KR20010085827A - 탄소원으로부터 바닐린의 합성 - Google Patents

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Abstract

탄소원로부터 바닐린의 생산을 위한 생명공학적 합성의 개요가 제공된다. 본 발명의 생물학적 변환 방법은 바닐린 산을 위한 탄소원의 미생물 촉진 변환의 단계들과 이어서 바닐린을 생산하기 위한 바닐린 산의 효소 촉진 환원 단계를 포함한다. 본 발명의 미생물 촉진 변환 단계는, 재조합 미생물에 의해 제공되는 다섯 개 효소를 필요로 한다. 바람직한 실시예에 있어서, 재조합 미생물은 3-디하이드로쉬키민산의 탈수 및 생성되는 프로토카테큐인산의 입체선택적 메틸화에 적합하도록 디자인된 대장균(Escherichia coli)이다. 본 발명의 효소 촉진 환원 단계는 아릴-알데히드 탈수소효소에 의해 바닐린 산을 환원시켜 바닐린을 제조하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 아릴-알데히드는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa: 개미산염과 포름알데히드를 이용하는 빵곰팡이)로부터 정제된다.
바닐린의 바이오촉매를 사용한 합성은 환경 친화적이며, 경제적으로 유리하고, 초기 물질로서 풍부한 재생 가능 원료를 사용한다.

Description

탄소원으로부터 바닐린의 합성{SYNTHESIS OF VANILLIN FROM A CARBON SOURCE}
자연산 바닐린은 보라빛 바닐라 플래니폴리아(Vanilla planifolia)의 열매(beans)가 다중 처리 공정을 거칠 때 글루코바닐린(glucovanillin, 도 1)으로부터 생산된다. (Ranadive, A.S., in Spices, Herbs, and Edible Fungi, Charalambous, G., Ed., Elsevier: Amsterdam, p. 517(1994)) 포도나무 재배, 콩 수확, 꽃의 수작업 수분 작용 기간 중에 시행되어야 하는 세심한 관리 때문에, 자연 바닐린은 세계적인 1.2×107kg/yr 수요에 대해 단지 2×104kg/yr 만을 공급할수 있다. (Clark, G.S., Perfum. Flavor, 15:45(1990)) 이 때문에 대부분의 향료 적용에 있어서 자연 바닐린 대신 인공 바닐린을 사용하게 된다. 벤젠 유도된 과이어콜(도 1)로 글리옥실린 산을 축합하는 것이 바닐린 제조를 위한 일반적인 방식이다. (Ranadive, A.S., in Spices, Herbs, and Edible Fungi, Charalambous, G., Ed., Elsevier: Amsterdam, p. 517(1994); Clark, G.S., Perfum. Flavor, 15:45(1990); Esposito, L. et al., Kirk-othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Fourth Ed., Kroschwitz, J.I.; Howe-Grant, M., Ed.; Wiley; New York, Vol. 24:812(1997)). 한정된 바닐라 열매의 공급은, 페룰산을 자연적 또는 자연산 동등 향료로 표기하기 위해 적절한 바닐린으로 변환하기 위한 미생물 및 식물 섬유 배양의 이용에 대한 광범위한 연구로 이끌었다. (Falconnier, B. et al., J. Biotechnol. 37:123(1994); Lesage-Meessen, L. et al., J. Boitechnol. 50:107(1996); Lesage-Meessen, L. et al., Appl. Microbiol, Biotechnol. 47:393(1997); Labuda, I.M. et al., U.S. Patent No. 5,279,950(1994); Westcott, R.J. et al., Phytochemistry 35:135(1994))
바닐린은 음식 첨가물을 위한 시장 크기의 면에서 보면 아스파탐 다음에 두 번째이다. 바닐라 플래니폴리아 꼬투리로부터 유출된 바닐라 추출물은 자연 향료라는 표시를 할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 바닐라 향료의 상대적으로 적은 양만이 단지 바닐라 플래니폴리아 재배로부터 유도될 수 있다. 벤젠 유도된 과이어콜(guaiacol)로부터의 바닐린 합성은 따라서 바닐린의 대량 제조의 기반이 된다. 그러나 이러한 바닐린은 자연 향료라는 표시를 할 수 없고,벤젠 유도된 과이어콜(guaiacol)로부터 합성된 바닐린은 환경 친화적이 아니다. 페룰래이트 유도된(ferulate-drived)바닐린은, 그것이 자연 향료로 표시될 수 있음에도 불구하고, 페룰산을 처리하기 위하여 사용되는 미생물과 배양 식물 섬유는 바닐린의 낮은 역가(titers)(약 1 g/L)를 제공한다. (Falconnier, B. et al., J. Biotechnol, 37:123(1994); Lesage-Meessen, L. et al., J. Biotechnol. 50:107(1996); Lesage-Meessen, L. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:393(1997); Labuda, I.M. et al., U.S. Patent No. 5,279,950(1994); Westcott, R.J. et al., Phytochemistry 35:135(1994)) 그 다음의 문제는 페룰산의 입수 가능성이다. 옥수수 섬유는 페룰산 에스테르를 풍부하게 가지고 있지만, 상업적인 양의 분리 공정 및 이러한 페룰산의 처리가 어려운 점이 있다.
따라서, 바닐린을 합성하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 바람직한 목적이다. 또한 경제적으로 유리한 바닐린을 합성하는 방법을 제공하고자 하는 것이다. 또한, 환경 친화적인 바닐린을 합성하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 또한 초기 물질로서 재생 가능한 풍부한 원료를 이용하는 바닐린을 합성하는 방법을 제공하는 것이 바람직한 목적이다.
