得る。
ある態様では、単一または多重核マイクロカプセルの１つ以上の殻層は、５０未満のブルーム強度を有するゼラチンを含む。このゼラチンは本発明では「低ブルームゼラチン」と称する。ブルーム強度とは、１８時間ゲル化した６．６７％の溶液で１０℃において生成したゲルのゲル強度を言う。ある態様では、低ブルームゼラチンは４０未満、３０未満、２０未満または１０未満のブルーム強度を有する。他の態様では、ゼラチンは４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０のブルーム強度を有し、任意の２つの値を用いて範囲を表すことができる。他の態様では、低ブルームゼラチンは多重核マイクロカプセルの１次殻および外部の両方に含まれる。ある態様では、低ブルームゼラチンはタイプＡゼラチンである。他の態様では、低ブルームゼラチンはＫｅｎｎｅｙ ＆ Ｒｏｓｓ Ｌｔｄ．、Ｒ．Ｒ．＃３ Ａｈｅｌｂｉｌｎｅ、ＮＳ、カナダで製造されたタイプＡゼラチンである。他の態様では、ブルーム強度ゼロを有するゼラチンは多重核マイクロカプセルの１次殻と外殻との双方に含まれる。
ある態様では、単一または多重核マイクロカプセルの殻を生成するために用いられる材料は、２つの異なったタイプのポリマーの混合物で製造される２成分系である。ある態様では、その材料はポリマー成分間の複合コアセルベートである。複合コアセルベート化は２つの反対電荷のポリマー間の相互作用で生じる。ある態様では、単一および多重核マイクロカプセルを製造するために用いられる殻材料は、（１）低ブルームゼラチンおよび（２）タイプＢゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ホエータンパク質、大豆タンパク質、カノーラタンパク質、アルブミン、またはそれらの混合物で構成される。異なったポリマーのモル比は変化し得る。例えば、ブルームゼラチンの他のポリマー成分に対するモル比は１：５〜１５：１である。例えば、低ブルームゼラチンおよびポリ燐酸が用いられる場合、低ブルームゼラチンとポリ燐酸とのモル比は約８：１〜約１２：１であり、低ブル−ムゼラチンおよびタイプＢゼラチンが使用される場合、モル比は２：１〜１：２であり、低ブルームゼラチンおよびアルギン酸塩が使用される場合、モル比は３：１〜８：１である。
加工助剤を殻材料（例えば１次または外殻）に加えることができる。加工助剤は様々な理由で使用される。例えば、加工助剤は、１次マイクロカプセルの凝集体の促進、乳化系の安定化、外殻の性質の改善、マイクロカプセルサイズの制御するために、および／または抗酸化物質作用として作用するために使用できる。ある態様では、加工助剤は乳化剤、脂肪酸、脂質、ワックス、ミクロ微生物細胞（例えば酵母細胞株）、粘土または無機化合物（例えば炭酸カルシウム）であってよい。理論に制約されるものではないが、これらの加工助剤はマイクロカプセルの障壁の性質を改善することができる。ある態様では、１つ以上の抗酸化物質を殻材料に添加することができる。抗酸化性は加工中（例えばコアセルベート化または噴霧乾燥中）およびマイクロカプセル形成後（例えば商品寿命の延長等）の双方で有用である。多数の機能を果たす少数の加工助剤が好ましい。ある態様では、抗酸化物質はフェノール化合物、植物抽出物または硫黄含有アミノ酸であり得る。ある態様では、アスコルビン酸（またはアスコルビン酸ナトリウムまたはカリウム等の塩）を、１次マイクロカプセルの凝集を促進させるのに、マイクロカプセルサイズを制御するのに、および抗酸化物質として作用するのに使用できる。抗酸化物質は、約１００ｐｐｍ〜約１２，０００ｐｐｍ、または約１，０００ｐｐｍ〜約５，０００ｐｐｍの量で使用し得る。例えば金属配位体等の他の加工助剤も使用できる。例えば、エチレンジアミン四酢酸を使用して金属イオンを結合することができる、担持物質の触媒的酸化を減少することができる。
ある態様では、１次マイクロカプセル（１次殻）は約４０ｎｍ〜約１０μｍ、約０．１μｍ〜約１０μｍ、約１μｍ〜約１０μｍ、約１μｍ〜約８μｍ、約１μｍ〜約６μｍ、約１μｍ〜約４μｍ、約１μｍ〜約２μｍ、または約１μｍの平均直径を有する。他の態様では、多重核マイクロカプセルは約１μｍ〜約２，０００μｍ、約２０μｍ〜約１，０００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、または約３０μｍ〜約８０μｍの平均直径を有する。他の態様では、単一核マイクロカプセルは１μｍ〜２，０００μｍの外径を有する。
本明細書に記載のマイクロカプセルは一般に高い有効積載量および構造的強度を有する。例えば、担持物質の有効搭載量は単一または多重マイクロカプセルの２０〜９０重量％、５０〜７０重量％または６０重量％である。
ある態様では、その内容を引用により含める米国特許出願第２００３／０１９３１０２号に開示された方法を、本明細書に記載の藻類脂質をカプセル化するために使用できる。１つ以上の別な殻層を単一または多重核マイクロカプセルの外殻上に置くことができるとも考えられる。ある態様では、その内容を引用により含める国際公報ＷＯ２００４／０４１２５１Ａ１に記載された技術を、単一または多重核マイクロカプセルに対する別の殻層を加えるのに用いることができる。
（ａ）医薬および栄養補助組成物
これらの脂質および抗酸化物質は、動物飼料、医薬品、栄養剤（特に幼児用配合食）の他、工業用が目的である。これにはゲルカプセル等の栄養剤形、一般的なマイクロカプセル化等も含まれる。
上記の通り、組成物を薬学的に許容し得る担体中インビボで投与できる。「薬学的に許容し得る」とは、生物学的またはその他で望ましい材料、すなわち望ましくない生物学的効果を生じず、またはそれが含まれる医薬組成物の他のいずれの成分とも有害な相互作用をせずに、その材料を核酸またはベクターと一緒に被検体に投与し得る材料を意味する。当業者に公知の様に、担体は当然、活性成分の分解を最小にし、被検体中での副作用を最小にする様に選ばれる。
組成物を経口、非経口（経静脈）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮膚、体外循環、局所経鼻投与または吸入投与を含む局所等で投与し得る。本発明で用いる「局所経鼻投与」とは、片方または両方の鼻孔を通って組成物を鼻および鼻通路中へ送達することを意味し、スプレー法または液滴法、または核酸またはベクターのエアゾル化による送達を含む。吸入剤による組成物の投与は噴霧または液滴方法による送達で鼻または口を通って行われ得る。チューブ挿入により、呼吸系（例えば肺）の任意の領域に直接送達することもできる。必要な組成物の正確な量は、種、年齢、被検体の体重および全般的な状態、処置されるアレルギー性疾患の重症度、用いられる特定の核酸またはベクター、投与法等に応じて、被検体によって変わると思われる。従って、全ての組成物に対して正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、本明細書の知見で与えられる通常の実験のみを用いて、当業者は適当な量を決定することができる。
組成物の非経口投与は、使用される場合には、注射によるのが一般的である。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中で懸濁液を調製するに適した固体、またはエマルジョンとしてのいずれかの通常の形式で調製される。非経口投与に対してより最近開発されたアプローチには、一定の投与量が維持される様な遅延放出または持続放出の使用が含まれる。例えば、本明細書に引用により含める米国特許第３、６１０、７９５号を参照。
材料は溶液または懸濁液中に存在し得る（例えばミクロ粒子、リポソームまたは細胞中に取り込まれる）。これらは抗体、受容体または受容体リガンドにより特定の細胞を標的とし得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質が腫瘍組織を標的とするこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２：４４７−４５１、１９９１；Ｂａｇｓｈａｗｅ、Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５−２８１、１９８９；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８：７００−７０３、１９８８；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４：３−９、１９９３；Ｂａｔｔｅｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｎｏｔｈｅｒ．、３２：４２１−４２５、１９９２；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃｋｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７−８０、１９９２；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４２：２０６２−２０６５、１９９１）。「ステルス」、および他の抗体接合リポソーム（結腸癌腫を標的とする脂質媒介薬剤も含む）、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体媒介標的、リンパ球を目的とする腫瘍標的、およびインビボのマウスグリコーマ細胞の特異性の高い治療用レトロウイルス標的等の媒体も含まれる。以下の参考文献は特定のタンパク質が腫瘍組織を標的とするこの技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４−６２２０、１９８９；ＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１１０４：１７９−１８７、１９９２）。一般に、受容体は、構成的に、またはリガンド誘導によりエンドサイトーシスの経路に含まれる。これらの受容体はクラスリン被覆ピット中に集中し、クラスリン被覆小胞体を経由して細胞に入り、受容体が分類される酸性エンドソームを通過し、次に細胞表面に循環するか、細胞内に蓄えられるか、またはリゾソーム中で分解される。内部取り込み経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の整理、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離および分解、および受容体レベルの調節等の様々な機能を果たす。細胞タイプ、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの結合価、およびリガンドの濃度によって、多くの受容体は１つ以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介エンドサイトーシスの分子および細胞機構は以下に概説されている（Brown and Greene、DNA and Cell Biology、10：399−409、1991）。
（１）薬学的に許容し得る担体
抗体を含む組成物を、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて治療用に使用することができる。
適当な担体およびその製剤化はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５に記載されている。典型的には、適当量の薬学的に許容し得る塩を、製剤を等張にするために製剤中で使用する。薬学的に許容し得る担体の例にはリンガー液およびデキストロース溶液が含まれるが、それらに限定されない。溶液のｐＨは約５〜約８であることが好ましく、約７〜約７．５であることがより好ましい。さらに、担体には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、例えばフィルム、リポソームまたはミクロ粒子等の成形物の形態である持続放出製剤も含まれる。例えば投与経路および投与される組成物の濃度によっては、ある特定の担体がより好ましいことは、当業者には明らかであろう。
医薬担体は当業者に公知である。最も典型的には、これらは滅菌水、食塩水および生理ｐＨの緩衝液等の溶液を含む、薬剤をヒトに投与するための標準担体である。該組成物を筋肉内または皮下投与することができる。その他の化合物も、当業者が用いる標準手順に従って投与される。
医薬組成物には担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤等の他、選択した分子が含まれる。医薬組成物には抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等の１つ以上の活性成分も含まれていてよい。
局所または全身治療が必要であるかどうか、および治療されるべき面積に応じて医薬組成物を様々な方法で投与し得る。投与は局所（目、膣、直腸、鼻内を含む）、経口、吸入または非経口で、例えば静脈内点滴、皮下、直腸内または筋肉内注射でもよい。開示された抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腹腔内または皮膚経由で投与できる。
非経口投与用製剤には滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳化液が含まれる。非水溶剤の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体には食塩水および緩衝液を含む水、アルコール性水溶液、乳化液および懸濁液が含まれる。非経口媒体には塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくもの等）等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤および不活性ガス等の保存剤および他の添加剤も含み得る。
局所投与用製剤には軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤等が必要であるか望ましい場合がある。
経口投与用組成物には粉末または顆粒、水または非水媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、小袋または錠剤が含まれる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤も望ましい場合がある。
