JPH1175884A

JPH1175884A - 高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法

Info

Publication number: JPH1175884A
Application number: JP9239549A
Authority: JP
Inventors: Noriaki Shirasaka; 憲章白坂; Yukari Hirai; 結香里平井; Toshihiro Yokochi; 俊弘横地; Tetsuo Murakami; 哲男村上; Hajime Yoshizumi; 肇吉栖; Akira Shimizu; 昌清水
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Nagase and Co Ltd; Suntory Ltd
Current assignee: Nagase and Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Suntory Ltd
Priority date: 1997-09-04
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 1999-03-23
Anticipated expiration: 2017-09-04
Also published as: JP3931219B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ)およびドコサペ
ンタエン酸(ＤＰＡ)生産能を有する微生物の培養におい
て、生成するＤＨＡ含有油脂中の高度不飽和脂肪酸、例
えば、ＤＰＡおよびエイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)の含
有比率をコントロールする。【解決手段】ＤＨＡおよびＤＰＡ生産能を有する微生
物をｐ−トルイル酸、タンニン酸またはシアノコバラミ
ンの存在下に培養することにより、該微生物が産生する
ＤＨＡ含有油脂中のＤＰＡおよびＥＰＡの含有比率をコ
ントロールし、ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡの含有比率
の異なる培養菌体または油脂を得ることができ、該油脂
からのＤＨＡの分離および精製を容易にすることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の培養によ
るドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法に関する。よ
り詳しくは、本発明は、ドコサヘキサエン酸およびドコ
サペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸を生産する能力
を有する微生物を培養してドコサヘキサエン酸含有油脂
を製造する際に、該微生物が生産する油脂中に含まれる
ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸またはエイコ
サペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸の含有比率をコ
ントロールする方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】ドコサヘキサエン酸(以下、「ＤＨＡ」
とも記載する)は、青魚に属する魚油に含まれ、特にイ
ワシやマグロ由来の油には２０％前後含まれている。近
年、魚油の中でもマグロ眼窩脂肪にはＤＨＡが高濃度で
含有されることが発見された。また、脂肪酸の高度精製
技術が発達したことなどから、ＤＨＡの生理活性機能に
関する研究が進展し、コレステロール低下作用、抗血液
凝固作用、制癌作用などが明らかとなってきた。さら
に、脳代謝系に関連して記憶学習能力の向上、老人性痴
呆症の予防、アルツハイマー病の治療などに効果がある
ことが明らかになっている。また、稚魚の成長必須脂肪
酸であることも明らかとなっている。このようなことか
ら、ＤＨＡは、各種食品あるいは飼料または餌料に使用
されている。

【０００３】ドコサペンタエン酸(以下、「ＤＰＡ」と
も記載する)も魚油の中に含まれることが知られている
が、その量はごく僅かであるにすぎない。また、ＤＰＡ
の生理活性機能については、未だ不明な点が多く、薬剤
を脳へ運び易くする担体として機能することなどが僅か
に知られているにすぎない[特開昭６１−２０４１３６
号]。しかし、動物体内でのＤＨＡの不足の代償とし
て、ＤＰＡが増加することが知られており[Hometown
ら、J.Neurochem., vol.51, p.45 (1988)；Hammら、Bio
chem.J., 245, p.907 (1987)；および、Rebhungら、Bio
sci.Biotech.Biochem.,vol.58, p.314 (1994)]、ＤＰＡ
が動物体内で何らかの生理的役割を有していることが示
唆される。

【０００４】このようなＤＨＡやＤＰＡを魚油から得よ
うとする場合、その含有率が低い上、魚類の回遊性など
の面から魚油が安定な供給源となりにくく、また、魚油
特有の異臭があるなどの欠点がある。