본 발명은 미합중국 농업부 승인 번호 95-37500-1930 및 국립 과학재단 승인 번호 CHE963368 수정 002 에 의하여 부분적으로 지원받았다. 따라서 미합중부 정부는 본 발명에 대하여 일정 권리를 가진다.
본 발명은 바닐린을 위한 탄소원의 변환에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 바닐린 산을 위한 탄소원의 미생물 촉진 변환과 바닐린을 생산하기 위한 바닐린 산의 미생물 촉진 환원법에 의하여 탄소원로부터 바닐린을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
제 1도는 바닐린을 생산하기 위한 다양한 합성경로를 도시한 개략도이다.
제 2도는 본 발명의 합성경로를 도시한 개략도이다.
제 3도는 세포(g/L)상의 다양한 구성성분과 바닐레이트(mM)의 세포외 축적의 시간에 따른 효과를 보여주는 그래프이다.
제 4도는 글루코즈로부터 합성된 바닐린의1H NMR이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 탄소원로부터 바닐린의 생산을 위한 생명공학적 합성의 개요가 제공된다. 한 실시예에 있어서, 본 발명의 생물학적 변환 방법은 바닐린 산을 위한 탄소원의 미생물 촉진 변환의 단계들과 이어서 바닐린을 생산하기 위한 바닐린 산의 효소 촉진 환원 단계를 포함한다. 도 2의 합성 도식에서 도시된 바와 같이, 본 발명의 미생물 촉진 변환 단계는, 재조합 미생물에 의해 제공되는 다섯 개 효소를 필요로 한다. 바람직한 실시예에 있어서, 재조합 미생물은 3-디하이드로쉬키민산의 탈수 및 생성되는 프로토카테큐인산의 입체선택적 메틸화에 적합하도록 디자인된 대장균(Escherichia coli)이다. 본 발명의 효소 촉진 환원 단계는 아릴-알데히드 탈수소효소에 의해 바닐린 산을 환원시켜 바닐린을 제조하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 아릴-알데히드는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa: 개미산염과 포름알데히드를 이용하는 빵곰팡이)로부터 정제된다.
여기서 제공된 바닐린의 바이오촉매를 사용한 합성은 환경 친화적이며, 경제적으로 유리하고, 초기 물질로서 풍부한 재생 가능 원료를 사용한다.
본 발명의 또 다른 목적, 장점 및 특징은 상세한 설명 및 청구항, 별첨한 도면에 의해 보다 상세히 드러날 것이다.
탄소원로부터 바닐린을 생산하기 위한 생명공학적 합성이 제시된다. 이러한 합성에 기초를 둔 탄소원로부터 바닐린을 생산하는 방법 또한 제시된다. 한 실시예에 있어서, 탄소원이 재조합 미생물에 의해 바닐린산으로 변환되고, 이어서 아릴-알데히드 탈수소효소에 의해 바닐린산을 바닐린으로 환원하는 단계를 포함하는 방법이 제시된다. 바람직한 실시예에 있어서, 아릴-알데히드 탈수소화효소는 뉴로스포라 크라사로부터 분리된다.
탄소원의 미생물 촉매에 의한 전환 및 뒤이은 바닐 바닐린 산의 효소 촉매에 의한 환원에 대해 주로 상세히 설명되고 있지만, 또 다른 실시예에서, 단일 재조합 미생물이 탄소원을 바닐린 산으로 변환시키기 위하여 사용되며 또한 바닐린 산을 환원시키기 위해서 역시 사용될 수 있는데, 예를 들면, 바닐린산 합성 미생물은 또한 아릴-알데히드 탈수소 효소를 발현시킨다. 이러한 "단일 미생물 변환"은, 대장균(E. coli), 클레브시엘라(Klebsiella), 뉴로스포라(Neurospora), 노카르디아(Nocardia) 그리고 사카로마이세스(Saccharomyces)를 포함하지만 이들에만 한정되지는 않는, 원하는 결과를 얻기 위하여 충분히 처리된 어떤 형태의 미생물에 의하여도 수행될 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 하나의 미생물에 의해 탄소원로부터 합성된 바닐린산은 이차 미생물에 의하여 바닐린으로 환원되는데, 여기서 이차미생물은 아릴-알데히드 탈수소효소를 발현한다. 이러한 "이중 미생물 전환(double-microbe conversion)"은 또한 원하는 결과를 얻기 위하여 충분히 처리된 다양한 타입의 미생물에 의하여 수행될 수 있다. 뉴로스포라와 노르디카는 이차 미생물로 바람직하며, 양자 모두 자연적으로 아릴 알데히드 탈수소효소를 발현하는 것으로 알려져 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 탄소원의 미생물 촉매에 의한 전환은 3-디하이드로쉬키민산으로 되고, 3-디하이드로쉬키민산을 바닐린으로 전환시키는 단계가 뒤따른다. 다른 예에서는, 미생물 촉배를 사용하여 탄소원을 프로토카테큐인산으로 전환하고, 다시 프로토카테큐인산을 바닐린으로 전환하게 된다. 프로토카테큐인산 및/또는 3-디하이드로쉬키민산의 전환은 이러한 전환을 위하여 처리된 이차 재조합 미생물에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 바이오 변환 방법은, 탄소원을 바닐린으로 최대한 전환시키는 시간, 온도, pH, 영양제 형태와 농도, 공기쐬기 조건(aeration condition), 메티오닌 추가 및 제한된 글루코즈 농도 조건에서 수행된다.
특정 실시예 1에서 상세히 설명되는 바와 같이, 바람직한 실시예에 있어서, 생육-배치 발효기가 탄소원을 바닐린으로 변환하기 위하여 사용되고, 이어서 바닐린 산의 유기 추출이 뒤따르는데, 예를 들어, 발효 액(fermentation broth)의 산성화 및 유기용매로 추출이다. 생육-배치 발효기 과정과 유기 추출 방법은 또한 해당 기술 분야에서 잘 알려진 것이다.
