MX2008007860A - Cepa de thraustochytrido sc1 productora de acido docosahexaenoico (dha). - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al análisis de una cepa no reportada de thraustochytriales-SC1 que produce cantidades importantes de ácido docosahexaenoico (DHA) y también acumula sus ácidos grasos intermedios respectivos además de DHA; este organismo ha sido aislado de los remansos de Goa a través del método de Carga de Polen; el perfil de ácido graso y las secuencias ribosómicas de 18S de cada uno de estos organismos se ha descrito indicando su filogenia molecular; el organismo en estudio posterior puede ser muy importante para su uso en la producción comercial de DHA.

Description

CEPA DE THRAUSTOCHYTRIDO SC1 PRODUCTORA DE ACIDO DOCOSAHEXAENOICO (DHA) CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere al análisis de una cepa novedosa no reportada de thraustochytrido SC-1 que produce cantidades comparables de ácido docosahexaenoico aislado a partir de los remansos del Goa por el método de cebo de Polen. Se describen los perfiles de ácido graso del organismo aislado indicando la producción de ácidos grasos omega-3 en cantidades significativas. También se revela la secuencia de ARNr 18S de los organismos aislados que indica su filogenie molecular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El interés en la importancia nutricional de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) aumentó de manera importante durante la pasada década. Los ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos de cadena larga que contienen dos o más enlaces dobles. El interés en ellos surge por su potencial en aplicaciones terapéuticas, alimenticias y nutricionales. Se producen comercialmente a partir de plantas de semillas seleccionadas y algunas fuentes marinas. Pero se está volviendo inadecuada la producción de los PUFA purificados a partir de las fuentes actuales para satisfacer el mercado en expansión (Gilí y Valivety 1997). Para cumplir con el aumento esperado en la demanda y para superar los inconvenientes de los aceites de pescado, actualmente se están desarrollando procedimientos para la producción alternativa de PUFA. Los PUFA se agrupan en dos series basándose en la posición del enlace Terminal, siendo 3C o 6C desde el átomo de carbono terminal de la cadena de ácido graso. Éstos generalmente se clasifican en dos grupos principales, los omega-6 (?6 o n-6) y los omega-3 (serie ?3 o n-3). De los ácidos grasos omega-6, el ácido araquinodico está ganando una particular importancia, ya que es el principal percursor de muchas prostaglandinas y eicosanoides, y entre los ácidos grasos omega-3 actualmente el ácido docosahexaenoico está recibiendo mucha atención y se le ha denominado como "Acidos grasos esenciales". El ácido docohexaenoico (DHA) es un ácido graso omega-3 insaturado, con una longitud de 22 carbonos, normalmente se encuentra en el pescado y en las plantas marinas. Ha ganado una importancia significativa debido al lecho de que es el principa! bloque de construcción en el tejido del cerebro humano, y es el ácido graso estructural primario en la materia gris del cerebro y en la retina. Los descubrimientos recientes demuestran una correlación entre los bajos niveles de DHA y ciertas condiciones de compartimiento y neurológicas asociadas con el envejecimiento, como la demencia, depresión, pérdida de memoria y problemas visuales, lo que demuestra la importancia fisiológica del DHA para los seres humanos.

