CN101370929A - 生产二十二碳六烯酸(dha)的破囊壶菌菌株-sc1 - Google Patents

生产二十二碳六烯酸(dha)的破囊壶菌菌株-sc1 Download PDF

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Abstract

发明涉及筛选一种未报道的破囊壶菌菌株－SC1，其产生明显数量的二十二碳六烯酸(DHA)，并且除了DHA以外还积累其各自的中间体脂肪酸。已经通过花粉饵诱法从果阿的死水中分离出这种有机体。已经揭示了每个这种有机体的脂肪酸谱和18S核糖体序列，显示了其分子系统发生。通过进一步的研究该有机体可在DHA的商业生产应用中有非常重要的意义。

Description

生产二十二碳六烯酸(DHA)的破囊壶菌菌株-SC1
发明领域
发明涉及筛选一种新型的未报道过的生产相当数量的二十二碳六烯酸的破囊壶菌(Thraustochytrid)菌株-SC1，该菌株是利用花粉饵诱法(Pollen baiting method)从果阿(Goa)死水中分离的。公开了显示生产相当数量的ω-3脂肪酸的分离的有机体的脂肪酸谱。也公开了分离的有机体的18S rRNA序列该序列表明了它们的分子系统发生。
发明背景
近十年来，人们对多不饱和脂肪酸(PUFAs)的营养重要性的兴趣明显增加。多不饱和脂肪酸是含有两个或多个双键的长链脂肪酸。对它们更加感兴趣的原因在于它们在治疗、食物和营养应用中的潜力。在市场中它们产于选择的种子植物和一些海洋来源。但是，来自于现有来源的提纯的PUFA产品已经无法满足正在增长的市场的需要(Gill和Valivety 1997)。为了满足需求的预期增长并且规避鱼油的缺点，目前正在开发PUFA的替代生产程序。
根据从脂肪酸链末端碳原子的端键位置是3C还是6C将PUFA分为两个系列。通常将它们分为两个主要的组，ω-6(ω6或n-6)和ω-3(ω3或n-3系列)。在ω-6脂肪酸中，花生四烯酸尤其重要，因为它是多种前列腺素和类花生酸的主要前体，而在ω-3脂肪酸中，目前二十二碳六烯酸正在受到广泛关注并且被称为“必需脂肪酸”。
二十二碳六烯酸(DHA)(非饱和的、22-碳长的ω-3脂肪酸)通常发现于鱼类和海洋植物中。因为如下事实：它是人脑组织的主要构造单元，并且是脑灰质以及视网膜中的主要结构脂肪酸，所以它非常重要。最近的发现表明，DHA低水平和某些衰老相关的行为与神经疾病有关联，例如痴呆、抑郁、记忆丧失和视力问题，证明了DHA对人的生理学重要性。
WHO最近建议每日能量摄取的1-2％为ω-3PUFA，根据2000卡路里的饮食摄取对应于每日大约为2.2到4.4g。我们主要通过消费海洋食物来进行ω-3PUFA的饮食摄取，这些食物具有富含ω-3PUFA的特征。不同人群的平均摄取量是不同的。这种强烈需求导致了大规模海洋养鱼场的形成，并且根据在饮食中ω-3多不饱和脂肪酸(尤其是DHA和二十碳五烯酸)的补充进行一些海洋鱼类幼体的正常生长和发育(Rodriguez等人1998)。
目前，经选择的鱼油和微藻类物种是DHA的主要工业来源。具有最高水平的EPA和DHA的鱼油包括鲭、鲱和鲑鱼。一些鱼，例如鳕鱼、黑线鳕，主要在肝脏中储存脂肪。虽然最好的来源是冷水鱼，例如，金枪鱼、沙丁鱼、鲱和湖红点鲑。但是为了从鱼油中获得最大的DHA收益，人们不得不最好吃生鱼或煮熟的鱼，而且人们应该吃腮后面鳍周围和沿着腹部的皮，因为这些区域是储存油最多的地方。必须适切注意的是，光、热和氧气都减少鱼油中的EPA和DHA。因为鱼油是高度多不饱和的，所以它们会快速腐败。腐败的鱼闻起来是腥臭的，因此不会促进食欲。来自于鱼油的PUFA或其婴儿配方包裹体也有许多缺点。鱼油通常含有二十碳五烯酸，一种婴儿配方中的不良成分，因为它能导致婴儿体内花生四烯酸水平的下降。这和婴儿体重获得率下降有关。
并且，因为渔业的枯竭或多种变化，鱼油供应有可能是不可靠的。人们担忧无法具有满足全球DHA需求的充足的鱼油。
作为鱼油的替代物，可以从微生物中获得PUFA。尤其是，海藻被认为是海洋食物链中ω-3多不饱和脂肪酸的主要提供者。这些海洋微生物代表了最大比例的未描述的海洋物种(Colwell 1997)，其中海洋微藻构成了二十二碳六烯酸的巨大的潜在来源。