여기서 사용된 "탄소원(carbon source)"란 용어는, 크실로스, 아라비노즈, 글루코즈 및 크렙스 사이클내의 중간체(예를 들면, 디카복실 산) 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지는 않는 생물량 유도 탄소원을 포함하는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에서, 탄소원은 글루코즈이다.
한 실시예에 있어서, 재조합 미생물 대장균(E. coli)는 본 발명에 다른 방법에서 사용된다. 바람직한 실시예에 있어서, 대장균(E. coli)은 serA 유전좌위 안에 부착된 aroB/aroZ 카세트와 돌연변이 된 aroE 유전좌위를 포함한다. 이러한 재조합 대장균(E. coli), 지정된(designated) KL7, 은 aroFFBR착점, serA 착점 그리고 PtBCCOMT 유전좌위를 갖는 플라스미드를 포함한다. aroE-코드화된 쉬키메이트 탈수소효소의 결핍은 3-디하이드로시키민산의 합성을 가져온다. 그러나, aroE 유전좌위 돌연변이가 핵심적인 것이 아니고 충분한 3-디하이드로시키민산 형성을 위하여 사용되는 것으로 인정될 것이다. 3-디하이드로시키민산은 게놈 집중(genome-localized), aroZ-코드화된 3-디하이드로쉬키메이트 탈수효소에 의하여 프로토카테큐인산으로 변환된다. 플라스미드 집중 PtBCCOMT는 프로토카테큐인산의 바닐린산으로의 변환을 위하여 카테콜-O-메틸트랜스페라제를 코드화한다. 또한 aroB의 두 복제는 효소가 더 이상 카본 흐름을 방해하지 못하는 지점에서 3-디하이드로퀴네이트 합성효소의 활성을 증가시킨다. Snell, K. et al., J. Am. Chem. Soc. 118:5605(1996)
바람직한 실시예에 있어서, 재조합 대장균(E. coli)은 aroFFBR착점, serA 착점 그리고 두 개의 PtBCCOMT 유전좌위를 갖는 플라스미드(plasmid) pKL5.97A를 포함한다. aroFFBR착점은, 일반적인 경로로 카본 흐름을 증가시키는 피드백 억제에 반응하지 않는 3-데옥시-D-아라비노-헵투로손산 7-포스패이트 합성효소 동위 효소를 코드화한다. L-세린 바이오 합성에 필요한 대장균(E. coli)의 게놈 serA 유전좌위에서의 돌연변이 때문에, 최소한의 염 배지에서의 생장 및 플라스미드 유지는 플라스미드 집중 serA의 발현으로부터 이루어진다. 따라서, serA 착점은 최소의 염 배지에서의 미생물 배양을 허용하며, 플라스미드를 포함하지 않는 미생물로부터 플라스미드를 포함하는 미생물을 구분한다.
또 다른 실시예에서, 재조합 대장균(E. coli)은 pKL5.97A의 이중 PtBCCOMT 유전좌위에 비교되는 단일 PtBCCOMT 유전좌위를 제외하고 플라스미드 pKL5.97A와 동일한 플라스미드 pKL5.96A를 포함한다.
상기의 바람직한 본 발명의 재조합 미생물, 대장균(E. coli ) KL7/pKL5.97A, 은 부다페스트 협정에 따라 메릴랜드 로크빌 파크로운 드라이브 12301 번지의 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되어 있으며, ATCC 지정 번호 98859가 주어졌다. 이러한 기탁은 ATCC 기탁소에 30년, 또는 가장 최근의 요청후 5년, 또는 특허의 존속 기간보다 더 긴 기간동안 존속될 것이고, 만일 이 기간 동안 기탁물이 고갈되는 경우 대체될 것이다. 기탁물의 견본은 공중에서 입수 가능한 것으로 기탁에 수용된 모든 제한은 본 출원이 특허로 등록되면 해제될 것이다.
다음의 도표는, 바닐린 산으로의 클루코스 전환을 위하여 필요한 다섯 개 효소, 효소를 코드화하는 유전자 및 본 발명의 예시적인 재조합 미생물의 유전자의 기원을 나타낸다.
표 1
본 발명의 방법을 수행하는 미생물로서 대장균(E. coli)이 특정하게 기술되어 있으나, 바람직한 전환(예를 들어, 탄소원에서 비닐린산, 탄소원에서 3-디하이드로쉬키민산, 탄소원에서 프로토카테큐인산, 바닐린산에서 바닐린, 3-디하이드로쉬키민산산에서 바닐린, 프로토카테큐인산에서 바닐린, 등)을 효과적으로 수행할 수 있는 당업자에게 공지된 일반적인 미생물이 다양하게 사용될 수 있다. 따라서, 여러 형태의 세균, 박테리아 및 효모가 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구성요소에서 다른 구성요소로 전환에 필요한 성능과 특성을 갖는 그러한 미생물은, 예를 들어, 선별, 변이, 및/또는 유전자 전환 과정을 통해 개발될 수 있다.