Recientemente el WHO recomendó cubrir el 1-2% de la captación diaria de energía a partir de los ácidos grasos omega-3, que corresponde a aproximadamente de 2.2 a 4.4 g diarios basándose en la captación en una dienta de 2000 calorías. La captación de los PUFA omega-3 a través de la dieta ocurre principalmente por medio del consumo de comida de mar, la cual es característicamente rica en PUFA omega-3. La captación promedio varía entre las poblaciones. Esta fuerte demanda ha dado como resultado la introducción a gran escala de granjas marinas de pescado y el crecimiento desarrollo normales de varias larvas marinas de pescado depende de la suplementación de los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 en la dieta, especialmente DHA y el ácido eicosapentaenoico (Rodríguez et al. 1998). En la actualidad aceites de pescados seleccionados y especies de microalgas son las principales fuentes industriales del DHA. Los aceites de pescado con los niveles más altos de EPA y DHA incluyen caballa, arenque y salmón. Algunos pescados, como el bacalao, la merluza, almacenan la mayor parte de la grasa en el hígado. Se piensan que las mejores fuentes sin los pescados de agua fría como el atún, caballa, sardinas, arenque y trucha de lago. Pero para obtener los beneficios máximos del DHA de los aceites de pescado, de preferencia se tiene que comer pescado crudo o hervido, y además se debe comer la piel que está detrás de las agallas alrededor de las aletas y a lo largo del estomago ya que estás áreas son en donde se almacena la mayor parte del aceite. Debe de recordarse pertinentemente que la luz, el calor y el oxígeno disminuyen los EPA y DHA en los aceites de pescado. Debido a que los aceites de pescado están poliinsaturados, se vuelven ranceos rápidamente. El pescado ranceo huele a pescado y por lo tanto no es muy apetitoso. La aplicación de los PUFA a partir de aceites de pescado o su inclusión en las fórmulas infantiles también tiene muchas desventajas. Por lo general los aceites de pescado contienen ácido eicosapentanoico, un componente no deseable en las fórmulas para niños ya que producen niveles reducidos de ácido araquidonico en los infantes. También está correlacionado con las tazas reducidas en el peso infantil. También, los suministros de aceite de pescado pueden resultar poco confiables debido a la falla o a la variabilidad de distintas pescaderías. Se ha vuelto una preocupación de que no se encuentre disponible el suficiente aceite de pescado para cumplir con las demandas globales de DHA. Como una alternativa para el aceite de pescado, los PUFA se pueden obtener a partir de microorganismos. En particular, se piensa que las algas marinas son productores principales de los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 en la cadena alimenticia marina. Estos microorganismos marinos representan el mayor porcentaje de especies marinas no descritas (Colwell 1997) de las cuales la microalga marina constituye una gran fuente potencial del ácido docosahexaenoico. La fuente potencial de aceites n-3 es el grupo de micro-heterótrofos llamados thraustochytridos. Estos son un grupo de organismos heterotróficos, no fotosintéticos, que actualmente están clasificados en el reino Stramenophila, junto con los oomycetes y labyrinthulids. Se han estudiado los miembros de los géneros Schizochtrium y Thraustochytriuma como potenciales productores de omega-3 para uso industrial, debido a su alto contenido de Iípidos y alto niveles de DHA. Algunas veces estas especies también se clasifican como hongos marinos. Los Thraustochytridos son el nombre común de los microheterótrofos que se alimentan como saprobes u ocasionalmente como parásitos. Los Thraustochytridos tiene una amplia distribución geográfica con cepas aisladas proveniente de la antártica, del mar del norte, de la india, Japón y Australia (revisado por Lewis et al., 1999). Rara vez se encuentran en plantas vivientes y parecen ser inhibidos por agentes antimicrobianos vegetales. Los miembros de estos grupos con frecuencia abundan en el material vegetal muerto autóctono así como en el alóctono, como en las macroalgas y en las hojas sumergidas de los manglares. Son comunes en las columnas de agua nerítica y oceánica y los sedimentos incluyen el lecho marino profundo. En comparación con los aceites de pescado, los microbios pueden proporcionar un suministro estable de ácidos grasos que se pueden producir fácilmente en masa, tiene menos olor a pescado y DHA altamente purificado y otros PUFA. Varios estudios recientes han catalogado la capacidad de las cepas de thraustochytridos para producir: 1 . Una alta biomasa en el cultivo. 2. Una alta proporción de lípido como parte de esta biomasa. 3. Una alta proporción de PUFA en el lípido. La mayoría de los reportes referentes a la producción de PUFA por Thraustochytridos se refieren casi exclusivamente a la producción de DHA, ya que esté compuesto es el PUFA más abundante producido por muchas de las cepas de PUFA reportadas hasta la fecha. Los niveles altos de DHA también se encontraron en dinoflagelados, como Crypthecodiníum cohni y la especie Amphidinium. Los datos que están disponibles en la literatura científica demuestran la gran variación en la biomasa, los lípidos y los rendimientos máximos de DHA obtenidos para diferentes cepas de thraustochytrido. Por ejemplo el Schizochytrium aggregatum produjo una biomasa de 0.9g por litro después de 10 días (Vazhappilly y Chen, 1998), mientras que se logró una biomasa de 48g por litro después de 4 días utilizando Schizochytrium sp. SR21 (Yaguchi et al., 1997). Es muy claro que el desarrollo de un procedimiento para la producción de PUFA microbial requiere de la selección del microorganismo apropiado y de las técnicas de cultivo optimizadas. Para lograr una producción mejorada de productos ricos en PUFA, se necesita negociar las siguientes estrategias clave: 1 .- Aislamiento adicional, análisis y mantenimiento de las cepas productoras de PUFA: ya han sido aisladas varias cepas con el potencial para la producción comercial de aceites ricos en DHA. Sin embargo, si los thraustochytridos que producen rendimientos más altos de PUFA y/o perfiles más atractivos de PUFA se pueden aislar y optimizar. Bien puede aumentar la demanda de estos aislados y de los compuestos. 2. - La optimización de la eficiencia de la producción de PUFA: los tipos y las cantidades de PUFAs producidos por cepas individuales de thraustochytridos son susceptibles a la manipulación variando las condiciones de cultivo. La mejora de los perfiles de PUFA utilizando técnicas moleculares también se puede tener en consideración. Diferentes mercados harán una demanda de cepas que produzcan altos niveles de PUFA medidos ya sea en términos de biomasa (es decir, masa celular de la producción de PUFA p/p) o volumen (es decir, medio de fermentación de producción p/v). 3. - Se utiliza Schizochytrium sp. para producir DHA por cultivo electrófico (OmegaTech, Boulder, Colorado, E.U.A.). Un inconveniente principal de las cepas de Schizochytrio es la producción de ácido docosapentanoico omega-6 (DPA) en los aceites microbianos, además de DHA (Nakhara et al.1996: Yokochi et al. 998: Ratledge 2001). Las propiedades nutracéuticas de DPA actualmente no son muy conocidas, y por lo tanto no es deseable su presencia en los aceites para aplicaciones alimenticias y farmacéuticas. Resulta difícil y costosa la separación del DPA de DHA. La presente invención se refiere al aislamiento de varias cepas de thraustochytridos, de las cuales unas cuantas cepas producen cantidades significativas de ácido docosahexaenoico (DHA; C22:6, n-3) que fueron analizadas a partir de hojas muertas y dendritas de plantas vasculares marinas llamadas mangles que fueron recogidas de los remansos del Goa. Estas cepas tendrán una importancia significativa para la producción comercial del ácido docosahexanoico.