いくつかの組成物は薬学的に許容し得る酸または塩基付加塩として投与される可能性があり、これらの塩は塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸および燐酸無機酸等の無機酸、ならびに蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、クエン酸、リンゴ酸およびフマル酸等の有機酸との反応、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、およびモノ−、ジ−およびトリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミン等の有機塩基との反応で生成する。
（２）治療用途
組成物を投与するための投与量およびスケジュールを実験的に決定し得るが、この様な決定を行うことは当業者の範囲である。組成物の投与量範囲は、症状に有効な所望の効果得るために十分に大きい範囲である。しかしながら、投与量は望ましくない交差反応、過敏症反応等の副作用を生じるほど多くあってはならない。一般に、投与量は年齢、状態、性別および被検体の疾病の程度、投与経路、または療法に他の薬剤が含まれているかどうかで変わり、当業者で決定することができる。何らかの使用禁忌の事象においては、個々の医師が投与量を調整することができる。投与量を変えて、毎日一回以上の用量の投与を１日〜数日間行うことができる。所与の分類の医薬製品の適当な投与量については、文献に指針がある。例えば、抗体に対する適当な用量を選ぶ指針は抗体の治療用途に関する文献、例えばＨａｎｄｏｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｆｅｒｒｏｎｅら編集、Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｋ Ｒｉｄｈｅ、Ｎ．Ｊ．、（１９８５）、２２章およびｐｐ３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）、ｐｐ３６５−３８９に見出すことができる。単独で用いられる抗体の典型的な１日あたりの投与量は、上記の因子によって体重ｋｇあたり約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲である。
（ｂ）標的化送達
開示されたリポソームおよびマイクロカプセルが、抗体、受容体または受容体リガンドを経て小島細胞等の特定の細胞を標的とすることができる。以下の参考文献は、特異的組織を標的とするこの技術の例である（Santerら、Bioconjugate Chem．、2：447−51、1991；Bagshawe、Br．J．Cancer、60：275−81、1989；Bagshaweら、Br．Ｊ．Cancer、58：700−3、1988；Senterら、Bioconjugate Chem．、4：3−9、1993；Battelliら、Cancer Immunol．Immunother．、35：421−5、1992；PieterszおよびMcKenzie、Immunol．Reviews、129：57−80、1992；およびRofferら、Biochem．Pharmacol．、42：2062−5、1991）。これらの技術を他の様々な特異的細胞タイプに使用することができる。
８．食品
また、本明細書に開示されたマイクロカプセルおよびエマルジョンの何れかを含む食品も開示される。「食品」とは、消費され得る（例えば食する、飲むまたは摂取する）任意の製品を意味する。ある態様では、マイクロカプセルを食品に対する栄養補助剤として使用することができる。例えば、マイクロカプセルおよびエマルジョンにビタミン、オメガ−３−脂肪酸および健康上有益である他の化合物を搭載することができる。ある態様では、食品は焼き製品、パスタ、肉製品、凍結乳製品、ミルク製品、チーズ製品、卵製品、調味料、スープミックス、スナック食品、ナッツ製品、植物タンパク質製品、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、鶏肉製品、加工果汁、グラニュー糖（例えば白または褐色）、ソース、肉汁、シロップ、栄養バー、飲料、乾燥飲料粉末、ジャムまたはゼリー、魚製品、またはペットコンパニオン食である。他の態様では、食品はパン、トルティーヤ、穀物、ソーセージ、チキン、アイスクリーム、ヨーグルト、ミルク、サラダドレッシング、米ぬか、果汁、乾燥飲料粉末、ロール、クッキー、クラッカー、スナック食品、フルーツパイ、またはケーキである。
９．チップおよびマイクロアレー
少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示した任意の核酸配列で示される配列またはその配列の一部であるチップが開示される。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示した任意のペプチド配列で示される配列または配列の一部であるチップも開示される。
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示した任意の核酸配列で示される配列または配列の一部の変異形であるチップも開示される。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示した任意のペプチド配列で示される配列または配列の一部の変異形であるチップも開示される。
１０．コンピューター読み取り可能媒体
開示された核酸およびタンパク質がヌクレオチドとアミノ酸で構成される配列で表され得ることが理解される。これらの配列を表示する様々な方法がある：例えばヌクレオチドグアノシンをＧまたはｇで表すことができる。同様に、アミノ酸バリンをＶａｌまたはＶで表すことができる。当業者は、任意の核酸またはタンパク質配列を任意の存存する様々な方法でどのように表示し表現するかを理解し、そのそれぞれが本明細書に開示されていると考えられる。具体的には、市販フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスク、または他のコンピューター読み取り可能媒体等のコンピューター読み取り可能媒体上に、これらの配列を表示することがここで考えられる。また、開示された配列の二進コード表現も開示される。当業者はどのコンピューターが媒体を読み取り得るかを理解する。従って、コンピューター読み取り可能媒体上に核酸またはタンパク質配列が記録され、保存またはセーブされる。
配列と本発明に示された配列に関する情報とを有するコンピューター読み取り可能媒体が開示される。
１１．キット
本明細書で開示された方法の実行、または本明細書に開示された組成物の使用または保持に使用できる試薬に関するキットが開示される。キットは本明細書に開示された、または開示された方法の実施に必要または有益と理解され得る任意の試薬または試薬の組み合わせを含むことができる。例えば、そのキットは本発明で開示された１つ以上の真核微生物と共に、例えばその維持のための培地を含むことができる。そのキットはまた、例えば脂質または抗酸化物質と共にこれらを使用または投与する手段を含むことができる。
１２．類似の機能を有する組成物
本明細書に開示された組成物は、ある比率の脂質を製造する等のある機能を有することが理解される。開示された機能を果たすために必要なある構造的、遺伝的および機能的要求が本発明に開示されるが、多様な構造、遺伝的背景、および開示された構造に関連する同じ機能を果たす機能的背景があり、これらの構造は最終的には同じ結果、例えばある比率の脂質の製造を達成することが理解される。
Ｄ．組成物の製造方法
本明細書に開示された組成物、および開示された方法の実施に必要な組成物を、他に断らない限りその具体的な試薬または化合物に対して任意の公知方法で製造することができる。
１．核酸合成
例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド等の核酸を、標準的な化学合成法、または酵素法または任意の他の方法を用いて製造することができる。この様な方法は標準的な酵素消化工程後のヌクレオチド断片を単離する工程を含み得るし、または、例えば、ＭｉｌｌｉｇａｎまたはＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ １Ｐｌｕｓ ＤＮＡシンセサイザー（例えばＭｉｌｌｉｇａｎ−Ｂｉｏｓｅｒａｒｃｈ、ＢｕｒｌｉｎｇｔｏｎのＭｏｄｅｌ８７００自動シンセサイザー、ＭＡまたはＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）を用いるシアノエチルホスホラミダイト法による純粋な合成法も含みうる。（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌａｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＣＯＬＤ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第５、６章）を参照）。オリゴヌクレオチド生成に有用な合成法はＩｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６、１９８４（ホスホトリエステルおよびホスファイトトリエステル法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：６１０−６２０、１９８０（ホスホトリエステル法）に記載されている。タンパク質核酸分子を、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、５：３−７、１９９４に記載の方法等により製造できる。
２．ペプチド合成
開示されたタンパク質を製造する１つの方法は、２以上のペプチドまたはポリペプチドをタンパク質化学技術により結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、現在使用し得る実験室装置を用い、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｅｓｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて化学的に合成できる。当業者は、例えば開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを標準的な化学反応により合成できることを容易に理解し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することができ、その合成樹脂から切り出さないが、他のペプチドまたはタンパク質の断片を合成し、次いで樹脂から切り出すことにより、もう一方の断片上で機能的にブロックされた末端基を露出させることができる。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片をそのカルボキシルおよびアミノ末端におけるペプチド結合によりそれぞれ共有結合させ、抗体またはその断片を形成することができる（Ｇｔａｎｔ ＧＡ（１９９２）、Ｓｙｎｔｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ，（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｍ．およびＴｒｏｓｔ、Ｂ．編集、（１９９３）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ（少なくともペプチド合成に関連する材料に関して本明細書に引用により含める））。または、ペプチドまたはポリペプチドを本明細書に記載の通りにインビボで独立に合成する。単離後、これらの独立のペプチドまたはポリペプチドを結合して、類似のペプチド縮合反応によりペプチドまたはその断片を生成することができる。
例えば、クローン化または合成ペプチドセグメントの酵素連結により、比較的短いペプチド断片を結合し、より大きいペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインを生成することができる（Abrahmsen、L．ら、Biochanistry、30：4151、1991）。または、合成ペプチドの自然化学連結を、より短いペプチド断片からより大きいペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用できる。この方法は２工程化学反応で構成される（Dawsonら、Science、266：776−779、1994）。第１工程は未保護合成ペプチドチオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む他の未保護ペプチドセグメントとの化学的選択反応であり、最初の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体が得られる。反応条件を変えずに、この中間体は自発的な速い分子間反応を行い、連結部位に天然のペプチド結合を形成する（Baggiolini、M．ら、FEBS Lett．307：97−101、1992；Clark-Lewis Iら、J．Biol．Chem．、269：16075、1994；Clark-Lewis Iら、Biochenistry、30：3128、1991；Rajarathnam、Kら、Biochemistry、33：6623−30、1994）。
あるいは、未保護ペプチドセグメントが化学的に結合し、化学的連結の結果としてのペプチドセグメント間に形成した結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer、M．ら、Science、256：221、1992）。この技術はタンパク質ドメインアナログの他、完全な生物活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられている（de Lisle Milton R．C．ら、Techniques in Protein Chemistry IV、Academic Press、New York、pp257-267、1992）。
３．組成物の製造プロセス