본 발명의 생물학적 전환과정을 수행하기 위해, 탄소원을 포함한 용액이 재조합 미생물과 접촉하여, 탄소원을 바람직한 구성성분, 예를 들어, 바닐린산으로 전환하기에 적당한 조건에서 유지되는 생물학적 전환체 혼합물을 형성한다. 바람직한 예에서, 생물학적 전환체 혼합물은 30 내 지 37℃ 및 pH 6.5 내지 7.5에서 유지된다. 생물학적 전환체 혼합물은 또한 재조합 미생물의 생존능력을 증진시키는 다른 기질, 예를 들어 무기염, 완충액, 보조인자, 영양 기질 등을 포함할 수 있다.메티오닌(L, D 및 L-D 혼합물)이 생물학적 전환체 혼합물에 부가될 수도 있다. 생물학적 전환체 혼합물은 바람직하게는 정상상태의 용존산소 농도에서 유지되어 글루코즈 부가 속도가 용존 산소 농도에 의해 결정되는 글루코즈 제한 조건하에서 유지된다. 발효 과정을 거친 바람직한 정상 상태는 100 내지 200마이크로몰 글루코즈 또는 5 내지 35% 공기 포화 용존 산소 농도이다. 미생물의 생존 능력을 유지하기 위한 다른 일반적인 조건들은 공지되어 있고, 미생물의 생존 능력을 유지하기 위한 특정 조건들은 문헌에 기재되어 있거나 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 바닐린산은 공지 방법에 의해 생물학적 전환체 혼합물로부터 화수될수도 있고, 아릴-알데히드 탈수소효소와 접촉하여 바닐린으로 제조될 수 있다.
본 발명의 장점을 충분히 설명하기 위해 하기의 실시예를 기재하였다. 하기의 실시예는 예에 불과하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
글루코즈로부터 바닐린의 합성
I. 결과
KL7/pKL5.26A 및 KL7/pKL5.97A를 37℃, pH 7.0 및 20%의 포화 용존 산소 조건하의 생육-배치 발효기에서 48시간동안 배양하였다. 바닐린, 이소바닐린, 프로토카테큐인, 및 3-디하이드로쉬키민 산의 과세포 증식이 미생물 성장의 중간 로그 상에서 시작되었다. 전체 생성 혼합물의 대개 5-10몰%를 차지하는 3-디하이드로쉬키민산은 생합성과 탈수 속도가 거의 동일하다. 그러나, 바닐린산에 비해 몰비가 큰 프로토카테큐인산도 3, 표 2)는 부적절한 카테콜-O-메틸트랜스페라제 활성을 나타낸다. KL7/pKL5.26A에 비해 KL7/pKL5.97A에서 카테콜-O-메틸트랜스페라제의 특성 활성의 증가가 합성된 바닐린산의 농도에 거의 영향을 나타내지 않기는 하지만, L 메티오닌의 공급량이 두 생물학적 촉매에 의해 합성된 바닐린 산 양의 거의 두배가 된다(표 2). 이소발린산에 비해 몰비로 4배 내지 6배 과량으로 합성된 바닐린산은 (표 2) 메타 히드록실 그룹 메틸화에 대한 카테콜-O-메틸트랜스페라제의 선택성에 따른 것이다.
표 2
a aroFFBRPtacCOMTserA
b PtacCOMTPtacCOMTserA
c 12시간에 시작해 매 6시간마다 0.4g/L 부가
d 특정활성: 마이크로몰/분/mg
e g/L
뉴로스포라 크라사(개미산염과 포름알데히드를 이용하는 빵곰팡이) 균사체 추출물을, 바닐린을 바닐린 알콜로 환원시키는 불필요한 탈수소효소로부터 정제하였다. 발효기 액을 산성화시킨 후, 바닐린, 이소바닐린, 및 프로토카테큐인 산을EtOAc로 추출하였다. 후속 재침전 단계는 바닐린산/프로토카테큐인 산 비율을 1:2에서 2.5:1로 향상시켰다. 생성 방향족 혼합물을 글루코즈 6-포스패이트 탈수소효소(NADP를 재순환시키기 위한) 및 아릴-알데히드 탈수소효소로 30℃ 및 pH 8.0에서 바닐린산에 대해 0.07당량의 NADP와 2당량의 ATP를 사용하여 배양하였다. 7시간후, 바닐린산을 환원한 바닐린을 92% 수율로 얻었다(도 2). 프로토카테큐인산의 환원은 더 늦어 7시간 후 33%의 수율로 프로토카테큐알데히드를 얻었다. 효소 환원물로부터 CH2Cl2로 추출하여 프로토카테큐알데히드 및 프로토카테큐인산을 제거하고 바닐린을 얻었다. 이소바닐린은 단지 오염물로서 10몰%로 잔류하였다. 발효기 액의 추출, 과량의 프로토카테큐인산을 제거하기 위한 선택적 침전, 아릴-알데히드 탈수소효소 환원, CH2Cl2추출은 바닐린산을 바닐린으로 전환하는데 66%(몰/몰)의 총수율을 나타내었다.
II. 재료 및 방법
일반
용질의 1H NMR 정량 분석을 위해 용액을 감압하에서 농축하고, 다시 D2O를 제거하여 건조시킨 다음, 랭카스터 신테시스 인코포레이티드에서 구입한 알려진 농도의 3-(트리메틸실일)프로피온-2,2,3,3-d4-산(TSP)를 함유하는 D2O에 다시 용해시켰다. 1H NMR 에서 TSP와 비교하여 각 화합물의 농도를 측정하였다. 모든 1H NMR 스펙트라는 배리안 VXR-300FT NMR 분광광도계로 측정하였다. 래이닌 장치, (17:2:1 H2O/CH3CN/CH3CO2H v/v)용리액, C18칼럼(5㎛,래이닌 Microsorb-MV, 4.6X250mm)으로HPLC분석을 하였고 250nm에서 검출하였다. 표준 커브와 각 성분의 피크면적을 비교하여 시료를 정량하였다. 단백질 함량은 브래드포드-염료 바인딩 방법(브래드포드, M.M.,Anal.Biochem.72:248(1976))을 사용하여 측정하였고, 송아지 혈청 알부민으로 제조된 표준 커브와 비교하였다. 단백질 분석 용액은 바이오 래드사로부터 구입하였다.