TENICA ANTERIOR Huang et al., describieron el agrupamiento de traustochytridos recién aislado productores de ácido docosahexaenoico, basándose en sus perfiles de ácido graso poliinsaturado y el análisis comparativo de los genes de ARNr 18S. Se analizaron 7 cepas de microbios marinos productores de una cantidad significativa de DHA a partir del agua marina recogida en las áreas costeras de Japón y Fiji. Éstas acumulan sus ácidos grasos intermedios respiratorios adema de DHA. Estos aislados resultaron ser nuevos thraustochytridos por su secuencias de inserción especifica en lo genes de ARNr 18S. El árbol filogenético construido por el análisis molecular de los genes de ARNr 18S provenientes de los aislados y los thraustochytridos típicos demuestra que las cepas con el mismo perfil de PUFA forman cada grupo monofilético. Estos resultados sugieren que el perfil de C20-22 PUFA puede ser apreciable como una característica efectiva para agrupar los thraustochytridos. Fan et al., publicaron en el Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001 ) el artículo que describe la producción de ácido Eicosapentanoico y ácidos docosohexanoicos mediante nueve cepas de thraustochytridos y el potencial utilizando okara de los thraustochytridos. Estas cepas de thraustochytridos fueron aisladas a partir de los mangles subtropicales y fueron analizadas para la producción potencial de los ácidos grasos anteriores en un medio de levadura de glucosa. También se evaluó su capacidad de utilizar okara (residuo de leche de soya) para el cultivo y la producción de EPA y DHA. El rendimiento de EPA fue lento en la mayoría de las cepas, mientras que el nivel de DHA fue alto en el medio externo de levadura de glucosa, produciendo 28.1 -41.1 % de los ácidos grasos totales.para todas las cepas, con la excepción del Ulkenia sp. KF13. El rendimiento de DHA del mangle Schizochytrium varió de 747.7 a 2778.9 mg/L después de 52 horas de fermentación a 25 C. La publicación titulada "Profiles of polyunsaturated fatty acids produced by Thraustochytrium sp KK17-3 se refiere al aislamiento de más de 300 cepas de microorganismos produciendo ácidos graso poliinsaturados (PUFA) que se volvieron a aislar a partir de agua de mar costera del mar de la isla Seto y alrededor de la isla Iromote, en Japón, mediante el método de cebo. Se clasificaron los perfiles de PUFA a partir de las cepas productoras de DHA en cuatro tipos. Después se eligió una cepa llamada KK17-3 para un estudio adicional debido a su alto contenido de DHA (52.1 % del total de ácido graso) y un amplio rango de otros PUFAs incluyendo ácido araquidonico, ácido eicosapentanoico y ácido docosapentanoico, así como DHA. El análisis filogenético molecular de las secuencias de genes de ARNr 8S demostraron que KK17-3 es un Thraustochitrido.