組成物の製造プロセスの他、その組成物を導く中間体の製造法も開示される。例えば、所望の脂質および抗酸化物質を製造できる真核微生物の他、所望の脂質および抗酸化物質の単離精製法も開示される。合成化学法および標準分子生物学法等の、これらの組成物を製造するために使用し得る様々な方法がある。これらの開示された組成物の製造法が具体的に開示されていることが理解される。
任意の核酸による細胞の形質転換プロセスで製造された細胞が開示される。非天然起源の開示された核酸による細胞の形質転換プロセスで製造された細胞が開示される。
開示された真核微生物により製造された任意の脂質が開示される。開示された生物におけるペプチド発現プロセスで製造された任意のペプチドが開示される。組成物の使用法。
４．研究ツールとしての組成物の使用法
開示された組成物を、例えば脂質および抗酸化物質の生産の研究ツールとして様々な方法で使用できる。
本明細書で述べる様に、開示された組成物をマイクロアレー中の試薬、または存在するマイクロアレーを検出、分析するための試薬として使用できる。開示された組成物を、一塩基多形を単離または同定するための任意の既知の方法で使用できる。例えば本明細書で開示された生物株の対立形質の分析、特に脂質および抗酸化物の生産に関係する対立形質の分析のための任意の方法で、組成物を使用することもできる。また、チップ／マイクロアレーに関連するスクリーニングアッセイの任意の既知の方法に組成物を使用することもできる。また、例えば関連性の研究または開示された組成物に関連する分子モデリング分析を行うために、開示された組成物のコンピューター読み取り可能な実施形態を用いる任意の既知の方法で組成物を使用することもできる。
５．遺伝子修飾および遺伝子破壊法
開示された組成物および方法を、標的化遺伝子破壊および修飾に、これらの事象を経験し得る任意の動物中で使用できる。遺伝子修飾と遺伝子破壊とは、修飾を生物の複製により伝播する様な方法による遺伝子の選択的除去または変化、または本明細書で開示された真核生物等のある生物中の染色体のストレッチの選択的除去または変化に関連する方法、技法および組成物を指す。一般に、例えば本明細書に記載の細胞内に含まれる特定の染色体または核酸のある領域と相同的に組み合わされる様に設計されたベクターで細胞が形質転換される。この相同組み換え事象は、周囲のＤＮＡに対し外因性である、例えばフレーム中の導入ＤＮＡを有する染色体を生成できる。このタイプのプロトコールにより、点突然変異等のきわめて特異的な突然変異を、細胞内に含まれるゲノム中に導入できる。このタイプの相同組み換えを行う方法が本明細書に開示される。
Ｖ．具体的な実施形態
脂質組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでいる。
また、脂質組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでおり、さらに脂質組成物を単離することも含む。
また、脂質組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでおり、ここでオメガ−９脂肪酸に対するオメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の比率が増加されている。
また、脂質組成物を調製する方法であって、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでおり、ここでオメガ−９脂肪酸に対するオメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の比率が増加されており、全体の脂肪酸含量は変化されない。
本明細書に記載した方法のための油産生微生物は、珪藻、微細藻類、真菌、細菌、原生生物であり得る。例えば、該油産生微生物は１８Ｓ配列を有しており、ここで該１８Ｓ配列が配列番号：１に記載の配列と、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一性を有するか、または該油産生微生物は１８Ｓ配列を有しており、ここで該１８Ｓ配列が配列番号：１に記載の配列と少なくとも８０％同一性を有する。
油産生微生物は、フィラム・ラビリンツロマイコタ(phylum Labyrinthulomycota)、ラビリンツロマイセテス（Labyrinthulomycetes）綱、スラウストキトリダエ（Thraustochytridae）亜綱、スラウストキトリアレス（Thraustchytriales）目、スラウストキトリアセアエ科、またはスラウストキトリウム（Thraustochytrium）属由来であり得る。
また、開示された方法で使用できる脂肪酸産生アンタゴニストを開示する。脂肪酸産生アンタゴニストは、オレイン酸、セルレニン、トルイル酸、クルクミン、シクロプロペン、アルキル没食子酸塩、プロピル没食子酸塩、ゴマ油、ピーナッツ油、キャノーラ油、ピリダジノン、ノルフルラゾン、ジフェニルアミン、セトキシジムおよびカプサイシンからなる群から選択され得る。
開示された組成物を含む送達装置が開示される。該送達手段は、マイクロカプセル、ミクロ球体、ナノ球体またはナノ粒子、リポソーム、ノイソーム、ナノエリスロソーム、固体−液体ナノ粒子、リュープロライド、ゲル、ゲルカプセル、錠剤、ローション、クリーム、スプレー、乳液または粉末を含むことができる。
また、カロテノイド組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでいる。
また、カロテノイド組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養し、さらにカロテノイド組成物を単離することを含んでいる。
また、抗酸化組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含んでいる。
また、抗酸化医薬組成物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養すること、さらに抗酸化医薬組成物を単離することも含んでいる。
各１次マイクロカプセルが１次殻を有する、１次マイクロカプセルと担持物質との凝集体を含むマイクロカプセルも開示され、ここで該担持物質は上記の任意の組成物を含み、１次殻でカプセル化され、該凝集体は外殻でカプセル化される。一次殻および／または外殻は、界面活性剤、ゼラチン、ポリリン酸塩、ポリサッカリド、またはその混合物を含むことができる。該一次殻および／または外殻は、また、タイプＢゼラチン、ポリリン酸塩、アラビアゴム、アルギン酸塩、キトサン、カラギナン、ペクチン、デンプン、加工デンプン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトアルブミン、オボアルブミン、ポリソルビタン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、乳タンパク質、乳漿タンパク質、大豆タンパク質、カノーラタンパク質、アルブミン、コーシャゼラチン、非コーシャゼラチン、ハラールゼラチン、非ハラールゼラチンまたはその混合物を含み得る。一次殻および／または外殻シェルは、複合コアセルベート、タイプＡゼラチン、魚ゼラチン、ブルーム強度が約０〜約３００であるゼラチン、ブルーム強度が約０〜約５０であるゼラチン、ブルーム強度が約５１〜約３００であるゼラチン、ブルーム強度が約０、約２１０、約２２０または約２４０を有するゼラチン、ゼラチンとポリリン酸のコアセルベートも含み得る。
開示されたマイクロカプセルの担持物質は、開示された任意の油産生微生物由来の油またはその混合物由来の油を含み得る。該担持物質は、マイクロカプセルの約２０重量％〜約９０重量％または５０重量％〜約７０重量％であり得る。
開示されたマイクロカプセルの外殻は、約１μｍ〜約２，０００μｍ、約２０μｍ〜約１，０００μｍ、約３０μｍ〜約８０μｍ、約４０ｎｍ〜約１０μｍ、または約０．１μｍ〜約５μｍの平均直径を有し得る。
また、任意の上記組成物、送達手段またはマイクロカプセルを含む栄養補助剤が開示される。開示された栄養補助剤は錠剤、ゲルキャップ、カプセルまたはシロップの形であり得る。
また、任意の上記組成物、送達手段またはマイクロカプセルを含む食品が開示される。食品は焼き製品、パスタ、肉製品、凍結乳製品、ミルク製品、チーズ製品、卵製品、調味料、スープミックス、スナック食品、ナッツ製品、植物タンパク質製品、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、鶏肉製品、加工果汁、グラニュー糖、ソース、肉汁、シロップ、栄養バー、飲料、乾燥飲料粉末、ジャムまたはゼリー、幼児用配合食、またはベビーフードであり得る。食品はまた、魚製品、コンパニオンペットーフード、家畜飼料または水産養殖飼料でもあり得る。
食品はまた、パン、トルティーヤ、穀物、ソーセージ、チキン、アイスクリーム、ヨーグルト、サラダドレッシング、米ぬか、果汁、乾燥飲料粉末、ロール、クッキー、クラッカー、フルーツパイ、またはケーキでもあり得る。
また、上記の任意の組成物、送達手段、ミクロカプセルまたは食品を被検体に投与する工程を含む、被検体に組成物を送達する方法も開示される。被検体は哺乳類であってよい。また、被検体はヒトであってもよい。
また、上記の任意のマイクロカプセルの使用、および担持物質を被検者に送達するための薬剤の調製法も開示される。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検体中のコレステロールレベル、トリグリセリドレベル、またはその組み合わせを低下させる方法が開示される。
また、必須微量元素を被検体に補充する方法が開示されており、該方法は、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含み、該組成物、送達手段、マイクロカプセル、補助剤および食品が必須微量元素を含んでいる。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検体のインスリン感受性を改善する方法が開示される。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検体中の高血糖症を軽減する方法が開示される。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検体中の高コレステロール血症を軽減する方法が開示される。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検者の体脂肪を減少する方法が開示される。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の減量を促進する方法が開示される。
また、有効量の任意の上記組成物、送達手段、マイクロカプセル、栄養補助剤または食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の糖尿病を治療または予防する方法が開示される。
また、任意の上記組成物、送達手段、またはマイクロカプセルと、医薬担体とを有する医薬製剤が開示される。
ＶＩ．実施例
本発明の特許請求の範囲による化合物、組成物、製品、手段および／または方法をどのように作成し評価するかを当業者に提供するために以下の実施例が示され、また下記実施例は単に例示であり、本発明の開示を制限すること意図されない。数値（例えば量、温度等）に関して精度を保障する努力がなされたているが、幾分かの誤差および偏差を考慮する必要がある。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃または常温であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
実施例１：ＯＮＣ−Ｔ１８スラウストキトリウム種の株の単離
Ａｄｖｏｃａｔｅ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｏｖａ Ｓｃｏｔｉａで採集したマングローブの葉からＯＮＣ−Ｔ１８を単離するために、古典的な生物学的株精製技術を採用した。０．２μｍのフィルターで濾過した１Ｌの海水に５ｇＬ−１のグルコース、２ｇＬ−１のペプトン、２ｇＬ−１の酵素抽出物および１５．０ｇＬ−１の寒天を含む栄養培地寒天上で、純度を確認するまでＯＣＮ−Ｔ１８を２５℃で逐次培養した。次いで、それぞれ６０ｇＬ−１のグルコースおよび１０ｇＬ−１の酵母抽出物である窒素および炭素源を補充した、１５％の人工海水（栄養海水）を含む液体培地を調製した。この培地（２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬの培地）にＯＣＮ−Ｔ１８を接種し、２５℃でインキュベーションし１２０ｒｐｍで振盪して通気した。
ＯＣＮ−Ｔ１８を遠心分離により培地から分離し、細胞バイオマスを洗浄し、遠心分離および凍結乾燥で仕上げた。次に培養効率を決定するために細胞バイオマスを秤量し、培地リッターあたりのバイオマス値を記録した。バイオマスからの脂質分画の抽出、次いで脂肪酸メチルエステルの分離をＢｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法で行った。凍結乾燥細胞材料を１０ｍＬのねじ蓋付き試験管に移し、１０％メタノール性ＨＣｌとジクロロメタンとを該管に加え、混合物を９０℃で２時間反応させてエステル交換を行った。次にヘキサン：クロロホルムを加えて脂肪酸メチルエステルを抽出し、各微生物と共生群（ＯＮＣ−Ｔ１８）との脂肪酸プロファイルを測定するため、メチルエステル成分をガスクロマトグラフィー（ＦＩＤ）で測定した。エステル交換プロセスの最初（Ｃ２３：０）および最後（Ｃ１９：０）の双方で規定量を添加した２つの内部標準（Ｃ１９：０およびＣ２３：０）のＧＣピーク面積の比較により、各脂肪酸メチルエステル（Ｃ１４：０〜Ｃ２３：０）の濃度を決定した。乾燥細胞バイオマスのグラムあたりの脂肪酸の全量、および各脂肪酸の含有割合を、図２に示すようにこの方法で計算した。
図１に示される結果と関連したこれらの結果の分析から、ＯＮＣ−Ｔ１８はより多くのＤＨＡを生産し、かつ、ＥＰＡおよびＤＰＡをかなりの量で生産する能力を有することが理解できる。この非最適化培養培地中で約２５％のＤＨＡ、８．０％の（ｎ−６）ＤＰＡおよび１．０％のＥＰＡをＯＮＣ−Ｔ１８は生産した。次に、ＯＮＣ−Ｔ１８を以下の経済的に望ましい特性に基づいて選択した：（１）最大の従属栄養生育の能力（対照株と比較して）；（２）高い割合のオメガ−３高度脂肪酸を含む；（３）安価な栄養素で生育可能；（４）耐熱性；および（５）広塩性。