효소분석
카테콜-O-메틸트랜스페라제 활성 분석에 리닐래 방법을 변형하여 사용하였다(리닐래, T.Pharmacol. Toxicol. 77:414(1995)). 세포를 디티오트레이톨(0.5mM)을 함유하는 인산나트륨(10mM, pH 7.4)으로 두번 세척하고 디티오트레이톨(0.5mM)을 함유하는 인산나트륨(10mM, pH 7.4)에 재현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레스(16000psi)를 통해 둘로 나누었다. 48000g에서 20분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 세포 용해질을 디티오트레이톨(0.5mM)을 함유하는 인산나트륨(10mM, pH 7.4)에 희석하였다.
두개의 다른 용액을 준비하고 37℃에서 3분간 따로 배양하였다. 인산나트륨(125mM, pH 7.4), MgCl2(6.25mM), S-아데노실-L-메티오닌(0.75mM) 및 프로토카테큐인산(0.5mM)을 포함하는 첫번째 용액(4㎖)을 제조하였다. 희석된 용해질을 포함하는 카테콜-O-메틸트랜스페라제로 구성되는 두번째 용액(1㎖)을 제조하였다. 두 용액을 혼합하고(시간=0), 부분 표본(0.5㎖)을 1분 간격으로 채취하고 40㎕ 얼음 냉각된 4M 과염소산으로 급냉시켰다. 배크만 마이크로퓨지를 이용하여 침전된 단백질을 제거하고 생성 상청액의 성분을 HPLC로 정량하였다. 일단위의 카테콜-O-메틸트랜스페라제 활성은 37℃에서 분당 1마이크로몰의 바닐린산을 형성하는 것으로 정의된다.
트리스-염산(100mM) pH 8.0, 디티오트레이톨(20mM), NADPH(0.15mM), ATP(20mM) 및 벤조산(4mM)을 함유하는 아릴-알데히드 탈수소효소 분석용액을 30℃에서 배양하였다. 아릴-알데히드 탈수소효소를 포함하는 용액을 부가한 후, 벤조산 환원을 휴렛팩커드 8452A UV-Vis 분광광도계로 340nm에서 관찰하였다. 일단위 활성은 30℃에서 분당 1마이크로몰의 NADPH의 손실로 정의된다.
아릴-알데히드 탈수소효소의 정제
정제에 와트만 (디에틸아미노에틸)셀룰로즈(DE52) 및 Amicon Dye Matrex Red A 겔을 사용하였다. 완충액은 완충액 A, 트리스-염산(100mM) 및 L-시스테인(10mM), pH 7.6; 완충액 B, 트리스-염산(50mM), EDTA(1mM), DTT(1mM) 및 PMSF(0.4mM), pH7.6; 완충액 C, 트리스-염산(50mM), EDTA(1mM), DTT(1mM), PMSF(0.4mM) 및 KCl(400mM), pH7.6; 완충액 D, 트리스-염산(20mM), EDTA(0.4mM), DTT(0.4mM) 및 PMSF(0.15mM), pH7.5; 및 완충액 E, 트리스-염산(20mM), EDTA(0.4mM), DTT(0.4mM),PMSF(0.15mM) 및 KCl(2.5M), pH7.5를 포함한다. 모든 정제는 4℃에서 수행하였다. 단백질 용액은 한외여과로 농축하였다(아미콘의 PM-10 Diaflo 막).
뉴로스포라 크라사 SY 7A의 배양 배지를 증류, 탈이온수에서 제조하였다. 뉴로스포라 크라사 SY 7A는 ATCC 기탁번호 24740이고 ATCC에서 얻었다. 슈크로즈(20g), 구연산 나트륨 이수화물(2.5g), K2HPO4(5.0 g), NH4NO3(2.0g) ,CaCl2⊇2H2O(0.1g), MgSO4(0.1g), 비오틴(5.0㎍), 및 구연산 일수화물(5.0mg), ZnSO4⊇7H2O(5.0mg), Fe(NH4)2(SO4)2⊇6H2O(1.0mg), CuSO4⊇5H2O(0.25mg), MnSO4⊇H2O(0.05mg), H3BO30.05mg), Na2MoO4⊇2H2O(0.05mg)을 포함하는 미량원소를 함유한다. 디프코 한천을 배지에다 2%농도(w/v0로 가했다. 액체 성장 배지는 디프코 효모 추출물(2.0g/L) 및 살리실산 나트륨(1.6g/L)을 부가한 것만 고체 배지와 다르다. 고체 배지에서 뉴로스포라 크라사 SY 7A를 24℃에서 7일간 생장시켜 포자를 얻었다. 멸균수에 현탁시킨 후, 포자와 균사체 혼합물을 멸균 글래스울을 통해 여과하였다. 얻어진 포자 현탁액을 4℃에서 보관하였다. 4℃에서 2주 이하로 보관된 신선한 포자를 4L 삼각 플라스크에서 2L 액체 성장 배지에 접종하고 최종 농도가 2.5x106포자/L가 되게 하였다. KirK, T. K. Arch. Microbiol. 117:277(1978). 실온에서 60시간 배양한 후 여과하여 균사체를 얻고 -20℃에서 냉동시켰다.