n-3油的潜在来源是被称为破囊壶菌的微-异养生物群。这是一群非光合异养生物，目前和卵菌纲(oomycetes)与拟网黏菌(labyrinthulids)一起被归类于金黄藻菌鞭毛菌界(Stramenophila)。因为裂殖壶菌(Schizochytrium)和破囊壶菌(Thraustochytrium)属成员具有高脂容量和高水平DHA，所以人们已经将其作为潜在的工业用ω-3生产者进行了研究。这些物种有时还被分类为海洋真菌。破囊壶菌是微异养生物(腐生生物或有时作为寄生虫)的常见名字。破囊壶菌具有广泛的地理分布，在南极洲、北海、印度、日本和澳大利亚分离到了其菌株(Lewis等人进行了综述，1999)。在活的植物中几乎找不到它们，并且看起来它们被植物抗微生物剂所抑制。这些群体的成员经常富存于死亡的本地植物和外来植物物质中，例如巨藻和水下的红树林叶子。它们通常存于浅海和海洋水柱(watercolumn)和沉淀物中，包括深海。
和鱼油相比，微生物能提供稳定的脂肪酸供应，该脂肪酸能容易地被大量生产，鱼腥味更少，并具有高纯度的DHA和其它PUFA。
最近一些研究已经罗列了破囊壶菌菌株能产生
1.在培养中高生物量
2.高比例的脂，作为这种生物量的一部分
3.在脂中高比例的PUFA
论及利用破囊壶菌产生PUFA的多数报告讨论的几乎都是DHA生产，因为根据到目前为止的报告，这种化合物是许多破囊壶菌菌株产生最多的PUFA。
高水平的DHA还被发现于甲藻中，例如氮源对隐甲藻(Crypthecodinium cohni)和前沟藻(Amphidinium species)。在已有的科学文献中的数据表明，不同破囊壶菌菌株在生物量、脂和最大DHA产出中有很大不同。例如，集生裂殖壶菌(Schizochytriumaggregatum)在10天后产生0.9g每升的生物量(Vazhappilly和Chen，1998)，而裂殖壶菌SR21在4天后达到48g每升的生物量(yaguchi等人，1997)。非常清楚的是，开发微生物PUFA生产方法需要选择合适的微生物和最优化的培养技术。
为了增加富PUFA产物的生产，需要商谈下述关键策略：
1.进一步的分离、筛选和维护PUFA生产菌株：已经分离了一些具有富含DHA的油的商业生产潜力的菌株。但是，可以分离并优化具有更高PUFA产量和/或更有吸引力的PUFA谱的破囊壶菌。对这些分离物和化合物的需求会持续增大。
2.PUFA生产效率的优化：可以通过改变培养条件容易地操纵个别破囊壶菌菌株生产的PUFA的类型和数量。还可以考虑使用分子技术改进PUFA谱。不同的市场将需求生产高水平PUFA的菌株，其中通过生物量(即，PUFA产量w/w细胞量)或容量(即，产量w/v发酵培养基)来检测生产水平。
3.通过异养培养使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)生产DHA(OmegaTech，Boulder，Colorado，USA)。裂殖壶菌菌株的一个主要缺点是在微生物油中除了DHA以外还产生ω-6二十二碳五烯酸(DPA)(Nakhara等人1996：Yokochi等人1998：Ratledge 2001)。目前还不太了解DPA的营养食品特性，因此不希望在用于食物和药物应用的油中存在此物质。从DHA中分离DPA是困难的并且是昂贵的。
本发明涉及分离破囊壶菌的数种菌株，其一些菌株产生明显数量的二十二碳六烯酸(DHA；C22：6，n-3)，筛选自从果阿的死水中收集的死树叶和被称为红树林的海洋维管植物的树突(dendrites)。这些菌株在二十二碳六烯酸商业生产中将具有显著意义。
背景技术：
Huang等人根据新分离的产生二十二碳六烯酸的破囊壶菌的多不饱和脂肪酸谱和18S rRNA基因的比较分析，对其进行了分组。在从日本和斐济沿岸区域收集的海水中筛选出产生明显数量的DHA的海洋微生物的7个菌株。除了DHA以外，它们积累其中间呼吸中间体脂肪酸。根据18S rRNA基因中的特殊的插入序列，证明这些分离株是新的破囊壶菌。根据分离株和典型破囊壶菌的18S rRNA基因的分子分析，构建了系统树，显示出具有相同PUFA谱的菌株构成了每个聚类单元。这些结果表明，C20-22 PUFA谱可以作为用于破囊壶菌分组的有效特征。