さらに、油生産微生物の複数の異なった株をＯＮＣ−Ｔ１８と比較した。これらの微生物はスラウストキリド（Thraustochyrid）を含むと考えられ、表３に示す量の油を生産する。
表３、［］＝ｍｇ／ｇ
Figure 2010511377
Figure 2010511377
本明細書に記載されるとおり、ＯＮＣ−Ｔ１８のみに関して、例えば全油産生に対するＤＨＡの割合、または全ＤＨＡ生産等により、本明細書で開示される油産生能で表される油生産微生物のセットが開示されることが理解される。
実施例２：遺伝子技術を用いるＯＮＣ−Ｔ１８の真核スラウストキトリウム種の同定
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と、全ての真核種に共通である１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的とするプライマーとを用いて、ＯＮＣ−Ｔ１８（実施例１参照）から単離された油産生微生物の構造遺伝子のＰＣＲ生成物を作成することが可能であった。次にＰＣＲ生成物の配列決定を行い、該真核生物種について配列番号１とした（図２参照）。
配列番号１と、ＧｅｎＢａｎｋ（National Centre for Biotechnology Information、National Institute of Health、Bethesda、MD、USA）のゲノムデータベース中に見出される核酸配列とのＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）アルゴリズムを用いる比較から、配列番号１がスラウストキトリウム・ストリアツム［ＡＦ２６５３３８］に最も関連性がある（類似性９７．５％）と同定された。
ＯＮＣ−Ｔ１８スラウストキトリウム種に対するＢＬＡＳＴの結果を以下に示す。
Figure 2010511377
Figure 2010511377
Figure 2010511377
実施例３：ＯＮＣ−Ｔ１８株を用いるバイオマスの最適生産
微生物（または単細胞生物）由来の油の生産は、最初の接種レベル／濃度、基質のタイプ、培地の組成、温度およびｐＨ等の様々なプロセス変数に依存する。具体的には、スラウストキトリド（Thraustochytrid）株を用いる高度不飽和脂肪酸の微生物に基づく生産は、バイオマスと脂肪酸生産との間で直接的な相関を示す。結果として、基本的な要件の理解またはパラメーターの最適化は最大の生産量を達成するための重要な因子である。従って、より多い量の脂肪酸の生産のための最良の培地を決定するために、バイオマス最適化実験を最初に行った。具体的には、（バイオマス生産に直接関連する）光学濃度を増加するための最適培地像を決定するために、直交配列に基づく、最近開発されたＴａｇｕｃｈｉ法（Joseph、J．およびPiganatirlls、JR、IIE Trans 20：274-254、1998）を使用した。この場合、バイオマス生産に強い影響を及ぼす変数の累積効果を理解するためにＴａｇｕｃｈｉ法を使用した。窒素（酵母抽出物、ペプトン、Ｌ−グルタミン酸）、炭素（グルコース）および塩（人工海水）の濃度の変化がバイオマス産生に効果を及ぼした。従って、グルコースおよび海塩溶液の量の変化（それぞれ５、４０、１００、１６０、２００ｇＬ−１および０、６、２０、３０、４０ｇＬ−１）と関連させて、酵母抽出物、ペプトンおよびＬ−グルタミン酸（０、４、１０、２０、５０ｇＬ−１）の量を変えて様々な液体培地を調製した。選択した窒素培地が４８時間および１２０時間における信号−雑音比（ＳＮＬ）分析を用いて識別される様に、以下の式を用い、Ｌ２５直交配列に従って濃度を計算した。
Figure 2010511377
ここでｎ＝レベルの数、ｙ＝収量（３回の実験からの平均ＯＤ６００）
以下の図２に示す様なこれらの実験の結果（具体的には標的バイオマス事項を対象）は、光学密度（ＯＤ６００）に関連するＯＮＣ−Ｔ１８による窒素利用の比率の順は最初にペプトン、次に酵母抽出物、その次にＬ−グルタミンであった。しかしながら、成長の最大の点では、バイオマス生産の増加に最も良い窒素源は酵母抽出物であり、次にペプトン、その次にＬ−グルタミン酸であった。さらに、グルコースと塩濃度（海塩濃度）とを変化させた類似の実験を用いると、ＯＮＣ−Ｔ１８バイオマス生産に対する最適で最も安価な培地組成は酵母抽出物２ｇＬ−１、ＭＳＧ８ｇＬ−１、グルコース６０ｇＬ−１および海塩６ｇＬ−１を含む培地であった。
実施例４：ＯＮＣ−Ｔ１８株によるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の最適生産
塩水溶液（人工海水）中に窒素源（ペプトン、酵母抽出物、Ｌ−グルタミン酸（ＭＳＧ）の何れか、またはその組み合わせ）および炭素源（グルコース）を含む培地を、実施例３に記載と同様な方法で最適バイオマスとＤＨＡ産生とに対する最良の培地組成を決定するために調製した（表４に示す）。２５℃、１３０ｒｐｍで３日間培養後、バイオマス、培地リッターあたりの全脂肪酸、脂肪酸の重量パーセント含有量、全脂肪酸中のＤＨＡの重量パーセント含有量、および培地リッターあたりのＤＨＡ量を実施例１に記載の方法により、ガスクロマトグラフィーによって測定した。その結果を以下の表４に示す。
この場合、ガスクロマトグラフィー質量分析およびピークロッキング法を用い、ＤＨＡの既知の標準物質と比較することによりＤＨＡを確認した。窒素の天然および有機形態の変化を調べた実験パッケージ（１）からの発見は、バイオマスおよびＤＨＡの最適産生に対し最適培地組成物が酵母抽出物およびＬ−グルタミン酸の双方を４．０〜６．０ｇＬ−１の範囲で含む必要があることを示した。一方、培地に添加したナトリウム組成の変化を調べた実験パッケージ（２）は、人工海塩を使用するとＤＨＡ産生およびバイオマス産生が最適になることを示した。さらに、培地内のナトリウム濃度を変化させた実験パッケージ（３）は、ｄＨ２Ｏリッターあたり人工海水が５〜１５％でＤＨＡおよびバイオマス産生の最大を示した。グルコースレベルの変化を評価した実験パッケージ（４）の結果は、グルコースの４０〜１６０ｇＬ−１以下の範囲でバイオマスとＤＨＡとの最適生産が得られることを示した。最後に、実験パッケージ（５）の結果は、グルコースまたはグリセロールを炭素源として使用した場合、ＯＮＣ−Ｔ１８が細胞バイオマスおよびＤＨＡ濃度の双方について等しい値を生産することを示した。
表４：培地組成の変化に関するＤＨＡ生産最適化実験の結果
Figure 2010511377
実施例５：最大ＤＨＡ生産のためのＯＮＣ−Ｔ１８収穫最適時間
ＯＮＣ−Ｔ１８を実施例１に示したものと同じ培地組成および条件で培養した。この場合に興味のあることは、最大量のＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡを得るためにＯＮＣ−Ｔ１８を収穫すべき時間、ならびに上記の量を得るために必要な時間を考慮することである（図３参照）。
経時変化の実験結果は、フラスコおよびバイオリアクター内でＤＨＡの最適産生のためのＯＮＣ−Ｔ１８の回収のための最適時間はそれぞれ３〜５日の間で変化することを示した。
実施例６：ＯＮＣ−Ｔ１８由来の脂質の分析
ＯＮＣ−Ｔ１８の全脂質分画を改良ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ法を用いて抽出した。具体的には、乾燥細胞バイオマス（２．０ｇ）を、蒸留Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）中に４℃で終夜再水和させた。メタノール：クロロホルム（容積比２：１）（３０ｍＬ）を混合物に加え、１２０ｒｐｍで２０分間穏やかに振盪し、得られた上澄を傾斜流出させた。ペレットをメタノール：クロロホルム：Ｈ２Ｏ（体積比２：１：０．８）中に再懸濁し、このプロセスを繰り返して上澄をプールし、分液ロートに移した。次に５ｍＬのクロロホルムと５ｍＬのＨ２Ｏとをロートに加え、２相液系を生成した。分液ロート内で激しく混合後、クロロホルム層を取り出し、Ｎ２ガス下に濃縮し、クロロホルム中に再懸濁し、分析まで−２０℃で保存した。約１μＬの全脂質分画を複数のクロマロッド上にスポットし、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ ＭＫ６ ＴＬＣ／ＦＩＤ装置を用いて分離分析した。
分析結果は、従属栄養培養下にＯＮＣ−Ｔ１８が生産した脂肪酸成分は、実質的に殆ど全体（少なくとも９５％）がトリグリセリドであることを示した。上記の中性脂肪酸分画に加えて、ＯＮＣ−Ｔ１８は識別し得るカロテノイドおよびリン脂質分画も生産する。最初に５０％、次に７５％の燃焼、その後に溶媒系による分離によりリン脂質分画を単離すると、大きく複雑なリン脂質分画が存在することが分かった。これらの結果は試料中にホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスホチジン酸が存在することを示した。
実施例７：ＯＮＣ−Ｔ１８株を用いる抗酸化物質の産生
真核微生物ＯＮＣ−Ｔ１８を上記の条件と培地とを用いて培養した。従属栄養培養後に得られた細胞バイオマスを遠心分離、濾過または沈降で集めた。３８００×ｇの遠心分離で細胞を収穫し、燐酸緩衝食塩水で洗浄した。細胞バイオマス（新鮮または凍結乾燥）を１０倍容量のアセトンに懸濁し、２００ｒｐｍで５分間攪拌し、３８００×ｇで５分間遠心分離し、Ｎ２蒸発により乾固するまで濃縮した。次に色素を最小量の１０％アセトン／ヘキサン中にすぐに再懸濁し、ＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存した。カロテノイド抽出物の同定を、４７０ｎｍに設定した波長可変検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣ（Agilent、Palo Alto、CA、USA）で行った。試料をＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ガードカラム（Waters、Mulford、MA、USA）を通してＢｏｎｄｃｌｏｎｅ Ｃ１８逆相カラム（Phenomenex、Torrance、CA、USA;１０μｍ粒子；３．９ｍｍ（内径）×３００ｍｍ）に注入した。注入容積は１０μｍ、流速１．００ｍＬ／分でヘキサン中１０％のアセトンを２５分間使用した。既知の標準物質（この場合はアスタキサンチン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテン；ChromaDex、Santa Ana、CA、USA）のピーク面積との比較に基づき、カロテノイドの定量データを得た。カロテノイド、フェニコキサンチンの場合の様に既知の標準物質がない場合は、濃度を計算するためにアスタキサンチンピーク面積を使用した。光ダイオードアレー（Watersモデル996）を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣを用いてＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＥＳＩ−Ｑ−Ｔｏｆマススペクトロメーター（Waters、Milford、MA、USA）中に導き、ＨＰＬＣ−ＭＳでカロテノイドの実体をさらに確認した。その後ＯＮＣ−Ｔ１８のＨＰＬＣ分析により、細胞バイオマス内にいくつかの抗酸化分子の存在が明らかとなった（５０〜１２５０ｍｇ／ｋｇ）。これらの化合物には抗酸化物質カロテノイドであるアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンがそれぞれ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇおよび１〜２００ｍｇ／ｋｇの他、いくつかの未同定フラベノイドポリフェノール化合物が含まれていた。
実施例８：既知の微生物との比較
ＯＣＮ−Ｔ１８がＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡを生産する能力を、既知の微生物と比較した。培地リッターあたりの細胞バイオマスの量、乾燥細胞バイオマスあたりの脂肪または脂肪酸の含有量比％、全脂肪酸中のＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡの含有量比％、および得られたＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡの量を、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡがスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum） ＡＴＣＣ３４３０４、スラウストキトリウム種ＡＴＣＣ２０８９１、スラウストキトリウム種ＡＴＣＣ２０８９２、スラウストキトリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ２８２１０、スラウストキトリウム種ＡＴＣＣ２６１８５、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８、シゾキトリウム・アグレガタム（Schizochytrium aggregatum)ＡＴＣＣ２８２０９、およびシゾキトリウム・リマシウム（Schizochytrium limacinum)ＭＹＡ−１３８１の培養で得られた場合の他、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡが本明細書に記載のＯＮＣ−Ｔ１８の培養で産生された場合とで比較した。
表５：いくつかの代表的なスラウストキトリド（Thraustochytrid）株の脂質産生およびバイオマスの特徴の比較
Figure 2010511377
表５に示す様に、本明細書に記載のＯＮＣ−Ｔ１８を用いて培養を行った場合、培地リッターあたりの細胞バイオマス値は試験した他の株と比較して非常に高かったことが明らかである。その上、本発明によれば、ＯＮＣ−Ｔ１８は上記の他の株と比較してきわめて高い脂質の含有率を有していた。さらに、本発明によれば、ＯＮＣ−Ｔ１８内のＤＨＡとＤＰＡとの含有率は極めて高く、ＥＰＡレベルはスクリーニングした全ての株で同程度であることが示された。従って、ＯＮＣ−Ｔ１８は実施例１で述べた培養条件下で大量のＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡを生産する能力を有する。
