JPWO2007129465A1 - 補酵素合成強化によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法 - Google Patents

Abstract

微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、若しくは置換させる、または、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することにより、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を向上させた微生物を用いてヒドロキシカルボン酸を生産する。

Description

本発明は、グリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸を生産する微生物と、微生物を用いたグリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸の生産方法に関するものである。

ヒドロキシカルボン酸類はポリマー原料や医薬中間体として有用で、その効率的な生産方法が求められている。
その一例としてグリコール酸（α―ヒドロキシ酢酸）が挙げられる。グリコール酸は、洗浄剤や化粧品原料として利用されてきたが、近年、ガスバリア性ポリマーや医療用ポリマーとして有用なポリグリコール酸の原料として注目されている。ガスバリア性材料として注目されている理由はポリグリコール酸層が高い酸素ガスバリア性を有しており、酸素の存在下で変質しやすい食品や炭酸飲料を包装するための材料としての性能を備えているからである。

現行市販されている化学合成品のグリコール酸は少なからず夾雑物を含んでおり、ポリマー原料としては純度的に問題がある。なぜならこれらの夾雑物はグリコール酸の脱水縮合反応を阻害するのみならず、夾雑物の一つであるメトキシ酢酸が発癌性の疑いのある化合物であり、食品や飲料の包材中に含まれることが望ましくないからである。無論、精製によって夾雑物を除くことは技術的には可能であるが、実際にそのような精製品は価格が高くなり、安価な包材原料としては現実的でない。

化学合成品のグリコール酸に見られる上記の問題点を回避するため、エチレングリコールを原料としたバイオ法によるグリコール酸製造の試みが行われている。
特許文献１及び特許文献２において、エチレングリコール含有培地に、ピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属に属する酵母、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する菌株、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌株、またはエシェリヒア・コリＢ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ）株を培養し、培養液中からグリコール酸を分離・採取することを特徴とする微生物によるグリコール酸の生産方法が開示されている。
特許文献１及び特許文献２の実施例に記載されているグリコール酸生産方法の中でグリコール酸蓄積濃度が最も高いものは、ピシア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）を用いた方法であり、３０時間の反応で３５．３ｇ／Ｌのグリコール酸が得られている。ピシア・ナガニシイを用いたグリコール酸生産については更に、反応条件の改善がなされ、１２０時間の反応で１０５ｇ／Ｌのグリコール酸が得られることが非特許文献１で報告されている。

特許文献３においてはラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子とラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することでこれらの酵素活性が付与又は強化された微生物を用いることにより、エチレングリコールをはじめとする末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールを原料として、グリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸を生産することが可能であること、さらには微生物が有しているグリコール酸オキシダーゼをコードする遺伝子を破壊し該酵素活性を不活性化させることによりグリコール酸の生産性が向上することが開示されている。

上記した従来の方法によるグリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸の生産反応においては反応に供する菌体量が多いがために、それに伴う製造コストの上昇や菌体に由来する不純物の夾雑、さらにはヒドロキシカルボン酸類の製造後に菌体を廃棄するのに多大な労力とコストがかかるという問題点があげられる。
微生物におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生合成経路は、アスパラギン酸からキノリン酸を経由して生合成される経路（ｄｅ ｎｏｖｏ経路）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の代謝により生じるニコチンアミドをリサイクルする経路（リサイクル経路）とが存在し、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、フォトラブドゥス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属をはじめとする腸内細菌科におけるこれらの生合成経路は、ｎａｄＲ（文献によってはｎａｄＩと呼ばれることもある）遺伝子がコードするタンパク質（以降ＮａｄＲと記す）により制御されていることが知られている。すなわち、ＮａｄＲはアスパラギン酸からのｄｅ ｎｏｖｏ経路上のＬ−アスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子とキノリン酸シンターゼ遺伝子、およびリサイクル経路上のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（以下ｐｎｃＢという）の発現を抑制することが知られている。

一方、ＮａｄＲは多機能タンパク質であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生合成にとって重要な以下の機能をも有している。すなわち、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの前駆体となるニコチンアミドモノヌクレオチドの輸送、さらにはＡＴＰとニコチン酸リボヌクレオチドからニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの前駆体であるデアミドニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生成する反応を触媒する酵素、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとしての機能も有していることが明らかとなっている。
遺伝子ｎａｄＲを破壊した微生物は、非特許文献２において既に報告されているが、こうした微生物によるヒドロキシカルボン酸の生産は報告されていない。