Fan等人在工业微生物学和生物技术杂志(the Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology)(2001)中发表了论文，描述了9种破囊壶菌菌株产生二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸和破囊壶菌的利用豆渣的潜力。从亚热带红树林中分离出这些破囊壶菌菌株，并且对其在葡萄糖酵母培养基中生产上述脂肪酸的潜力进行筛选。还评价了它们利用豆渣(豆浆残渣)用于生长和EPA与DHA生产的能力。在多数菌株中EPA产率低，而所有菌株(除了吾肯氏壶菌(Ulkenia sp.)KF13以外)在葡萄糖酵母培养基中DHA水平高，产生28.1-41.1％的总脂肪酸。巨增裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovie)在25℃中发酵52小时的DHA产率范围是747.7到2778.9mg/L。
标题为“破囊壶菌KK17-3产生的多不饱和脂肪酸谱”的文献涉及了利用饵诱法从日本濑户内海(Seto Inland Sea)沿岸海水和环西表岛(Iromote Island)海水中新分离300多种产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的微生物菌株。产生DHA的菌株的PUFA谱被分为四类。随后因为一种名为KK17-3的菌株具有高DHA含量(总脂肪酸的52.1％)，并且具有范围广泛的其它PUFA，除了DHA以外还包括花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸，因此选择它作进一步的研究。18S rRNA基因序列的分子系统发生分析显示，KK17-3是一种破囊壶菌。
Bowles等人发表的另一篇文章涉及破囊壶菌的海洋原生生物成员生产长链n-3多不饱和脂肪酸。进行分离株的筛选，随后优化DHA生产。在3个不同的地区进行分离程序，针对生物量、油和二十二碳六烯酸的生产(DHA)筛选了57个分离株。在这些分离株中DHA占总脂肪酸的50％。一些实验还表明，高C:N比的培养基能刺激DHA的产生。最佳DHA生产为培养107小时后2.17g每升。
文章标题为“海洋微藻巨增裂殖壶菌的脂肪酸成分和角鲨烯含量”。该文章涉及鉴定破囊壶菌S.mangrovie中的脂肪酸组成和角鲨烯含量，该菌株是从香港红树林产地的腐烂的秋茄树(Kandeliacandel)叶子中新分离出来的。在三种mangrovie菌株中主要的脂肪酸成分是十四烷酸、十六烷酸、二十二碳五烯酸(docosapentanoicacid)和二十二碳六烯酸。DHA是最主要的多不饱和脂肪酸，并且在所有三种菌株中DHA的百分比(占总脂肪酸的)为32.29到39.14％。
专利WO9801536描述了属于斯瓦尼菌属或假交替单胞菌属的微生物能在短期培养中产生二十二碳六烯酸。
我们的发明涉及鉴定10种未报道的破囊壶菌菌株，生长于果阿的死水中的死树叶和被称为红树林的海洋维管植物的树突(dendrites)中。分离后，对有机体进行GC-MS分析来测定其总脂肪酸含量。这些有机体的18S rRNA序列表明了它们的系统发生。通过进一步的研究，这些有机体有可成为二十二碳六烯酸的有效的大规模生产者。
附图说明：
图1破囊壶菌不同菌株的脂肪酸谱
序列列表：
Seq ID 1：描述了SC1的18S核糖体序列
Seq ID 2：描述了AVE1的18S核糖体序列
Seq ID 3：描述了AVE2的18S核糖体序列
Seq ID 4：描述了AVE3的18S核糖体序列
Seq ID 5：描述了AVE4的18S核糖体DNA序列
Seq ID 6：描述了AVE5的18S核糖体DNA序列
Seq ID 7：描述了AVE6的18S核糖体序列
Seq ID 8：描述了AVE7的18S核糖体序列
Seq ID 9：描述了AVE8的18S核糖体DNA序列
Seq ID 10：描述了AVE9的18S核糖体序列
发明详述：