Otra publicación por Bowles et al., se refiere a la producción de ácido graso polinsaturado n-3 de cadena larga, por miembros del grupo de protistan marino de thraustochytrido. Se llevó a cabo el análisis de los aislados seguido por la optimización de la producción de DHA. El programa de aislamiento se llevó a cabo a partir de tres ubicaciones diferentes, se analizaron 57 aislados por su biomasa, el aceite, y la producción de ácido docosahexanoico (DHA). El DHA presentó el 50% del total de ácidos grasos presentes en estos aislados. Algunos estudios también han indicado que un medio con una alta relación C:N estimuló la producción de DHA. La producción óptima de DHA fue de 2.17g por litro después de 107 horas de cultivo. La publicación titulada "Fatty acid composition and the Squalene content of the Marine micro algae Schizochytrium mangrovie". Esta publicación se refiere a la identificación de la composición de ácido graso y el contenido de escualeno del Thraustochytrids S.mangrovie que fue recién aislado a partir de hojas marchitas de Kandelia candel en el habitad del manglar de Hong Kong. Los constituyentes principales de ácido graso en las tres cepas de mangle fueron ácido tetradecanoico, ácido hexadecanoico, ácido docosapentanoico, y ácido docosahexanoico. El DHA fue el ácido graso polinsaturado más predominante y el porcentaje de DHA (ácidos grasos totales) en estas cepas varió de 32.29 a 39.14%.

La patente No WO9801536 describe los microorganismos que pertenecen al género Shewanella o pseudoalteromonas que pueden producir ácido docosahexanoico en un período corto. Nuestra invención se refiere a la identificación de 10 cepas no reportadas de Thraustochytrido que habitan en las hojas muertas y en las dendritas de plantas basculares marinas llamadas mangles de los remansos del Goa. Después del aislamiento, se llevó a cabo el análisis GC-MS para determinar el contenido total de ácido graso. Las secuencias de ARNr 1 8S de estos organismos indican su filogenia. En un estudio adicional, estos organismos pueden ser eficientes productores a gran escala de ácido docohexanoico.

Listado de secuencias: Seq ID 1 : representa la secuencia de ARNr 18S de SC1 Seq ID 2: representa la secuencia ribosomal 18S de AVE1 Seq ID 3: representa la secuencia ribosomal 18S de AVE2 Seq ID 4: representa la secuencia ribosomal 18S de AVE3 Seq ID 5: representa la secuencia ADN ribosomal 18S de AVE4 Seq ID 6: representa la secuencia ADN ribosomal 18S de AVE5 Seq ID 7: representa la secuencia ribosomal 18S de AVE6 Seq ID 8: representa la secuencia ribosomal 18S de AVE7 Seq ID 9: representa la secuencia de ADN ribosomal 18S de AVE8 Seq ID 10: representa la secuencia ribosomal 18S de AVE8 DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las cepas de thraustochytrido habitan en las hojas muertas y en los dendritos de plantas basculares marinas llamadas mangles. Las hojas secas de estas plantas fueron recolectadas en los remansos del Goa y se aislaron por el método de sebo de polen. Estas hojas se cultivaron en agua marina estéril con antibióticos (estreptomosina y penicilina) y granos de polen de pino durante 3 días. Estos polen fueron inoculados otra vez en agua marina estéril nueva con antibióticos. Des pues de 3 días de incubación se examinaron los polen bajo el microscopio. Se encontraron 10 cepas diferentes de thráustóchytrio y fueron emplacadas sobre placas de agar MV (Sal de grano -34%, Peptona - 0.15%, extremo de lavadura -0.1%, Glucosa -2%, KH2PO4-0.025%, pH 7) durante 5 días con antibióticos. Los thraustochytrios formaron una colonia/capa sobre la placa. Estos thraustochytrios fueron inoculados con un medio MV nuevo con antibióticos. Después de 3 días de crecimiento de obtuvo el cultivo puro. Los thraustochytrios fueron cultivados durante un periodo de 5 días y las células se sometieron a un análisis GC-MS para determinar el contenido total de ácido graso.