【０００５】魚油以外のＤＨＡやＤＰＡの供給源として
は、ＤＨＡおよびＤＰＡ生産能を有する微生物の培養菌
体中に蓄積した油脂(微生物オイル)が挙げられる。これ
らＤＨＡおよびＤＰＡ生産能を有する微生物としては、
深海から分離された細菌ビブリオ・マリナス(Vibrio ma
rinus)ＡＴＣＣ１５３８１、深海魚の腸内から分離され
たビブリオ属細菌、鞭毛菌類であるスラウストキトリウ
ム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)ＡＴＣＣ３
４３０４、スラウストキトリウム・エスピー(Thraustoc
hytrium sp.)ＡＴＣＣ２８２１１およびＡＴＣＣ２０８
９１、シゾキトリウム・エスピー(Schizochytrium sp.)
ＡＴＣＣ２０８８８およびＡＴＣＣ２０８９９[米国特
許Ｎo.5,340,742]、シゾキトリウム属ＳＲ２１株[Nakah
araら、J.Am.Oil Chem.Soc., Vol.73, p.1421 (199
6)]、ジャポノキトリウム・エスピー(Japonochytrium s
p.)ＡＴＣＣ２８２０７[特開平１−１９９５８８号公
報]、微細藻類であるシクロテラ・クリプティカ(Cyclot
ella cryptica)、クリプテコディニウム・コーニー(Cry
ptocodenium cohnii)[特開平５−５０３４２５号公
報]、エミリアニア[特開平５−３０８９７８号公報]な
どが知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＤＨＡやＤＰＡの供給
源としての前記微生物が生産する油脂には、ＤＨＡ、Ｄ
ＰＡ、エイコサペンタエン酸(以下、「ＥＰＡ」とも記
載する)などの高度不飽和脂肪酸が含有されている。こ
れら高度不飽和脂肪酸の含有比率や生産量は、微生物の
種類により異なり、所望の含有比率の油脂を収率良く得
ることは困難である。一方、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡな
どの高度不飽和脂肪酸含有比率を変化させることができ
れば、天然の魚油の組成により近くなるばかりか、個々
の高度不飽和脂肪酸を分離および精製する操作がより容
易なものとなる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく１５５種類の化合物について検討した結
果、ｐ−トルイル酸、タンニン酸またはシアノコバラミ
ンの存在下にドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエ
ン酸生産能を有する微生物を培養することにより、該微
生物の産生するＤＨＡ含有油脂中のＤＰＡやＥＰＡ含量
を変化させることができるという知見を得、本発明を完
成した。即ち、本発明は、ドコサヘキサエン酸およびド
コサペンタエン酸生産能を有する微生物を培養して高度
不飽和脂肪酸含有油脂を製造する方法において、ｐ−ト
ルイル酸、タンニン酸およびシアノコバラミンからなる
群から選択される添加剤の存在下に該微生物を培養する
ことを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
を提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本明細書中に記載した「ドコサヘ
キサエン酸(ＤＨＡ)」とは(ｎ−３)系のＤＨＡを、ま
た、「ドコサペンタエン酸(ＤＰＡ)」とは(ｎ−３)系お
よび／または(ｎ−６)系のＤＰＡを指す。また、本明細
書において、「油脂」、「脂質」および「オイル」なる
用語は同じ意味で使用する。

【０００９】本発明におけるドコサヘキサエン酸および
ドコサペンタエン酸生産能を有する微生物としては、例
えば、シゾキトリウム属またはスラウストキトリウム属
に属する微生物を挙げることができる。これらの微生物
のうち最も好ましいものとしては、シゾキトリウム属Ｓ
Ｒ２１株(工業技術院生命工学工業技術研究所に「海生
菌ＳＲ２１菌株」の名称で平成７年３月６日付けで寄託
され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５０３４を取得してい
る)を挙げることができる。

【００１０】培地中に添加するｐ−トルイル酸、タンニ
ン酸またはシアノコバラミンの量は、１.０ｇ／Ｌ以下
であれば良く、０.０２〜０.２ｇ／Ｌの範囲が好まし
い。

【００１１】本発明において前記微生物を培養するに
は、その菌株を予め培養して得られた前培養液を、液体
培地または固体培地に接種し、培養する。培地は、天然
海水または人工海水、あるいは調製した合成培地であっ
てもよい。