아릴-알데히드 탈수소효소 정제의 각 단계의 수율 및 특정 활성은 하기 표 3에 기재하였다. 다른 탈수호효소 활성이 존재하기 때문에 원 균사체 추출물에서 아릴-알데히드 탈수소효소의 특정 활성은 측정할 수 없었다. 냉동 균사체(400g, 습윤 중량)을 900㎖ 완충액 A에 녹이고 워닝 혼합기로 분쇄하였다. 30분동안 40000g에서 원심분리하여 부스러기를 제거하고 상청액을 200㎖로 농축하였다. 완충액 B에 대한 투석(3x) 후, 균사체 추출물을 완충액 B로 평형상태가 된 DEAE 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 500㎖의 완충액 B로 세척하고 선형 용리액(1.5L+1.5L 완충액 B+완충액 C)로 용리하였다. 완충액 D에 대한 투석(3x) 후, 단백질을 완충액 D로 평형상태가 된Red A 칼럼(2.5x8cm)에 부하하였다. 칼럼을 200㎖의 완충액 D로 세척하고 선형 용리액(150㎖+150㎖ 완충액 D+완충액 E)로 용리하였다. 분획을 농축하고, 액체 질소로 긴급 냉동시켜 -80℃에서 보관하였다.
표 3
뉴로스포라 크라사 SY 7A로부터 아릴-알데히드 탈수소효소의 정제
a 1단위=1마이크로몰 NADH 산화/분
b 마이크로몰/분/mg
바닐린산 합성
배양에는 2.0L 용량의 바이오캐스트 MD B-Braun 발효기를 사용하였고, 발효기는 데이터 획득 및 자동 모니터링을 위한 B-Braun MFCS 소프트웨어를 갖춘 컴팩 컴퓨터 및 DCU 시스템과 연결하였다. 온도, pH, 및 글루코즈 공급은 PID 조절기로 조절하였다. 온도는 37℃로 유지하였고, pH는 진한 NH4OH 또는 2N H2SO4을 사용하여 7.0으로 유지하였다. 용존 산소(D.O.)는 브라운 폴라로그래픽 프로브를 이용하여 측정하였다. D.O는 전체 발효 공정에 걸쳐 20% 공기 포화로 유지하였다. 필요한 경우 기포제거제(시그마 204)를 수작업으로 부가하였다.
모든 배지들은 증류되고, 이온이 제거된 물에서 준비하였다. LB 배지(1L)는박토 트립톤(Bacto tryptone)(10 g), 박토 이스트(Bacto yeast)(5 g), 및 염화나트륨(NaCl)(10 g)을 포함하였다. 발효 배지(IL)는 K2HPO4(7.5 g), 암모늄 철(Ⅲ)구연산 염(10 g), 구연산 일수화물(2.1 g) 및 황산(H2SO4)(1.2mL)를 포함하였다. 배양 배지는 멸균하기 전에 진한 NH4OH를 첨가하여 pH 7로 조정하였다. 다음의 보충물이 발효 시작 바로 전에 첨가되었다: 디-글루코즈(20g), MgSO4(0.24 g), 페닐알라닌(0.7g), 티로신(0.7g) 및 트립토판(0.35g)을 포함하는 방향족 아미노산, p-아미노벤조산(0.01g), 2,3-디히드록시벤조산(0.01g) 및 p-히드록시벤조산(0.01g), 및 (NH4)6(Mo7O24)⊇4H2O(0.0037g), ZnSO4⊇7H2O(0.0029g), H3BO5(0.0247g), CuSO4⊇5H2O(0.0025g) 및 MnCl2⊇4H2O(0.0158g)을 포함하는 미량의 미네랄. 방향족 비타민 및 미량의 미네랄이 배지에 첨가되기 전에 022㎛ 막을 통과하면서 살균되는 동안 D-글루코즈, MgSO4, 및 방향족 산은 압열 멸균되었다. 최종 농도에 적절하게 이하의 항생 물질이 첨가되었다: 클로르암페니콜(Cm), 20㎍/mL; 암피실린(Ap), 50㎍/mL. 고체 배지는 1.5%(w/v) 디프코 한천을 배지 용액에 첨가하여 준비하였다.
접종 세균이 적절한 항생 물질을 포함하는 100mL LB 배지(2g 글루코즈로 농축된)에서 12시간, 37℃에서 250rpm으로 교반하면서 성장되고 난 후 발효기로 옮겨졌다. 발효 배지 내부의 초기 글루코즈 농도는 20g/L였다. L-메티오닌은, 사용되는 경우, 발효기 초기 작동 후에 12시간에서 시작하는 시간 간격(6시간)으로 상기 아미노산을 0.4 g 포함하는 살균 필터 용액을 첨가하여 이루어진다. 발효기 작동 시에 매 48 시간 동안 20% 공기 포화로 용존 산소(D.O.) 레벨을 유지하는데는 세 가지 다른 방법이 사용되었다. 상기 용존 산소 농도는 처음에는 임펠러(impeller) 속도를 증가시켜서 유지되었다. 임펠러 속도를 50 rpm에서 미리 설정된 최대 값 900 rpm으로 증가시키는 데에는 대략 8 시간이 소요되었다. 질량 흐름 제어기는 그 다음에 기체흐름속도를 대략 2시간 이상에 걸쳐서 0.06L/L/min에서 미리 설정된 최대값 1.0L/L/min로 증가시켜 일정한 임펠러 속도로 D.O. 레벨을 20% 포화로 유지하였다. 일정한 임펠러 속도 및 일정한 공기 흐름 속도에서, D.O.레벨은 산소 감지-제어 글루코즈 공급에 의해서 나머지 발효에 대해서 20% 포화로 유지되었다. 이 단계의 초기에, 용존 산소 레벨은 배지에 잔류하는 초기 글루코즈로 인해서 20% 아래로 떨어진다. 이것은 글루코즈(60% w/v)공급이 시작되기 전에 약 1 시간 동안 지속되었다. PID 제어 파라미터는 파생 제어(rp)에 대하여 0.0(off), 전체 제어(ri)에 대하여 999.9s(최소 제어 작용) 및 비례 대역(Xp)에 대하여 950.0%로 정하였다.