Análisis de los thraustochvtridos para identificar las cepas que producen altas cantidades de DHA Se extrajo el total de lípidos de los cultivos utilizando el método Folch de extracción con 2:1 v/v de cloroformo: metanol. Para la cuantificación del total de lípidos así como de los ácidos grasos individuales se agregó un estándar interno (ácido heptadecanoico o pentadecanoico) antes de la extracción. Se extrajeron los ácidos grasos se eterificaron y se llevo a cabo un análisis GC-MS con un cromatografo de gases Agilent 6890 N conectado a un espectrómetro de masas Agilent 5973 y GC en un cromatografo de gases HP 6850 Series equipado con un detector de FID. La detección del GC-MS se llevo a cabo a 70 eV (m/z 50-550; fuente a 230°C y cuádruple a 150 °C) en el modo El con una columna de capilaridad (30 m, HP-5ms, WCOT, i.d. 0.25 mm, grosor de película µp horno 2 min a 150°C, 6 °C min"1 a 300 °C, 20 min a 300°C, flujo de gas portador de helio , 1 .0 ml/min, relación de división 50:1 ) Para GC-FID,, se utilizó la columna de capilaridad DB-23 (30m, WCOT, i.d. 0.25 mm, grosor de película 0.5 µ?t?) La temperatura del horno se programo como 2 min a 160 °C, 6°C min"1 a 180°C a 4°C min"1 a 230 °C y 10 min a 230 °C, con un flujo de gas portador de N2, 1 .5 ml/min, y temperatura del inyector a 230 °C y temperatura del detector a 250 °C; relación de división 50:1. El perfil de ácido graso de las 10 cepas aisladas está representado en el cuadro. Cepas SC1 AVE1 AVE2 AVE3 AVE4 AVE5 AVE6 AVE7 AVE8 AVE9 C14:0 3.5 14.4 1.5 0.9 1.8 5 1.1 4.5 - - C15:0 1 8.5 1.8 1.4 5 0.6 2.3 2.3 - - C16:0 54.4 46 32.5 7.6 25.6 49.4 18.3 49.8 14.5 12.2 C17:0 0.1 - 1.6 0.5 8.6 0.4 5.3 0.3 0.4 1.4 C18:0 1.6 1.9 4.1 1.8 10.5 1.4 6.2 1.5 6.5 9.0 C18:1 - - 28 1 12 - 14.1 0.1 51.2 65.3 C18:2 - - 3.4 0.5 4.3 - 9 - 21.7 6.2 C20:0 - - 0.4 - 0.8 0.2 0.6 0.2 4.2 1.1 C20:4 0.2 0.3 1.4 - 4.2 0.4 7 0.5 - - C20:5 1.1 0.7 1.3 - 0.7 0.8 1.4 0.8 - - C22:4 - - - - 0.3 - 0.8 - - - C22:5 6.8 8 5.1 - 7.2 6.9 10.6 6.7 - - C22:6 30.9 20.1 7.5 0.9 7.1 32.5 10.3 30.8 - - El perfil de ácido graso de estas cepas sugiere que los AVE5, AVE7 y SC-1 producen cantidades comparables de DHA. El AVE1 también es un buen productor de DHA, sin embargo, las otras cepas no producen grandes cantidades de DHA.

Secuenciación del ARNr 18s de los thraustochytridos Se amplificó la secuencia de ARNr 1.7kb 18s de SC-1 , AVE5 y AVE7 que tenían un alto contenido de DHA, a partir de los genomas utilizando cebadores para las regiones conservadas. Se hicieron secuencias del fragmento amplificado. Las secuencias están representadas en el listado de secuencias. De esta manera se ve que las tres cepas -SC-1 , AVE5 y AVE7 son productores de DHA. Estas cepas han sido depositadas en el Microbial Type Culture and Gene Bank (MTCC), Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, India. Estos organismos pueden demostrar, con un estudio adicional, que son muy eficientes en la producción comercial de DHA en grandes cantidades.

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Los microorganismos productores de ácido docosahexaenoico (DHA) y otros ácidos grasos omega-3/intermediarios de ácido graso seleccionados del grupo que comprende el género Thraustochytrium.

2. - Los microorganismos productores de ácido graso omega-3 de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque comprenden la secuencia de ARN 18S representada por la SEQ ID 1 .

3. - Los microorganismos productores de ácido graso omega-3 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados además porque producen más del 30% de ácido docosahexaenoico.

4.- Los microorganismos productores de ácido graso omega-3 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados además porque producen más del 25% de ácido docosahexaenoico.

5. - Los microorganismos productores de ácido graso omega-3 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados además porque producen más del 20% de ácido docosahexaenoico.

6. - Los microorganismos productores de ácido graso omega-3 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados además porque producen más del 15% de ácido docosahexaenoico.

7.- Los microorganismos productores de ácido graso omega-3 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados además porque producen más del 10% de ácido docosahexaenoico.