【００１２】培地に添加する炭素源としては、グルコー
ス、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルト
ース、可溶性デンプン、フコース、グルコサミン、デキ
ストランなどの炭水化物の他、オレイン酸、ダイズ油な
どの油脂類や、グルタミン酸、糖蜜、グリセロール、マ
ンニトール、酢酸ナトリウムなどの一般的に使用されて
いるものをいずれも使用できるが、これらに限られるも
のではない。

【００１３】窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、
麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープ
リカーなどの天然窒素源、グルタミン酸ナトリウム、尿
素などの有機窒素源、または、酢酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなど
の無機窒素源を用いることができる。

【００１４】この他、必要に応じてリン酸カリウム、リ
ン酸二水素カリウムなどのリン酸塩、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸
銅、塩化カルシウムなどの無機塩およびビタミン類も微
量栄養源として使用できる。

【００１５】これらの培地成分は、微生物の生育を害し
ない濃度であれば特に制限はない。一般的には、炭素源
は培地１リットル当たり０.６〜６０ｇの濃度で用いて
よい。窒素源は、炭素源の増加に伴って増加させるのが
望ましい。

【００１６】培養は、液体培地を用い、フラスコによる
振盪培養でも、通気撹拌培養でもできる。通常の撹拌式
発酵槽あるいは気泡塔型培養装置を使用することもでき
る。また、培養温度は２０〜４０℃の範囲であってよ
く、培養期間は３〜５日間であるのが望ましい。

【００１７】培養終了後、培養液から遠心分離や濾過な
どの常用の固液分離手段を用いて培養菌体を得る。菌体
を十分に水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥
や風乾などによって行うことができる。

【００１８】このようにして得られる培養菌体を、その
まま動物の飼料や魚類の餌料として用いることができ
る。また、この菌体から、次のようにしてＤＨＡ、ＤＰ
ＡおよびＥＰＡなどを含有する油脂を採取することがで
きる。さらに、所望によりＤＨＡ、ＤＰＡまたはＥＰＡ
を単離することもできる。

【００１９】油脂の採取は、乾燥菌体を、例えばダイノ
ミルや超音波などにより破砕し、次いで、好ましくは窒
素気流下で有機溶媒によって抽出することによって行
う。有機溶媒としては、エーテル、ヘキサン、メタノー
ル、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油
エーテルなどを用いることができる。また、メタノール
と石油エーテルの交互抽出あるいはクロロホルム−メタ
ノール−水の一層系の溶媒を用いる抽出によっても良好
な結果を得ることができる。抽出液から減圧下で有機溶
媒を留去することにより、高濃度のＤＨＡ、ＤＰＡおよ
びＥＰＡを含有する油脂が得られる。また、上記の方法
に代えて、湿菌体を用いて抽出を行うことができる。こ
の場合には、メタノールやエタノールなどの水と相溶性
の有機溶媒と水の混合溶媒を使用する。その他の手順は
上記と同様である。

【００２０】このようにして得られる油脂中には、ＤＨ
Ａ、ＤＰＡおよびＥＰＡなどの高度不飽和脂肪酸が、中
性脂質(例えば、トリグリセリド)または極性脂質(例え
ば、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノ
ールアミン、フォスファチジルイノシトール)の形で存
在している。培養菌体から採取したＤＨＡ、ＤＰＡおよ
びＥＰＡ含有油脂からのＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ含
有トリグリセリドの精製は、例えば冷却分離法またはカ
ラムクロマトグラフィー法などにより行うことができ
る。

【００２１】ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ含有油脂から
のＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡの分離および精製は、油
脂を加水分解し、得られる混合脂肪酸をそのままあるい
は混合脂肪酸エステルとした後、常法(例えば、尿素付
加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法など)
により行うことができる。