破囊壶菌(Thraustochytrium)菌株生长于死亡的叶子和被称为红树林的海洋维管植物的树突中。从果阿的死水中收集这些植物的死叶子，并通过花粉饵诱法进行分离。在含有抗生素(链霉素和青霉素)和松树花粉粒的无菌海水中培养该叶子3天。将这些花粉再接种到含有抗生素的无菌海水中。接种3天后，在显微镜下检测花粉。发现了10种不同的破囊壶菌菌株，并将其涂板到含有抗生素的MV(岩盐-3.4％，蛋白胨-0.15％，酵母提取物-0.1％，葡萄糖-2％，KH2PO4-0.025％，pH 7)琼脂平板上培养5天。破囊壶菌在平板上形成克隆/层。在新鲜的含有抗生素的MV培养基中接种这些破囊壶菌。生长3天后，获得纯培养物。培养破囊壶菌5天，对细胞进行GC-MS分析，检测总脂肪酸含量。
筛选破囊壶菌鉴定产生大量DHA的菌株。
利用Folch提取法使用2:1v/v的氯仿：甲醇从培养物中提取总脂。为了总脂和个别脂肪酸的定量，在提取前加入内标物(十七酸或十五酸)。提取脂肪酸，酯化，并用Agilent 6890N气相色谱仪-Agilent5973质谱仪联用进行GC-MS分析，在装备有FID检查器的HP 6850Series气相色谱仪进行GC分析。在EI模式下，70eV(m/z 50-550；源source温度为230℃，并且四极杆(quadruple)为150℃)，使用毛细管柱(30m，HP-5ms，WCOT，i.d.0.25mm，膜厚度0.25μm，烘烤为150℃中2min、6℃min-1到300℃、在300℃中20min，Helium载气流，1.0ml/min，分流比50:1)进行GC-MS检测。对于GC-FID，使用毛细管柱DB-23(30m，WCOT，i.d.0.25mm，膜厚度0.5μm)。烘烤温度程序设计为在160℃中2分钟，6℃min-1到180℃，在180℃中2分钟，4℃min-1到230℃和230℃中10分钟，使用N2载气流，1.5ml/min，并且进样器温度为230℃，检测器温度为250℃，分流比50:1。
分离的10个菌株的脂肪酸谱见图1。
这些菌株的脂肪酸谱表明，AVE5、AVE7和SC-1产生的DHA量相当。AVE1也是一种相当的DHA生产者。但是，其它菌株无法生产大量的DHA。
破囊壶菌的18s rRNA序列
使用针对保守区的引物从基因组中扩增高DHA含量的SC-1、AVE5和AVE7的1.7kb 18s rRNA序列。对扩增出的片段进行测序。序列见序列列表。这三种菌株-SC-1、AVE5和AVE7被看作为DHA生产者。这些菌株已经保持于印度昌迪加尔的微生物技术研究所(IMTECH)典型微生物菌种保藏中心和基因库(MTCC)中(Microbial Type CuitureCollection and Grene Bank(MTCC))。
这些有待于进一步研究的有机体能够证明在大量DHA商业生产中是非常有效的。
序列表
Figure A200580052523Q00113
Figure A200580052523Q00115
Figure A200580052523Q00116
Figure A200580052523Q00118
Figure A200580052523Q00119
Figure A200580052523Q00120
Figure A200580052523Q00122
Figure A200580052523Q00123
Figure A200580052523Q00124
Figure A200580052523Q00125
Figure A200580052523Q00127

Claims (7)

1.选自破囊壶菌属的生产二十二碳六烯酸(DHA)和其它ω-3脂肪酸/脂肪酸中间体的微生物。
2.根据权利要求1的生产ω-3脂肪酸的微生物，其包含SEQ ID1所描述的18S RNA序列。
3.根据权利要求2的生产ω-3脂肪酸的微生物，其生产超过30％的二十二碳六烯酸。
4.根据权利要求2的生产ω-3脂肪酸的微生物，其生产超过25％的二十二碳六烯酸。
5.根据权利要求2的生产ω-3脂肪酸的微生物，其生产超过20％的二十二碳六烯酸。
6.根据权利要求2的生产ω-3脂肪酸的微生物，其生产超过15％的二十二碳六烯酸。
7.根据权利要求2的生产ω-3脂肪酸的微生物，其生产超过10％的二十二碳六烯酸。
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