実施例９：別の炭素源の情報
ＯＮＣ−Ｔ１８は、主な窒素源が酵母抽出物、グルタミン酸ナトリウムおよび／またはペプトン、主な炭素源がＤ−グルコースである培地上で優先的に生育することが示されている。ＯＮＣ−Ｔ１８の詳細な代謝のプロファイリングの結果として、グリセロール（炭素源）も有用な代替品であることが注目された。さらに、グリセロールを含む魚油加工排液も、低コスト栄養代替品としての利用可能性が試験された。グリセロールの場合、５００ｍＬフラスコ中の２００ｍＬの培地を用いて、１２０ｒｐｍ、２５℃で３日間培養する実験を行った。２つの魚油加工排液−ＧＷＷ（グリセロール水洗浄液）とＧＡＷ（グリセロール酸洗浄液）−のグリセロール含有量は２００ｍＬ培地（ｐＨ６．５に調節）の４０体積％であり、コントロールとして６％（重量／体積）のグリセロールを２００ｍＬの培地に添加した。
これらの結果の分析は、グリセロール副産物等の魚油排液成分を、ＯＮＣ−Ｔ１８の大量培養における炭素源として使用することにより全脂肪酸量が減少したが、微生物細胞内のＤＨＡ含有量は維持されることを示した（図１０）。
表６：別の炭素源の試験に対する脂肪酸、バイオマスおよびグリセロール含有量
Figure 2010511377
実施例１０：乾燥細胞重量の倍加
スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８を、１００，０００Ｌまでの様々な形式のバイオリアクター中でオメガ−３油の生産のために生育させることができる。全ての培養は、培養を確立するために用いられる最終容積１０〜２０％の接種液の調製で始まる。初期培地は６ｇ／Ｌまでの海塩、１０ｇ／Ｌの窒素源および６０ｇ／Ｌの炭素源を含み、別の７５ｇ／Ｌの炭素源を初期培養の２４〜３６時間後にバッチ添加し、さらに７２〜９６時間、温度範囲１８〜２５℃で培養を続ける。例えば、６ｇ／Ｌの海塩、２ｇ／Ｌの酵母抽出物、８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸および６０ｇ／ＬのＤ−グルコース（３６時間後に７５ｇ／Ｌを添加）の培地を用い、２５℃で９６時間生育させて、ＯＮＣ−Ｔ１８は４０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量（ｄｃｗ）、８０％（ｄｃｗ）の全脂肪酸（ＴＦＡ）／脂質分画（Ｃ１４：０〜Ｃ２４：０）、および３０％（ＴＦＡ）のＤＨＡを生産可能であった。同様に、ＴＦＡ含有量およびＤＨＡ含有量のいずれにも影響せず類似の倍加効果をバイオマスに与えるために、窒素および炭素培地成分の双方を倍加することにより乾燥細胞重量を増加することが可能である。例えば、２４ｇ／Ｌの海塩、８ｇ／Ｌの酵母抽出物、３２ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸および３００ｇ／ＬのＤ−グルコースの培地を使用し、２５℃で３１２時間培養すると、ＯＮＣ−Ｔ１８は８０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量（ｄｃｗ）、６０％（ｄｃｗ）の全脂肪酸（ＴＦＡ）／脂質分画（Ｃ１４：０〜Ｃ２４：０）および３８％（ＴＦＡ）のＤＨＡを生産することが可能であった。
実施例１１：様々な代替培地、炭素（Ｃ）および窒素（Ｎ）源に対するスラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の生育、および乾燥細胞重量および脂質に対する効果
様々な低コスト窒素および炭素源でのスラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の生育を調べた。具体的には、５０ｍＬのＯＮＣ−Ｔ１８を６ｇ／Ｌの人工海塩を含む２５０ｍＬフラスコ中、２５℃で７２時間培養した。炭素および窒素源濃度は以下に示す通りであり、２ｇ／Ｌの表中の窒素源を８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸（４ｇを使用した魚油を除く）と組み合わせて使用した。炭素源を表に示す様に変えた。全ての実験を３回繰り返し、ＧＣ注入を３回行って、脂肪酸メチルエステルの分析のための全抽出を３回繰り返した。
その結果は、窒素源ＥＭＤ酵母抽出物と魚肉とで生育した場合、スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８が最適の乾燥細胞バイオマス（すなわち２つの対照培地より多い）を産生することを示す。逆に、脂質はコントロールより少なく、ＤＨＡはコーンスティープリカーおよびＥＭＤペプトンを使用した場合に最適であった。最後に、炭素源デキストロースは脂質含有量を増加することが見出され、フルクトースとデキストロースとは対照より高いＤＨＡ含有量を製造する。
表７：スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の生育
Figure 2010511377
略号：ＭＳＧ＝Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム）、ＹＥ＝酵母抽出物
実施例１２：全脂質および分画の単離のための抽出技術
選択したオメガ−３油の単離のための様々な方法を、最適単離効率を決定するために試験した。これらの方法には：標準Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法（Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７：９１２−９１７、１９５９）；迅速ＧＣ ＦＡＭＥ分析のための試料加工を可能にする、特にスラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）種で用いられる抽出およびエステル交換の組み合わせ法（Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４３：１０７−１１６、２０００）；同時鹸化による抽出（Ｃａｒｔｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７３：１０２５−１０３１、１９９６）；およびトリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドを選択的に単離できるシリカゲルカラムを用いる固相抽出（Ｐｉｎｋａｒｔら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４：９−１５、１９９８；Ｂａｔｅｍａｎ ＆ Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４５：１３２−１３５、１９９７）が含まれた。
具体的には、１回の培養実施（実施例１参照）で製造した４０グラムの乾燥細胞重量のスラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８バイオマスを０．４４ｇのロットに分け、各技術に使用した。試料毎の３回の実施で３回行ったＦＩＤ−ＧＣによる脂肪酸メチルエステルの測定を用いて、効率分析を全ての技術について３回行った。その結果は、全脂肪酸含有量がそれぞれの方法間で変化し、溶剤：化合物の飽和、バイオマス破壊の考慮および検討した他の物理的条件（例えば温度および時間）のために変動が最も生じやすいと思われた。
表８：全脂質および分画の単離のための抽出技術
Figure 2010511377
 Ｎ．Ｂ：上記の各値は、ＦＡＭＥ分析に対するＦＩＤ−ＧＣの３回の実施の平均
実施例１３：Thraustohytrium 種 ＯＮＣ−Ｔ１８を産生する多価不飽和脂肪酸の単離および特徴付け：株を同定するためのスクリーニングおよびその中での産生の最適化
（ａ）材料および方法
（１）スラウストキトリド（Thraustochytrids）の単離および維持
Ｓｐａｒｔｉｎａ ａｎｌｅｒｎｉｆｌｏｒａ、Ｚｏｓｔｅｒａ ｍａｒｉｎａおよび堆積物を含む７０種の海洋生物試料を、Ｎｏｖａ Ｓｃｏｔｉａ、Ｐｒｉｎｃｅ Ｅｄｗａｒｄ島、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮｅｗｆｏｕｎｄｌａｎｄおよびＬａｂｒａｄｏｒの西カナダ海岸地域から、２００２年７月〜８月の間に採集した。試料を、１０ｍＬの滅菌０．２μｍフィルターで濾過した天然海水、３００ｍｇ／Ｌのペニシリン、５００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む２０ｍＬバイアル中に入れた。懸濁液を滅菌花粉（Ａｃｅｒ種）で刺激し、Ｂｒｅｍｅｒ、Ｍａｒｉｎｅ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｆｕｎｇａｋ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、ｐｐ４９−６１（２０００）に従って１８℃で４８時間インキュベーションした。花粉粒子をループで移し、抗生物質を含むＢ１寒天プレート（１Ｌの天然海水に酵母抽出物１ｇ／Ｌ、ペプトン１ｇ／Ｌ、寒天１ｇ／Ｌ）上にストリークし、インキュベーションした。酵母またはバクテリアコロニーの変則的な、球状またはナメクジ状細胞で構成される、単一で不規則なガラス状コロニーをつまみ上げ、精製するためにＢ１プレート上で少なくとも３回継代培養した。
（２）脂肪酸スクリーニングのためのバイオマス産生
生育および脂肪酸産生用の分離株をスクリーニングするために、オートクレーブ処理で滅菌した２ｇ／Ｌのペプトン（BD、Flanklin Lakes、NJ、USA）および２ｇ／Ｌの酵母抽出物（BD、Flanklin Lanes、NJ、USA）を含む、０．２μｍのフィルターで濾過した天然海水を用いて液体培地を調製し、次いで０．２μｍのフィルターで濾過した５ｇ／Ｌの滅菌グルコース（Sigma-Aldrich、St．Louis、MO、USA）を添加した（Bowelsら、J．Biotechnol．70：193−202（1999））。３０ｍＬ容積の培養物を寒天プレートからループで接種し、１００ＲＰＭのシェーカー上、１８℃で４日間生育させた。この培養物５ｍＬを使用して９５ｍＬの培地に接種し、さらに４日間インキュベーションした（静置）。４，５００ＲＰＭの遠心分離で細胞を収集し、５ｍＬの蒸留水ですすぎ、再度遠心分離した。細胞ペレットを凍結乾燥し、秤量して脂肪酸分析のために誘導体化するまで−８０℃で保存した。
（３）脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の調製
Ｌｅｗｉｓら（J．Microbiol．Meth．、43：107−116（2000））を改良した直接エステル交換法により脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）抽出物を調製した。具体的には、２０ｍｇの凍結乾燥材料と３ｍＬのエステル交換反応混合液（体積比、メタノール：塩酸：クロロホルム＝１０：１：１）とを添加した。バイオマスの均等な分散を保証するため細胞を１０秒間渦流攪拌し、９０℃で１２０分間静置した。エステル交換が終了すると、試料を取り出し室温に冷却した。次に水（１ｍＬ）を加え、１０秒間渦流攪拌した。３×２ｍＬアリコートのヘキサン：クロロホルム（４：１）を加え、１０秒間渦流攪拌してＦＡＭＳを抽出し、溶液が透明に分離するまで静置した。
（４）ＦＡＭＥのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析
２つの内部標準（各２００μｌ）を用いてＦＡＭＥのＧＣ分析を行った。１つはヘキサコサエン酸（２３：０）でエステル交換前に添加し、他方はノナデカエン酸（Ｃ１９：０）を分析前に直接添加した。３０ｍ×０．３２ｍｍ（内径）のＯＭＥＧＡＷＡＸ３２０溶融シリカキャピラリーカラム（フィルム厚０．２５μｍ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と炎イオン化検出器を備えたＡｇｌｉｍｅｎｔ ６８９０ ＧＣ（Agliment Technologies、Palo Alto、CA、USA）を用いて分析を行った（注入容積１μＬ、キャリアガスＨ２、流速５．０ｍＬ／分一定、２５０℃に設定、２７５℃でＦＩＤ検出器へのスプリット比５０：１）。ＦＡＭＥの実体の確認をＴｒａｃｅ ＧＣ−ＤＳＱマススペクトロメーター（Thermo Electron、Boston、MA、USA）を用いて行い、保持時間を実験用標準物質と比較した。
（５）遺伝的同定
ゲノムＤＮＡを製造業者の指針に従い、ＭｏＢｉｏ ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（MoBio Laboratories、Carlsbad、CA、USA）を用いて抽出した。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するために用いたオリゴヌクレオチドプライマーをＨｏｎｄａら（J．Eukaryot Mictobiol．、46：637−647、1999）から修飾した：すなわちＴ１８Ｓ１Ｆ５’−ＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＴＡ−３’およびＴ１８Ｓ５Ｒ５’−ＴＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ−３’。２０μＬのＰＣＲ反応混合物は２Ｕ Ｂｉｏｌａｓｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Bioline、Boston、MA、USA）、１×ＮＨ４反応緩衝液、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１Ｍベタイン（Sigma-Aldrich、St．Louis、MO、USA）、２００μＭのＰＣＲヌクレオチド混合物（Promega、Madison、WI、USA）、各１μＭのフォワードおよびリバースプライマー（High Point、NC、USA）および１００ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型を含んでいた。９４℃、３分間の初期変性工程後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔサーマルサイクラー（Eppendorf、Westbury、NY、USA）を用い、９４℃で４５秒、６４℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル、その後７２℃で１０分の最終延長反応のプログラムを用いてＰＣＲ増幅を行った．プライマーＦＡ２、ＦＡ３、ＲＡ１、Ｒ（Moら、Mar．Biol．140：883−889、2002）、Ｔ１８Ｓ１ＦおよびＴ１８Ｓ５Ｒを用いる直接配列決定（MWG Biotach、High Point、NC、USA）のため、ＰＣＲ生成物をＭｏＢｉｏ ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｋｉｔ（MoBio Laboratories Inc．、Carlsburg、CA、USA）を用いて精製した。得られた配列を整列し、ＤＳ Ｇｅｎｅ（Accelrys、Dan Diego、CA、USA）を用いてＧｅｎＢａｎｋ［Bensonら、Nucleic Acid Res．33：D34−38、（2005）］に保存された類似に微生物のヌクレオチド配列と比較した。次に１，０００個のブートストラップ再サンプリングで統計的有意性を評価するＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｉｎｇ法［SaitoおよびNei、Mol．Biol．Evol．4：406−425、(1987)］を用いて進化系統樹を作成した［Felesenstein、Evolution 39：783-791、（1985)］。