非特許文献３においては、エシェリヒア・コリにｐｎｃＢの発現ベクターを導入することでニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの含量が向上することが報告されている。
特開平１０−１７４５９３号公報 特開平１０−１７４５９４号公報 国際公開第２００５／１０６００５号パンフレット Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６５（１０），ｐｐ．２２６５−２２７０，（２００１） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１８７（８）， ｐｐ．２７７４−２７８４，（２００５） Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２３８−２４７，（２００２）

本発明が解決しようとする課題は、ヒドロキシカルボン酸類を少ない菌体量で効率よく生産することができる、微生物によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法、および該生産方法に適した微生物を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する方法において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物を用いることによりヒドロキシカルボン酸類を効率よく生産できることを見出した。
即ち、本発明は以下の〔１〕から〔１９〕に記載のとおりである。

〔１〕 微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を製造する方法において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物を用いることを特徴とするヒドロキシカルボン酸の生産方法。
〔２〕 微生物が、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物であることを特徴とする〔１〕の生産方法。
（１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
（２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。

〔３〕 微生物が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化した微生物であることを特徴とする〔１〕記載の生産方法。
〔４〕 微生物が、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを導入することにより酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化した微生物であることを特徴とする〔３〕の生産方法。
〔５〕 微生物が、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴とする〔１〕記載の生産方法。
〔６〕 微生物が、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴とする〔３〕記載の生産方法。

〔７〕 微生物が、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする〔１〕、〔３〕、〔５〕又は〔６〕記載の生産方法。
〔８〕 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールがエチレングリコールであり、ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸であることを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の生産方法。
〔９〕 ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化し、かつ、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物。
（１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
（２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。

〔１０〕 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化したことを特徴とする〔９〕記載の微生物。
〔１１〕 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化し、かつ、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物。
（１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
（２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。
〔１２〕 グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減したことを特徴とする〔９〕または〔１０〕に記載の微生物。
〔１３〕 グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減したことを特徴とする〔１１〕に記載の微生物。
〔１４〕 微生物がエシェリヒア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属のいずれかである〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の生産方法。
〔１５〕 微生物がエシェリヒア・コリである〔１４〕に記載の生産方法。
〔１６〕 微生物がエシェリヒア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属のいずれかである〔９〕、〔１０〕、〔１２〕のいずれかに記載の微生物。
〔１７〕 微生物がエシェリヒア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属のいずれかである〔１１〕または〔１３〕に記載の微生物。
〔１８〕 微生物がエシェリヒア・コリである〔１６〕に記載の微生物。
〔１９〕 微生物がエシェリヒア・コリである〔１７〕に記載の微生物。

本発明によりヒドロキシカルボン酸類を少ない菌体量で効率よく生産することができる。また、本発明によればヒドロキシカルボン酸類の生産に適した微生物を提供することができる。

上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。

参考例３における細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）の経時変化を示したグラフである。 図中の□は、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を示す。 図中の○は、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を示す。 実施例９におけるグリコール酸蓄積量の経時変化を示したグラフである。 図中の○は３０℃での反応結果を示す。 図中の□は３５℃での反応結果を示す。 図中の△は３７℃での反応結果を示す。 図中の×は４０℃での反応結果を示す。 実施例１０におけるグリコール酸蓄積量の経時変化を示したグラフである。 図中○はｐH７．７での反応結果を示す。 図中△はｐH７．２での反応結果を示す。 図中□はｐH６．５での反応結果を示す。 図中×はｐH６．０での反応結果を示す。 図中◇はｐH４．３での反応結果を示す。

以下に本発明を詳しく説明する。

本実施形態は、ヒドロキシカルボン酸の生産方法である。この方法は、微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を製造する方法において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物を用いるものである。

微生物とは、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する能力を本来有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する能力を有し得る微生物であればいずれの微生物であってよい。好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、フォトラブドゥス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属に属する微生物などが例示され、より好ましくはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が例示される。