【００２２】

【実施例】次に、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。実施例１シゾキトリウム属微生物による油脂の製造
(１) シゾキトリウム属ＳＲ２１株について、容量５００ｍｌ
の三角フラスコに、以下の組成の培地１００ｍｌを仕込
み、以下の条件で撹拌培養を行った。(１)培地組成（ｇ
／Ｌ）１）グルコース：２０２）ポリペプトン：１０３）酵母エキス：５４）５０％人工海水：１Ｌ５）ｐ−トルイル酸：０、０.０２、０.０５、０.１、
０.２ (２)培養条件１）培養温度（℃）：２８２）撹拌数（ｒｐｍ）：１００

【００２３】培養後、遠心分離により菌体を集め、１０
５℃で３時間乾燥した。乾燥菌体１０ｍｇを１０％ＨＣ
lを含むメタノール溶液とジクロロメタンの等量混合液
に溶解し、５０℃で３時間熱処理することにより、脂肪
酸メチルエステルを調製した。これをガスクロマトグラ
フィーにかけ、脂肪酸組成を分析した。ガスクロマトグ
ラフィーの分離条件を下記に示す。 (３)分離条件１）カラム：キャピラリーカラム、ＴＣ−７０ＧＬサイエンス社（GL SCIENCE Co. Ltd.) 内径０.２５ｍｍ×長さ３０ｍ２）流速：０.８ｍｌ／分、１００ｋＰａ（カラム頭部圧力）３）キャリアーガス：窒素ガス４）カラム温度：昇温モード、１７０〜２２０℃（４℃／分）５）検出：ＦＩＤ

【００２４】この結果を以下の表１に示す。

【表１】ｐ−トルイル酸濃度 16:0 20:5 22:5 22:6 その他 (g/L) (%) (%) (%) (%) (%) (EPA) (DPA) (DHA) 0 19.5 0.9 11.0 52.4 16.2 0.02 20.7 2.4 7.3 52.3 17.3 0.05 29.3 3.7 4.3 51.3 11.4 0.1 31.7 7.3 3.7 54.9 2.4 0.2 34.1 8.5 2.4 50.0 6.0 酵素処理したマグロＤＨＡ油脂 11.4 6.3 2.5 42.0 38.8

【００２５】実施例２シゾキトリウム属微生物による
油脂の製造(２) シゾキトリウム属ＳＲ２１株について、容量５００ｍｌ
の三角フラスコに、以下の組成の培地１００ｍｌを仕込
み、実施例１と同条件で撹拌培養を行った。培地組成（ｇ／Ｌ）１）グルコース：２０２）ポリペプトン：１０３）酵母エキス：５４）５０％人工海水：１Ｌ５）タンニン酸：０.０５培養後、実施例１と同様にして脂肪酸メチルエステルを
調製した。これを、実施例１と同条件でガスクロマトグ
ラフィーにかけ、脂肪酸組成を分析した。この結果を図
１に示す。結果からわかるように、タンニン酸を添加し
たときには、対照と比較して、ＥＰＡに相当するピーク
の減少が認められた。

【００２６】実施例３シゾキトリウム属微生物による
油脂の製造(３) シゾキトリウム属ＳＲ２１株について、容量５００ｍｌ
の三角フラスコに、以下の組成の培地１００ｍｌを仕込
み、実施例１と同条件で撹拌培養を行った。培地組成（ｇ／Ｌ）１）グルコース：２０２）ポリペプトン：１０３）酵母エキス：５４）５０％人工海水：１Ｌ５）シアノコバラミン：０.０５培養後、実施例１と同様にして脂肪酸メチルエステルを
調製した。これを、実施例１と同条件でガスクロマトグ
ラフィーにかけ、脂肪酸組成を分析した。この結果を図
１に示す。結果からわかるように、シアノコバラミンを
添加したときには、対照と比較して、奇数鎖脂肪酸であ
る１５：０および１７：０の割合が減少し、偶数鎖脂肪
酸である１４：０の割合が増加した。これは、シアノコ
バラミンがＳＲ２１株のアミノ酸代謝に何らかの影響を
与え、奇数鎖脂肪酸の前駆体が供給されなくなったため
と推定される。