（６）カロテノイドの同定
３８００×ｇの遠心分離で細胞を収集し、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。次に１０倍容積のアセトン（Sigma-Aldrich、St．Louis、MO、USA）に再懸濁し、２００ｒｐｍで５分間攪拌し、３，８００×ｇで５分間遠心分離し、Ｎ２蒸発により乾固するまで濃縮した。ＨＰＬＣ分析前にヘキサン中の最小量の１０％アセトンに再懸濁した。波長可変検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ（Agilent、Palo Alto、USA）により４７０ｎｍで同定を行った。対称Ｃ１８ガードカラム（Waters、Milford、MA、USA）を通して試料をＢｏｎｄｃｌｏｎｅＣ１８逆相カラム（Phenomenex、Torrance、CA、USA;１０μｍ粒子、３．９×３００ｍｍ（内径））に注入した。注入容積は１０μＬであり、ヘキサン中１０％アセトンを流速１ｍＬ／分で２５分間使用した。カロテノイドの同定をさらに質量分析分析（Micromass ESI-QT of MS、Waters、Milford、MA、USA）で確認した。各カロテノイドの定量データは、標準物質（アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテン）を用いる較正曲線の作成、および一定濃度のピーク面積の比較に基づいていた。
（７）培養の最適化
脂肪酸およびＤＨＡの産生に対する炭素、窒素および海塩の効果を、１３０ｒｐｍ、２５℃で３日間振盪する２５０ｍＬのエーレンマイヤーフラスコ中のバッチ培養を用いて調べた。さらに、Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｂｐｌｕｓ Ｔｗｉｎ ５Ｌバイオリアクター（Sartorius BBI Systems Inc．、Betlehem、PA、USA）を用いて培養の実験を行った。バイオリアクター中の４．９Ｌの培地に接種するために、１００ｍＬの接種溶液を用いた。製造業者の指針に従い、Ｇｌｕｃｏｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich、St．Louis、MO、USA）を用いてグルコース濃度を測定した。バイオリアクターで用いた培地組成および条件は、以下の結果に詳細に述べる。
（ｂ）結果
収集およびスクリーニングプロセスを開発し、花粉刺激および選択的細菌学培地を用いて、原性動物ファミリーのメンバーＬａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄａ、特にその属、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムを単離した。カナダ大西洋岸中に分散した２０箇所の独自の採集地点をカバーするこの研究から６８の純粋な株が得られ、顕微鏡で同定された。細胞乾燥重量の２０％以上が脂肪酸である油性株の選択は、［Levisら、J．Microbiol．Meth．43：107−116、(2000）］の方法に従って、ＧＣ ＦＵＦＡプロファイル、バイオマス生産性、最大のＴＦＡ、ＤＨＡおよびより少量のＥＰＡ濃度の結果に基づいていた（図１１）。バイオマスの値、ＴＦＡおよびそれに続くＤＨＡおよびＥＰＡの生産性はそれぞれ１００〜２３００ｍｇ／Ｌ、２７．１〜３２１．４、５．１８〜８３．６３および２．９７〜２１．２５ｍｇ／ｇであった（図１１）。
液体培地中で生育する全ての分離株（６８中の５４）は相当量のオメガ−３ポリ不飽和脂肪酸を生産し、特にこれらの細胞の全Ｃ２０〜Ｃ２２脂肪酸含有量の２２〜８０％がＤＨＡであった（図１１）。このことは、低温帯環境から単離されたスラウストキトリド（Thraustochytrids）が、全脂肪酸含有量の５３％までのＤＨＡである脂肪酸プロファイルを有するという先の知見を確認するものである［Bowlesら、J．Biotechnol．70：193−202、1999；Huangら、Mar．Biotechnol．5：450−457、(2003)］。特に興味のあることは、ＯＮＣ−Ｔ１８が９０％までのＣ２０〜Ｃ２２脂肪酸含有量をＤＨＡとして生産し、ＤＨＡが全細胞内脂肪酸の約３５％であることである。このＤＨＡ含有量は、シゾキトリウム種ＡＴＣＣ２０８８８（３２％）およびＳ．ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＭＹＡ−１３８１／ＳＲ２１（３４％）等のいくつかの市販生産株の含有量に匹敵することが示された［Barclayら、J．Appl．Phycol．6：123−129，1994；およびYokochiら、Appl．Microbiol．Biotechnol．49：72-76、(2003)］。さらに、全ての分離株はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を合成し、同定された全ＰＵＦＡの２〜２０ｗ／ｗ％の間で変化した（図１１）。産生されたオメガ−３油に加えて、全分離株の約８０％はオメガ−６ＰＵＦＡ、すなわちアラキドン酸（ＡＡ）またはドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）をそれぞれ１〜１８ｗ／ｗ％および３〜７ｗ／ｗ％の濃度で合成した（図１１）。
Ｈｕａｎｇら［Mar．Biotechnol．5：450−457、(2003)］は、日本およびフィジーの熱帯性湾岸水から単離されたスラウストキトリド（Thraustochytrids）で５種のポリ不飽和脂肪酸プロファイル、すなわちＤＨＡ／ＤＰＡ（ｎ−６）、ＤＨＡ／ＤＰＡ／ＥＰＡ、ＤＨＡ／ＥＰＡ、ＤＨＡ／ＤＰＡ／ＥＰＡ／ＡＡおよびＤＨＡ／ＤＰＡ／ＥＰＡ／ＡＡ／ドコサテトラエン酸が記録されることを示唆した［Huangら、Mar．Biotechnol．5：450-457、(2003)］。このカナダ温帯大西洋から単離されたスラウストキトリドのコレクションの場合、４種のＰＵＦＡプロファイルが決定でき、その３種は上記のものと同一、すなわちＤＨＡ／ＤＰＡ／ＥＰＡがコレクションの７．４％、ＤＨＡ／ＥＰＡがコレクションの１３％、およびＤＨＡ／ＤＰＡ／ＥＰＡ／ＡＡがコレクションの７４％であり、第４番目が５．６％のＤＨＡ／ＥＰＡ／ＡＡ混合物を含んでいた。
１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の直接の配列決定により、ＯＮＣ−Ｔ１８がスラウストキトリドファミリー（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＤＱ３７４１４９）のメンバーであることが明確に同定された。系統発生分析は、ＯＮＣ−Ｔ１８がスラウストキトリウム・ストリアツム Ｔ９１−６と独自のグループ（９７．５％の同一性）を形成することを示した［図１２：leaderおよびPorter、Mycologia、93：459-464、(2001)］。スラウストキトリダエ種ＭＢＩＣ １１０９３、Ｎ１−２７および日本の沿岸熱帯水から収集し、ＤＨＡの主要な産生菌であることが見出されたスラウストキトリウム種ＣＨＮ−１［Carmonaら、Biosci．Biotechnol．Biochem．、67：884−888、(2003）およびMar Biotechnol 5：450−457（2003）］は、それぞれ９６、９５．５および９４．５％の類似性であることが示された。図１２に示されたスラウストキトリダエの全てのメンバー間での遺伝的多様性はきわめて低く、全体で９７．５〜９１．０％の類似性の範囲であった。しかし、これらの種は世界的に分布し、その２／３は日本、中国およびイスラエルの沿岸熱帯水から分離され、残りはアメリカ、ヨーロッパおよびカナダの温帯の水から単離されている。
ＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸プロファイルは、シゾキトリウム種ＫＨ１０５またはシゾキトリウム・リマシナム(Ｓ．Ｌｉｍａｃｉｎｕｍ) ＳＲ２１と同様に高含有率のＣ２２ ＰＵＦＡ、極めて低レベルのＣ１８およびＣ２０ＦＡを含み、奇数鎖飽和脂肪酸（１５：０および１７：０）も生成していた。さらに、ＯＮＣ−Ｔ１８、ＳＲ２１およびＫＨ１０５株に対する炭素および窒素利用プロファイルの分析は、同様な同化パターンを示した。ＯＮＣ−Ｔ１８株中のｎ−６ＤＰＡの含有量は６〜１０％の範囲であり、生物圏におけるｎ−６ＤＰＡの出現が限られていることを考えると非常に高いように思われる。しかしながら、同様なｎ−６ＤＰＡのレベルがＮａｋａｍｕｒａら［J．Am．Oil Chem．Soc．73：1421−1426、(1996)］によりシゾキトリウム種ＳＲ２１（６〜１０％）で、Ｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎら［Comp．Biochem．Physiol．29：805−81、(1969）］によりＴ．ａｕｒｅｕｍ（９．５％）およびＴ．ｒｏｓｅｕｍ（６．６％）で報告されている。
３つの異なった培養形態（１）寒天プレート、（２）三角フラスコおよび（３）バイオリアクター中、同じ培地（図１３）上で生育したＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸プロファイルの分析は、寒天プレートからバイオリアクターへの存在するＰＵＦＡの多様性の減少と、ＴＦＡの全体的な増加とを示す。具体的には、寒天プレートは一連のＰＵＦＡを示すが、フラスコおよびバイオリアクターで生育した培養物は１つまたは２つの中間体が優性であった（図１３）。攪拌タンク培養器中よりフラスコ培養でよく生育するスラウストキトリウム・アウレウム［Iidaら、J．Ferment．Bioeng．81：76-78、(1996)］と比較して、ＯＮＣ−Ｔ１８はバイオリアクター中でより良好に生育した。この結果は、シゾキトリウム種ＳＲ２１が機械的攪拌に対する耐性が高く、したがってバイオリアクターの条件下で生存することを見出したＮａｋａｍｕｒａら［J．Am．Oil Chem．Soc．73：1421−1426、(1996)］の結果と一致した。
さらに、スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８のプレート、フラスコおよびバイオリアクター培養でカロテノイド色素が生成されることが見出され、プレートが淡いオレンジ色となった。これらの抗酸化物質の産生は、脂肪酸生産と平行してバイオリアクター培養内で最大である。さらに、ＨＰＬＣ−質量分析を使用してこれらの抗酸化物質化合物が様々なＰＵＦＡと接合しているアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンであることが同定された（図１４）。同様な結果が原生動物のスラウストキチド（Thraustochytid）グループのメンバー間で報告された。具体的には、シゾキトリウム・アグレタガム（Schizochytrium Aaggregatum）がエキネノンおよびカンタキサンチンを生産する（Valadon、Trans．Br．Mycol．Soc．67：1-15、1976）ことが示されたが、Ｃａｒｍｏｎａら（Biosci．Biotechnol．Biochem．67：884-888、2003）およびＨｕａｎｇら（Mar．Biotechnol．5：450-457、2003）は、ＯＮＣ−Ｔ１８の近縁種であるスラウストキトリウム種ＣＨＮ−１によるアスタキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、フォエニコキサンチン（ＯＮＣ−Ｔ１８における様なゼアキサンチンではない）およびβ−カロテンの生産を示した（図１２）。この研究で、これらのカロテノイドの濃度は、主な化合物がアスタキサンチンでなくβ−カロテンであるＣＨＮ−１による濃度より１桁少ないことが見出された。従って、スラウストキトリウム種ではＰＵＦＡとカロテノイドの産生は、産生される貯蔵脂質が酸化から保護され得る様に結合している可能性がある。
主要な脂肪酸成分（ミリスチン酸、パルミチン酸およびオレイン酸）の相対量が、培養物の生育条件を変えることにより変化し得ることが先に示されている［Iidaら、J．Ferment．Bioeng．81：76-78、(1996)］。この様にして、最終脂肪酸の組成、従って培養中に制御して所望のＰＵＦＡの物性を操作することができる（Sijtsmaら、Recent Res．Devel．Microbiol．2：219-232、1998）。ＯＮＣ−Ｔ１８におけるバイオマスおよびオメガ−３ＰＵＦＡ産生の双方を阻害する因子を制限する試みで、栄養培地中の炭素、窒素および海塩成分を操作する（表９）と共に、培養期間も操作した（図１５）。
表９：スラウストキトリウム種ＯＮＣ−Ｔ１８の平均バイオマス生産（ＳＤ≦１５％）、全脂肪酸（ＴＦＡ）およびＤＨＡ含有量
Figure 2010511377