발효 액체의 샘플(8mL)은 6시간 간격으로 취하였다. 그 일부(1mL)는 600nm(OD600)에서 흡수율을 측정하여 세포 밀도를 정하는데 사용되었다. 건조 세포질량(g/L)은 0.43g/OD600L의 계수를 사용하여 얻어내었다. 나머지 5mL의 발효 거품 샘플은 베크만 마이크로퓨지(Beckman microfuge)를 사용하여 원심 분리하여 HPLC로 분석하였다. 발효 액체의 분리액(25mL)를 취하여 카테콜-O-메틸트랜스페라제 활성의 분석시험을 위하여 12 시간 및 36시간에서 원심분리하였다. 안정된 카테콜-O-메틸트랜스페라제의 활성이 발효 중에 관찰되었고, 기록된 카테콜-O-메틸트랜스페라제 활성(표1)은 12 시간 및 36시간의 특정 활성의 평균이다. 48시간 후, 세포는 10분 동안에 16000g의 원심 분리에 의해서 제거되고 상청액은 4℃에서 보관하였다.
바닐린 산의 환원
발효 용액(100 mL)은 진한 염산을 사용하여 pH 3.1로 산성화되고 그 결과 석출된 단백질은 10분 동안 16000 g의 원심분리에 의해서 제거된다. EtOAc(3x)로 상청액을 추출한 후, 용매는 환원 압력하에서 제거된다. 생성된 고체는 NaOH(10N)를 첨가하여 PH 7.5로 조정한 12mL의 물에 용해되었다. 연이어 진한 황산을 떨어뜨려 용액을 pH 1.8로 조정한 결과, 걸러져서 건조되는 고체 석출물이 남게되었다. 수집된 고체 석출물은 Tris-HCl(200mM), pH 8.0, MgCl2(100mM), DTT(10mM), ATP(60mM),NADP+(2mM), 글루코즈 6-포스페이트(60mM), 글루코즈 6-포스페이트 탈수소효소 2,000 단위 및 부분적으로 정화된 아릴-알데히드 탈수소효소 200 단위를 포함하는 용액에 용해되었다. 환원은 30℃에서 진행하였고 HPLC로 모니터되었다. 7 시간 반응 후에, 초기 바닐린산의 92%(mol/mol) 및 프로토카테추산의 34%가 환원되었다. 반응 혼합물은 100 mL CH2Cl2(3x)로 추출되었다. 조합된 유기 추출물은 같은 부피의 물로 한번 세척되었다. 농축하여 바닐린 (0.30 g) 및 이소 바닐린(0.03 g)으로 구성되는 분말을 얻었다.
실시예 2
상업적 응용
대량의 바닐린 합성에 있어서, 바닐린 산을 환원시키는 완전한 미생물(세포가 없는 효소 체계에 대항하여)이 바람직하다. 그러나, 사용되는 계획에 관계없이, 개선된 프로토카테큐인산 메틸화는 필수적임을 이해하여야 한다. 증가된 카테콜-O-메틸트랜스페라제 활성을 갖는 개선된 프로토카테큐인산 메틸화 및 L-메티오닌 보충으로 관찰되는 메틸화의 향상 부족은 S-아데노실메티오닌을 공기질로 사용 및/또는 피드 백 억제 (Coward, J. et al., Biochemistry 12;2291(1973))가 생체조건에서의 메틸트랜스페라제 활성성을 제한할 수 도 있다는 것을 암시한다. 널리 알려진 (Gross, G.G. et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 32;173(1968); Gross, G.G. et al., Eur. J. Biochem. 8:413(1969);Gross, G.G., Eur.J.Biochem. 31:585(1972); Zenk, M.H.et al.,Recent Adv.Phytochem. 4:87(1972)) 카테콜-O-메틸트랜스페라제의 다른 이소자임을 사용하는 프로토카테큐인산 메타-산소 메틸화에 대한 입체선택성을 향상시키는 것도 또한 유리하다. 또한, 배양된 상청액으로 향하는 프로카테큐인산이 메틸화를 위한 세포질로 운송될 수 있도록 바닐레이트-합성 미생물을 프로토카테큐인산 흡수 시스템과 함께 설계하는 것도 바람직하다.
글루코스와 같은 탄소원으로부터 바닐린을 미생물 촉매로 합성하는 것은 기타 다른 미생물 촉매 합성에 비해서 수 많은 이점을 가진다. 페닐프로파노이드 생물학적 합성 중에 형성되는, 코니페롤(Coniferol)은 바닐라 플라포닐라에 있는 글루코실트랜스페라제에 의하여 코니페린(coniferin)으로 변환된다( Ranadive, A.S., In Spices, Herbs, and Edible Fungi, Charalambous,G.,Ed.,Elsevier;Armsterdam,p.517(1994)). 그 다음, 코니페린은 β- 글루코시다제, (Ranadive, A,S,, In Spices, Herbs, and Edible Fungi, Charalambous, G., Ed.,Elsevier;Amsterdam,p. 517 (1994))에 의하여 최종적으로 가수분해된다. 본 발명에서처럼 3-디히드로쉬키믹, 프로카테큐 및 바닐린 산을 경유하여 바닐린을 합성하는 것은 페닐프로파노이드 생물합성 및 글루코실레이션/디글루코실레이션(glucosylation/deglucosylation) 반응을 회피한다. 이것은 바닐린을 합성하는 데 있어서 필요한 많은 수의 효소를 크게 줄여준다.