【００２７】実施例４シゾキトリウム属微生物由来の
油脂のカラム精製実施例１の方法に従い０.２ｇ／Ｌのｐ−トルイル酸を
含む培地で培養して得た菌体を乾燥して乾燥菌体を得
た。この乾燥菌体をクロロホルムとメタノールとの混合
溶媒中でガラスビーズを用いて破砕し、濾過した後、ヘ
キサンで抽出することにより油脂を得た。得られた油脂
を、ヘキサン中、水酸化カリウムを含むエタノールの添
加によってエステル化した。常法に従って後処理するこ
とにより、脂肪酸のエステル体を含む油脂混合物を得
た。この油脂混合物は、ガスクロマトグラフィーによる
分析によれば、ＤＨＡエチルエステルを約５０％、ＤＰ
Ａエチルエステルを約２.４％、ＥＰＡエチルエステル
を８.５％含有していた。

【００２８】この油脂混合物につき、下記条件での液体
クロマトグラフィーによりＤＨＡエチルエステル、ＤＰ
ＡエチルエステルおよびＥＰＡエチルエステルを分離し
た。即ち、粒子径５０μｍ、細孔径１２０オングストロ
ームおよび炭素含有率１７％のオクタデシルシラン(Ｏ
ＤＳ)充填剤[YMC＊GEL ODS-AM-120-S50]を充填した内径
４００ｍｍおよび長さ２０００ｍｍのカラムを用いてＨ
ＰＬＣに付した。上記の油脂混合物１.２ｋｇをメタノ
ール中の１０％溶液として上記カラムに導入し、メタノ
ールを使用して４.４リットル／分の流速で溶離し、分
画を得た。各分画につき溶媒を留去し、ＤＨＡエチルエ
ステル３３０ｇ、ＤＰＡエチルエステル２ｇ、ＥＰＡエ
チルエステル８２ｇを得た。

【００２９】

【発明の効果】本発明に従えば、微生物が産生するＤＨ
Ａ含有油脂に含まれる高度不飽和脂肪酸のうち、例えば
ＤＰＡやＥＰＡの含有比率を変化させることができるの
で、ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡの含有比率の異なる培
養菌体または油脂を得ることができ、所望により魚油由
来のＤＨＡ含有油脂組成物と同様の油脂組成物を得るこ
ともできる。また、微生物培養によって得たＤＨＡ含有
油脂からＤＨＡを分離および精製するに際し、分離がよ
り困難なＤＰＡ含量を減少させることは、ＤＨＡの分離
および精製を容易にするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】培地に添加物を加えたときに微生物が産生し
た油脂中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで調べ
た結果を示すチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)上記１名の復代理人弁理士青山葆（外２名） (72)発明者白坂憲章京都府京都市北区紫竹栗栖町13 朝倉ビル 301 (72)発明者平井結香里大阪府寝屋川市上市上神田１−25−６ (72)発明者横地俊弘茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者村上哲男奈良県奈良市西千代ヶ丘２−３−34 (72)発明者吉栖肇奈良県奈良市中山町西２−950−68 (72)発明者清水昌京都府京都市右京区常盤山下町６−９

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタ
エン酸生産能を有する微生物を培養して高度不飽和脂肪
酸含有油脂を製造する方法において、ｐ−トルイル酸、
タンニン酸およびシアノコバラミンからなる群から選択
される添加剤の存在下に該微生物を培養することを特徴
とする高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法。
【請求項２】ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタ
エン酸生産能を有する微生物が、シゾキトリウム属また
はスラウストキトリウム属に属する微生物である請求項
１記載の製造方法。
【請求項３】ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタ
エン酸生産能を有する微生物が、シゾキトリウム属ＳＲ
２１株(ＦＥＲＭＢＰ−５０３４)である請求項１記載
の製造方法。