この研究において、窒素の濃度が減少すると全脂肪酸含有量が増加し、酵母抽出物およびグルタミン酸ナトリウムの濃度が１％（ｗ／ｖ）で最高の全脂肪酸含有量（約８０％）が得られた。しかしながら、低窒素濃度での培養も細胞の生育、従って全脂肪酸の生産を制限した。この実験で８ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウムおよび２ｇ／Ｌの酵母抽出物を用いることにより最適な生産が得られ、２６．１ｇ／Ｌのバイオマスおよび４．５ｇ／ＬのＤＨＡが生成された（表９）。さらに、炭素を１００ｇ／Ｌまで増加するとＤＨＡ収量を効果的に増加したが、これはシゾキトリウム種ＳＲ２１で得られた結果と一致しており（Yokochiら、Appl．Microbiol．Biotech．49：72-76、(2003)］、１０ｇ／Ｌ以上のグルコース濃度が阻害的であるというＴ．ａｕｒｅｕｍの結果と対照的である［Iidaら、J．Ferment．Bioeng．81：76-78、(1996)］。４．０ｇ／Ｌ以上の最大のＤＨＡ収量がグルコース培地で得られ、その収量はＴ．ａｕｒｅｕｍ［Bajpaiら、J．Am．Oil Chem．Soc．68：509−514、(1991)］およびＴ．ｒｏｓｅｕｍ［LiおよびWard、J．Ind．Microbiol．13：238−241、(1994)］による収量の５倍以上であり、シゾキトリウム種ＳＲ２１およびＫＨ１０５の収量と同等であった［Akiら、J．Am．Oil Chem．Soc．80：789-794、(2003)］。最後に、ＯＮＣ−Ｔ１８は古典的な広塩性能力を示し、２．０〜５０．０ｇ／Ｌの範囲の塩濃度に耐性であり、バイオマス生産性は２５〜３０％の範囲で変化した（図９）。同じ実験でＤＨＡのｇ／Ｌ値は最適の４．６ｇ／Ｌから最小の２．５ｇ／Ｌの間で４５％まで変化することが見出された（表９）。
５Ｌバイオリアクター中で１６８時間にわたってＯＮＣ−Ｔ１８により生産されたバイオマス、ＴＦＡおよびＤＨＡを図１５に示す。示した増殖曲線は、同じ条件下で達成されたものの典型例である。最大のバイオマス産生は炭素源（すなわちグルコース）の飢餓点に近い１２０時間後に到達した。これは、７０％バイオマス付近でバイオマスの全脂肪酸含有量が最大に達するポイントでもある。僅か２４時間の培養後にＤＨＡ含有量が全脂肪酸の３０％に達し、その後は２０〜２５％の一定値であることは興味深いことである。これらの結果は他の脂肪酸生産スラウストキチド（Thraustochytid）株の結果と符合するが、これらの反応を生じる速度に関しては相違がある。
（ｃ）考察
以前の最もよく研究されたＬａｂｙｒｉｎｔｕｒｏｍｙｃｏｔａの同定された株は、バイオマスの２０％以上の量の全脂肪酸を蓄積することができなかった。例えば、バイオマスの５０％までを脂肪として蓄積することができるシゾキトリウム種ＳＲ２１の単離前は、Ｔ．ａｕｒｅｕｍが２０％の最良の蓄積株であった［Bajpaiら、J．Am．Oil．Chem．Soc．68：509−514、(1991)］。一方、ＯＮＣ−Ｔ１８はそのバイオマスの８０％までを脂質として蓄積することができる。
ＯＮＣ−Ｔ１８等の油性微生物が油を蓄積するためには、典型的には窒素量を制限（通常は２４〜３６時間で消費される）し、炭素源を豊富に含む培地で生育する必要がある。窒素が枯渇すると、油性微生物は炭素源を同化し続けるが、窒素が欠乏するために細胞分裂を行うことができない（従って、タンパク質および核酸合成が阻止される）。その結果は、これらの炭素源（すなわち、グルコース等の糖）の貯蔵油への変換である。この点に関して、ＯＮＣ−Ｔ１８はＧ１３等の他のスラウストキトリド株（Bpwlesら、J．Biotechnol．70：193−202、1999；およびHuangら、Mar．Biotechnol.5：450-457、2003）より遅く生育すると考えられるが、ＤＨＡをより速い速度で生産し、上昇した量の全脂肪酸を取り込む独特の能力を示す。最後に、ＯＮＣ−Ｔ１８は極めて低い塩濃度で生育する能力を示すが、高いバイオマスおよび全脂肪酸の生産性は顕著である。工業的培養装置に対する塩水の腐食性を無視してスケールアップが可能になる。
実施例１４:化合物(脂肪酸アンタゴニスト)添加
ａ）セトキシジム添加
海塩(２５g/l)および酵母抽出物(１g/l)を含有する培地を、１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた。滅菌済グルコースを、９g/lの濃度で培地に加えた。５mg/mlの濃度でジメチルスルホキシドに溶解したセトキシジム(Supleco)を、次いで１００μMの終濃度を示す培地に加えた。同じ培地中にて培養していたＯＮＣ−Ｔ１８の２４時間前培養物（１ml）を加えた。培養を、シェーカー(１３０rpm)にて４日間室温で行った。インキュベーション後に、該細胞を４３００rpmにて１０分間の遠心分離により収集した。次いで、細胞ペレットを凍結乾燥して秤量し、該細胞から油を抽出した。
脂質を抽出して、ガスクロマトグラフィー分析(ＧＣ)のために脂肪酸メチルエステル(ＦＡＭＥ)へ誘導体化した。エステル交換および抽出を、内部標準としてＣ１９：０と共に凍結乾燥した細胞（２００ mg）を用いて行い、エステル交換反応混合物(メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１)を加えて混合し、９０℃で２時間加熱し、次いで室温で冷却させた。ＦＡＭＥを、水(１ml)およびヘキサン：クロロホルム(４：１)(２ml)を加えて抽出し、有機と水相を分けた。該有機層を抽出し、無水硫酸ナトリウム(０.５g)を用いて処理して、微粒子および残留水を除去した。該有機溶媒を、アルゴン通気下にエバポレートした。該ＦＡＭＥを、イソ-オクタン(５ml)に再懸濁し、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率％を、該産物を(該生成した産物＋加えた基質)を合計して得た生成物で割って、次いで１００を掛けて計算した。該結果を図１１に示す。また、該結果は、セトキシジンの暴露により、ＯＮＣ−Ｔ１８に蓄積したＤＨＡの含量および割合の増加をもたらすことを示す。
ｂ）実施例２：セルレニン添加
海塩(６g/l)、酵母抽出物(２g/l)、およびＬ−グルタミン酸一ナトリウム塩水和物(８g/l)を含有する培地を、１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた。次いで、滅菌済Ｄ＋−グルコースをこの培地に４０g/lの濃度で添加した。５mg/mlの濃度でエタノールに溶解したセルレニンをフラスコ(２５０ml)に加え、該溶媒を１時間エバポレートした後に培地を該フラスコに加えた。該フラスコ中のセルレニンの量は２０mg/lの終濃度であった。次いで、ＯＮＣ−Ｔ１８を、プレート培養物から該培地に添加し、室温で４日間シェーカー(１３０rpm)内で培養を行った。インキュベーション後に、細胞を、４３００rpmにて１０分間遠心分離により収集し、蒸留水で１度洗浄し、次いで４３００rpmにて１０分間再び遠心分離を行った。次いで、細胞ペレットを凍結乾燥して秤量し、該細胞から油を抽出した。
脂質を抽出し、ガスクロマトグラフィー分析(ＧＣ)のために、脂肪酸メチルエステル(ＦＡＭＥ)へ誘導体化した。エステル交換および抽出を、内部標準としてＣ１９：０と共に凍結乾燥した細胞(２００mg)を用いておこない、エステル交換反応混合物(メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１)を加えて混合し、９０℃で２時間加熱し、次いで室温で冷却した。ＦＡＭＥを、水(１ml)およびヘキサン：クロロホルム(４：１)(２ml)を加えて抽出し、有機相と水相とに分けた。該有機層を抽出し、無水硫酸ナトリウム(０.５g)を用いて処理して、微粒子および残留水を除去した。該有機溶媒を、アルゴン通気下にエバポレートした。該ＦＡＭＥを、イソ-オクタン(５ml)に再懸濁し、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率％を、該産物を(該生成した産物＋加えた基質)を合計して得た生成物で割って、その後１００を掛けて計算した。該結果を図１１に示す。また、該結果は、セルレニンの暴露により、ＯＮＣ−Ｔ１８に蓄積したＤＨＡの含量および割合が増加することを示す。
ｃ）実施例３：オレイン酸添加
海塩（６g/l）、酵母抽出物（２g/l）およびＬ−グルタミン酸一ナトリウム塩水和物（８g/l）を含有する培地を、１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた。次いで、滅菌済Ｄ＋−グルコースを、５g/lの濃度で加えるか、または培地に添加しない。オレイン酸を２ml/lの終濃度を示すように培地に加えた。次いで、ＯＮＣ−Ｔ１８を、ウィンダス培地(Windust media)(５g/l 酵母抽出物、ペプトン(５g/l)、Ｄ(＋)-グルコース(４０g/l)、ウィンダス微量成分(１.２５ ml/l)、ウィンダスビタミン(１.２５ ml/l)、海塩（４０g/l)；ウィンダス微量成分(Windust trace elements）：ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ(５g/l)、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ(３.１５ g/l)、Ｎａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ(４.３６ g/l)、ＣｕＳＯ4・５Ｈ２〇(０.６１２５ mg/l)、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ(０.０５９７g/l)、ＺｎＳＯ4・７Ｈ２０(０.０２２g/l)、ＣｏＣｌ２・６Ｈ2Ｏ(０.０１g/l)、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ(０.１８g/l)、Ｈ2ＳｅＯ3(１３μg/l)、ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ(２.７ mg/l)、Ｎａ3ＶＯ4(１.８４ mg/l)、Ｋ２ＣｒＯ4) (１.９４ mg/l) [ウィンダスビタミン：ビタミンＢ１２(１mg/l)、ビオチン(１mg/l)、チアミンＨＣｌ(０.２０ g/l)]中で培養していた１日前の接種物から、該培地に添加した。３日室温にてシェーカー(１３０rpm)中で培養した。インキュベーション後に、細胞を、４３００rpmにて１０分間遠心分離により回収し、蒸留水で１回洗浄し、次いで４３００rpmにて１０分間再び遠心分離した。次いで、該細胞ペレットを凍結乾燥して秤量し、該細胞から油を抽出した。
脂質を抽出し、ガスクロマトグラフィー分析(ＧＣ)のために脂肪酸メチルエステル(FAME)へ誘導体化した。エステル交換および抽出を、内部標準としてＣ１９：０と共に、凍結乾燥した細胞（２００mg）を用いて行い、エステル交換反応混合物(メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１)を加えて混合し、９０℃で２時間加熱し、次いで室温で冷却した。ＦＡＭＥを、水(１ml)、およびヘキサン：クロロホルム(４：１)(２ml)を加えて抽出し、有機相および水相に分けた。該有機層を抽出し、無水硫酸ナトリウム(０.５g)を用いて処理して、微粒子および残留水を除去した。有機溶媒を、アルゴン通気下にエバポレートした。該ＦＡＭＥを、イソ-オクタン(５ml)に再懸濁し、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率％を、該産物を(該生成した産物＋加えた基質)を合計して得た生成物で割って、その後１００を掛けて計算した。該結果を図１１に示す。また、該結果は、オレイン酸の添加により、ＯＮＣ−Ｔ１８に蓄積したＤＨＡの含量および割合が増加することを示す。
ｄ）実施例４：カプサイシン添加
海塩(６g/l）および酵母抽出物(１０g/l)を含有する培地を、１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた。次いで、滅菌済Ｄ（＋）−グルコースを４０g/lの濃度にて培地に添加した。次いで、この培地（５０ml）をエーレンマイヤーフラスコ（２５０ml）に添加した。１０g/lの濃度でエタノールに溶解したカプサイシン(Sigma)を培地に加え、終濃度０.１g/lとした。ＯＮＣ−Ｔ１８を、プレート培養物からの該培地に加え、室温にて４日間シェーカー(１３０rpm) 内で培養した。インキュベーション後に、細胞を、４３００rpmにて１０分間、遠心分離により収集し、蒸留水で１度洗浄し、次いで４３００rpmにて１０分間再び遠心分離を行った。次いで、細胞ペレットを凍結乾燥して秤量し、該細胞から油を抽出した。
脂質を抽出し、ガスクロマトグラフィー分析(ＧＣ)のために、脂肪酸メチルエステル(ＦＡＭＥ)へ誘導体化した。エステル交換および抽出を、内部標準としてＣ１９：０と共に凍結乾燥した細胞（２００mg）を用いて行い、エステル交換反応混合物(メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１)を加えて混合し、９０℃で２時間加熱し、次いで室温で冷却した。ＦＡＭＥを、水(１ml)、およびヘキサン: クロロホルム(４：１)(２ml)を加えて抽出し、有機相と水相とを分けた。該有機層を抽出し、無水硫酸ナトリウム(０.５g)を用いて処理して、微粒子および残留水を除去した。該有機溶媒を、アルゴン通気下でエバポレートした。ＦＡＭＥを、イソ-オクタン（５ml)に再懸濁し、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率％を、該産物を(該生成した産物＋加えた基質)を合計して得た生成物で割って、次いで１００を掛けて計算した。該結果を図１１に示す。また、該結果は、カプサイシンの暴露により、ＯＮＣ−Ｔ１８中のＣ１６:０含量が低下し、Ｃ１６：１含量の増加がもたらされることを示す。
ｅ）実施例５：トルイル酸添加
海塩（２０g/l）および酵母抽出物(１０g/l)を含有する培地を、１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた。次いで、滅菌済Ｄ（＋)−グルコースを２０g/lの濃度で培地に添加した。次いで、この培地（５０ml）を、エーレンマイヤーフラスコ(２５０ml)に入れ、２０g/lの濃度でエタノールに溶解したトルイル酸(Sigma)を該培地に加え、終濃度０.２g/lとした。ＯＮＣ−Ｔ１８を、プレート培養物からの該培地に加え、室温にて４日間シェーカー(１３０rpm)内で培養した。インキュベーション後に、培養した細胞を、４３００rpmにて１０分間遠心分離により収集し、蒸留水で１回洗浄し、再度遠心分離を行った。細胞ペレットを凍結乾燥して秤量し、該細胞から油を抽出した(実施例１９)。