글루코스와 같은 탄소원으로부터 바닐린을 생물학적 촉매에 의해 합성하는 것은 합성 바닐린 제조, (Esposito, L. et al., Kirk-Othermer Encyclopedia of Chemical Technology, Fourth Ed., Kroschwitz, J.I;Howe-Grant, M., Ed.,;Wiley;New York, Vol. 24 : 812(1997))에 비해서 또한 이점을 가지고 있다. 페놀 및 과이아콜은 독성이 있고 발암성 벤젠, (Lewis, R. J. Sr., Hazardous Chemicals De나 Reference, Third Edition, Van Nostrand Reinhold; New York(1993)) 으로부터 나온다. 본 발명에 따른 방법에 의한 무독성 3-디히드로쉬키믹, 포로토카테큐 및 바닐린 산은 해가 없는 글루코즈로부터 나온다. 페놀을 카테콜로 산화하는 데 사용되는 부식성의 H2O2는 특별한 취급상의 주의(Cambell, C.J.et al., Sci.Am. 27893);78(1998))가 필요한 반면 미생물 촉매에 의해 합성된 바닐린은 글루코즈의 산소 원자로부터 산소가 유도된다. 디메틸 설페이트, 발암물질(Campell. C.J. et al., Sci. Am. 278(3):78 (1998))은 카테콜을 메틸화시키는데오랫동안 사용되어 왔다. 프로토카테큐인산 메틸화는 세포사이에서 발생되고 소비되는 S-아데노실메티오닌을 사용한다. 마지막으로, 합성 바닐린 제조는 재생할 수 없는 석유의 사용을 기초로 하는 반면 글루코스는 풍부하고, 재생 가능한 녹말에서 나온다. 이러한 공급 재료의 사용에서의 차이점은 세계적인 석유 생산량이 감소되고 있으므로 주어진 돌출되는 맹렬한 국제적인 경쟁 측면에서 매우 중요하다(Campbell, C.J. et al., Sci.Am. 278(3);78(1998)).

Claims (29)

  1. 탄소원로부터 바닐린 및 그 유도체를 제조하는 방법에 있어서, a)탄소원을 재조합 미생물로 바닐린산으로 전환하는 단계; 및
    b)바닐린산을 바닐린으로 환원하는 단계를 포함하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 3-디히드로쉬키메이트 탈수소효소 및 카테콜-O-메틸트랜스페라제에 대해 인코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    3-디히드로쉬키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자는 aroZ 유전자인 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    카테콜-O-메틸트랜스페라제를 인코딩하는 유전자는 PtacCOMT 유전자인 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 PtacCOMT 유전자는 재조합 미생물에서 플라스미드 위에 위치하는 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 플라스미드는 pKL5.97A 인 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 ATCC 기탁 번호 98859에 의해 식별되는 E, coli KL7/pKL5.97A 인 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 피드백 억제에 둔감한 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 합성효소의 이소자임을 인코딩하기 위한 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 3-디옥시-디-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 합성효소 이소자임을 인코딩하는 유전자는 aroFFBR유전자인 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 aroFFBR유전자는 재조합 미생물에서 플라스미드 위에 위치하는 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 바닐린산은 아릴-알데히드 탈수소효소에 의해 바닐린으로 환원되는 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 아릴-알데히드 탈수소효소는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로 정제되는 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 탄소원은 글루코즈인 것을 특징으로 하는 바닐린 및 그 유도체의 제조 방법.
  14. 탄소원으로부터 바닐린을 합성하는 방법에 있어서,
    a) 3-데옥시-D-아라비노-헵툴소닉 산 7-포스페이트 합성효소, 3-디히드로퀴네이트 합성효소, 3-디히드로퀴네이트 탈수효소, 3-디히드로쉬키메이트 탈수효소 및 카테콜-O-메틸트랜스페라제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 E. coli로 탄소원을 바닐린산으로 전환하는 단계; 및
    b) 아릴-알데히드 탈수소효소로 바닐린산을 바닐린으로 환원하는 단계를 포함하는 바닐린 합성 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 재조합 E. coli 는 돌연변이된 aroE 좌위, serA 죄위 및 플라스미드 pKL5.97A에 부착되는 aroB/aroZ 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 바닐린 합성 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 아릴-알데히드 탈수소효소는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로 정제되는 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 바닐린 합성 방법.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 ATCC 기탁 번호 98859에 의해 식별되는 E, coliKL7/pKL5.97A 인 것을 특징으로 하는 바닐린 합성 방법.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 탄소원은 글루코즈인 것을 특징으로 하는 바닐린 합성 방법.
  19. a) 탄소원을 포함하는 생물학적 변환 혼합물을 재조합 미생물과 접촉하여 재조합 미생물이 탄소원을 바닐린산으로 변환시키는 단계, ; 및
    b) 바닐린산을 아릴-알데히드 탈수소효소와 접촉시켜 상기 아릴-알데히드 탈수소효소가 바닐린산을 바닐린으로 환원시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 돌연변이된 aroE 좌위, serA 좌위 및 플라스미드 pKL5.97A에 부착되는 aroB/aroZ 카세트를 포함하는 E. coli인 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 아릴-알데히드 탈수소효소는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로 정제되는 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  22. 제 19 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 ATCC 기탁 번호 98859에 의해 식별되는 E, coli KL7/pKL5.97A 인 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  23. 제 19 항에 있어서,
    상기 탄소원은 글루코즈인 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  24. 제 19 항에 있어서,
    상기 생물학적 변환 혼합물은 메티오닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  25. 제 19 항에 있어서,
    상기 생물학적 변환 혼합물은 약 30℃에서 약 37℃의 온도 및 약 6.5에서 약 7.5의 pH에서 유지되는 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  26. 제 19 항에 있어서,
    상기 생물학적 변환 혼합물은 약 5%에서 약 35% 공기 포화 농도의 용존 산소를 가지는 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  27. 제 19 항에 있어서,
    상기 단계들은 페드-배치(fed-batch) 발효기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 바닐린 제조 공정.
  28. ATCC 기탁 번호 98859에 의해 식별되는 E, coli KL7/pKL5.97A.
  29. 플라스미드 pKL5.97A.
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