脂質を抽出し、ガスクロマトグラフィー分析(ＧＣ)のために、脂肪酸メチルエステル(ＦＡＭＥ)へ誘導体化した。エステル交換および抽出を、内部標準としてＣ１９：０と共に凍結乾燥した細胞（２００mg）を用いて行い、エステル交換反応混合物(メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１)を加えて混合し、９０℃で２時間加熱し、次いで室温で冷却した。ＦＡＭＥを、水(１ml)、およびヘキサン：クロロホルム(４：１)(２ ml)を加えて抽出し、有機相および水相を分離させた。該有機層を抽出し、無水硫酸ナトリウム(０.５g)を用いて処理し、微粒子および残留水を除去する。該有機溶媒を、アルゴン通気下にエバポレートした。該ＦＡＭＥを、イソ-オクタン（５ ml)に再懸濁し、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率％を、該産物を(該生成した産物＋加えた基質)を合計して得た生成物で割って、次いで１００を掛けて計算した。該結果を図１１に示す。また、該結果から、トルイル酸は、ＯＮＣ−Ｔ１８において、ＥＰＡおよびＤＰＡｎ−３の割合を増加させ、ＤＰＡ(ｎ−６)およびＤＨＡ−場合によりΔ４-脱サチュラーゼ阻害剤の割合を低下させることが示された。
実施例６：ノルフルラゾンの添加
海塩(２５g/l)および酵母抽出物(１g/l)を含有する培地(５０ml)を、１２０℃で２０分間オートクレーブに供した。次いで、滅菌済Ｄ（＋）−グルコースを、９g/lの濃度で培地に添加した。次いで、この培地（５０ml）をエーレンマイヤーフラスコ（２５０ ml）に投入した。次いで、２０g/lの濃度でジメチルスルホキシドに溶解したノルフルラゾン(Supleco)を該培地に添加して、終濃度０.２g/lとした。同一培地[海塩（２５g/l）、酵母抽出物（１g/l）、グルコース(９g/l)]で培養していたＯＮＣ−Ｔ１８の２４時間前培養物（接種物)(１ml)を加えた。培養を、シェーカー(１３０rpm)にて４日間室温で行った。インキュベーション後に、細胞を、４３００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離により収集し、蒸留水で１回洗浄し、次いで４３００rpmにて１０分間再び遠心分離した。次いで、該細胞ペレットを凍結乾燥して秤量し、該細胞から油を抽出した。
脂質を抽出し、ガスクロマトグラフィー分析(ＧＣ)のために、脂肪酸メチルエステル(ＦＡＭＥ)へ誘導体化した。エステル交換および抽出を、内部標準としてＣ１９：０と共に凍結乾燥した細胞（２００ mg）を用いて行い、エステル交換反応混合物(メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１)を加えて混合し、９０℃で２時間加熱し、次いで室温で冷却した。ＦＡＭＥを、水(１ml)、およびヘキサン：クロロホルム(４：１)(２ ml)を加えて抽出し、有機相および水相を分けた。該有機層を抽出し、無水硫酸ナトリウム(０.５g)を用いて処理して、微粒子および残留水を除去した。該有機溶媒を、アルゴン通気下にエバポレートした。該ＦＡＭＥを、イソ-オクタン（５ml)に再懸濁し、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率％を、該産物を(該生成した産物＋加えた基質)を合計して得た生成物で割って、次いで１００を掛けて計算した。該結果を図１１に示した。また、該結果から、ノルフルラゾン暴露は、ＯＮＣ−Ｔ１８に蓄積したＤＨＡの含量および割合を増加させることが示された。

Claims (60)

  1. 脂肪酸産生アンタゴニストを含む従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含む、脂質組成物を調製する方法。
  2. 脂質組成物を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. オメガ−９脂肪酸に対するオメガ-３およびオメガ−６脂肪酸の比率が増加している、請求項１に記載の方法。
  4. 全体の脂肪酸含量が変化していない、請求項３に記載の方法。
  5. 油産生微生物が、珪藻、微細藻類、真菌、細菌または原生生物である、請求項１に記載の方法。
  6. 油産生微生物が、１８Ｓ配列を有し、該１８Ｓ配列は配列番号：１に記載の配列と少なくとも９４％同一性を有する、請求項１に記載の方法。
  7. 油産生微生物が、１８Ｓ配列を有し、該１８Ｓ配列は配列番号：１に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 油産生微生物が、フィラム・ラビリンツロマイコタ由来である、請求項１に記載の方法。
  9. 油産生微生物が、ラビリンツロマイセテス網由来である、請求項１に記載の方法。
  10. 油産生微生物が、スラウストキトリダエ亜綱由来である、請求項１記載の微生物。
  11. 油産生微生物が、スラウストキトリアレ目由来である、請求項１に記載の方法。
  12. 油産生微生物が、スラウストキトリアセアエ科由来である、請求項１に記載の方法。
  13. 油産生微生物が、スラウストキトリウム属由来である、請求項１に記載の方法。
  14. 油産生微生物が、スラウストキトリウム種である、請求項１に記載の方法。
  15. 油産生微生物が、スラウストキトリウム・アウレウムである、請求項１に記載の方法。
  16. 油産生微生物が、スラウストキトリウム・ロゼウムである、請求項１に記載の方法。
  17. 油産生微生物が、スラウストキトリウム・ストリアツムである、請求項１に記載の方法。
  18. 油産生微生物が、シゾキトリウム属由来である、請求項１に記載の方法。
  19. 油産生微生物が、シゾキトリウム種である、請求項１に記載の方法。
  20. 油産生微生物が、スラウストキトリアセアエ科由来であり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２４５、２０８８８、２０８８９、２０８９０、２０８９１または２０８９２を有する、請求項１に記載の方法。
  21. 油産生微生物がＯＮＣ−Ｔ１８である、請求項１に記載の方法。
  22. 脂肪酸産生アンタゴニストが、オレイン酸、セルレニン、トルイル酸、クルクミン、シクロプロペン、アルキル没食子酸塩、プロピル没食子酸塩、ゴマ油、ピーナッツ油、キャノーラ油、ピリダジノン、ノルフルラゾン、ジフェニルアミン、セトキシジムおよびカプサイシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  23. 請求項１記載の脂質組成物を含む、送達手段。
  24. 送達手段が、マイクロカプセル、ミクロ球体、ナノ球体またはナノ粒子、リポソーム、ノイソーム、ナノエリスロソーム、固体-液体ナノ粒子、リュープロライド、ゲル、ゲルカプセル、錠剤、ローション、クリーム、スプレー、エマルジョンまたは粉末を含む、請求項２３に記載の送達手段。
  25. １次マイクロカプセルの凝集体と担持物質を含み、各個々の１次マイクロカプセルが１次殻を有するマイクロカプセルであって、担持物質が請求項１記載の組成物を含み、１次殻によりカプセル化されており、凝集体が外殻でカプセル化されている、マイクロカプセル。
  26. １次殻および／または外殻が、界面活性剤、ゼラチン、ポリ燐酸、多糖またはそれらの混合物を含む、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  27. 担持物質が、スラウストキトリウム、シゾキトリウムまたはそれらの混合物由来の油を含む、請求項２５記載のマイクロカプセル。
  28. 外殻が約１μｍ〜約２，０００μｍの平均直径を有する、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  29. 外殻が約２０μｍ〜約１，０００μｍの平均直径を有する、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  30. 外殻が約３０μｍ〜約８０μｍの平均直径を有する、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  31. １次殻が約４０ｎｍ〜約１０μｍの平均直径を有する、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  32. １次殻が約０．１μｍ〜約５μｍの平均直径を有する、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  33. 担持物質が、マイクロカプセルの約２０重量％〜約９０重量％である、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  34. 担持物質が、マイクロカプセルの約５０重量％〜約７０重量％である、請求項２５に記載のマイクロカプセル。
  35. 請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、または請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセルを含む、栄養補助剤。
  36. 栄養補助剤が、錠剤、ゲルキャップ、カプセル、液体またはシロップの形態である、請求項３５に記載の栄養補助剤。
  37. 請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセルまたは請求項３５−３６のいずれかに記載の栄養補助剤を含む、食品。
  38. 食品が、焼き製品、パスタ、肉製品、凍結乾燥乳製品、ミルク製品、チーズ製品、卵製品、調味料、スープミックス、スナック食品、ナッツ製品、植物タンパク製品、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、鶏肉製品、加工果汁、グラニュー糖、ソース、肉汁、シロップ、栄養バー、飲料、乾燥飲料粉末、ジャムまたはゼリー、幼児用配合食、またはベビーフードである、請求項３７に記載の食品。
  39. 食品が魚製品、コンパニオンペット用フード、家畜または水産養殖飼料である、請求項３７に記載の食品。
  40. 食品が、パン、トルティーヤ、穀物、ソーセージ、チキン、アイスクリーム、ヨーグルト、ミルク、サラダドレッシング、米ぬか、果汁、乾燥飲料粉末、ロール、クッキー、クラッカー、フルーツパイ、またはケーキである、請求項３７に記載の食品。
  41. 請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体に組成物を送達する方法。
  42. 被検体が哺乳類である、請求項４１に記載の方法。
  43. 被検体がヒトである、請求項４１に記載の方法。
  44. 被検体に担持物質を送達するための薬物の調製のための、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセルの使用。
  45. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体中のコレステロールレベル、トリグリセリドレベルまたはそれらの組み合わせを低下させる方法。
  46. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体に必須微量元素を補充する方法であって、該組成物、該送達手段、該マイクロカプセル、該補助剤および該食品が必須微量元素を含む方法。
  47. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７〜４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体のインスリン感受性を改善する方法。
  48. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の高血糖症を軽減する方法。
  49. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の高コレステロール血症を軽減する方法。
  50. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の体脂肪を減少する方法。
  51. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の体重減少を促進する方法。
  52. 有効量の請求項１に記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段、請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、請求項３５または３６に記載の栄養補助剤、または請求項３７−４０の何れかに記載の食品を被検体に投与する工程を含む、被検体の糖尿病を治療または予防する方法。
  53. 請求項１記載の組成物、請求項２３または２４に記載の送達手段または請求項２５−３４の何れかに記載のマイクロカプセル、および医薬担体を含む、医薬製剤。
  54. 請求項１に記載の組成物を含む、医薬製剤。
  55. 脂肪酸産生アンタゴニストを含んでいる従属栄養培地中で脂肪酸産生微生物を培養することを含む、カロテノイド組成物を調製するための方法。
  56. カロテノイド組成物を単離することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 請求項５５に記載の組成物を含む、医薬製剤。
  58. 脂肪酸産生アンタゴニストを含んでいる従属栄養培地中で油産生微生物を培養することを含む、抗酸化組成物の製造方法。
  59. 抗酸化組成物を単離することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 請求項５８に記載の組成物を含む、医薬製剤。
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