また、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとは、炭素鎖の末端に水酸基を有し、かつ分子内に２つ以上の水酸基を有する脂肪族化合物であればその構造に特に制限はないが、そのような化合物としてエチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセロール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２，４−ブタントリオールなどが例示できる。

また、ヒドロキシカルボン酸とは、上記した末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール分子内の水酸基を有する末端炭素の一つが酸化されてカルボン酸になっているものである。そのような化合物としてグリコール酸、ヒドロキシエトキシ酢酸、グリセリン酸、３−ヒドロキシプロパン酸、２−ヒドロキシブタン酸、３−ヒドロキシブタン酸、４−ヒドロキシブタン酸、２，４−ジヒドロキシブタン酸などが例示できる。

本実施形態では、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとして、エチレングリコールを好適に用いることができる。また、ヒドロキシカルボン酸として、グリコール酸を好適に用いることができる。

本実施形態に係る微生物は、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化される。
（１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
（２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。

ここで、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとは、酸化型および還元型の明記がない限りそのどちらをも指す。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能が強化されたとは、微生物内の酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤと略することがある）および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤＨと略することがある）の含量の合計が、微生物の野生株（又は組換え前の微生物）に対して有意に向上している状態を指し、好ましくはＮＡＤ、ＮＡＤＨの合計含量が、強化前の微生物の１．２倍乃至１０倍である。

また、ｎａｄＲ遺伝子とは、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株を例とすると、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）中、４６２５３１７番目の塩基から４６２６５７０番目の塩基においてｎａｄＲ遺伝子がコードされている。またサルモネラ・ティフィムリウムのｎａｄＲ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ８５１８１により明らかとされている。上記微生物以外にもシゲラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属をはじめとする腸内細菌科においてｎａｄＲ遺伝子が存在していることが示されている（Ｇｅｒａｓｉｍｏｖａ，ＡＶ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ．１００７−１０１９（２００５））。

ｎａｄＲ遺伝子について欠失若しくは変異させ、又は置換させた微生物は、当業者によく知られている通常の方法で得ることができる。ｎａｄＲ遺伝子について欠失若しくは変異させ、又は置換させた微生物の一例としてエシェリヒア・コリＭＴ−１１０３２株が例示できる。

ヒドロキシカルボン酸の生産方法においては、エシェリヒア・コリＭＴ−１１０３２株を用いることが可能である。エシェリヒア・コリＭＴ−１１０３２株は、ｎａｄＲ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されており、かつ、後述するグリコール酸オキシダーゼをコードする遺伝子であるｇｌｃＤＥＦがテトラサイクリン耐性遺伝子に置換されることによりグリコール酸オキシダーゼ活性が不活性化している。本菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７３の寄託番号で、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、特許手続き上の微生物の寄託等の国際承認に関するブタペスト条約に基づいて寄託されている。なお、本寄託は、平成１８年（２００６年）２月１４日に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−２０７９７より移管されたものである。

ここで、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（以下、「Ｉ．Ｕ．Ｂ．」という）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．４．２．１１に分類され、ニコチン酸と５−ホスホリボシル−１α−二リン酸から、ニコチン酸モノヌクレオチドを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。

ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子（以下、ｐｎｃＢと略することがある）を組み込んだプラスミドを導入した微生物を用いて、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産することができる。微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）等に記載されている。

また、本実施形態に係る微生物は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化される。ここで、ＮＡＤ再生能を強化するとは、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールの酸化反応によりヒドロキシカルボン酸を生産する際に生じたＮＡＤＨをＮＡＤに変換する反応を触媒する酵素の活性が、強化前に比べ有意に向上している状態を意味する。そのような酵素としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが例示される。ＮＡＤ再生能を強化する場合、その後の精製等の工程において負荷となるような化合物が増加しないことが好ましい。ＮＡＤＨをＮＡＤに変換する反応を触媒する酵素として、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが好ましい。ＮＡＤＨをＮＡＤに変換する反応を触媒する酵素がエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼである場合を例とすると、その活性が野生株（又は組換え前の微生物）に比べ２倍以上向上していることが好ましい。

こうした酵素活性が向上した微生物は、例えば、該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に導入する方法や、ゲノム内において該酵素をコードする遺伝子のプロモーターに変異を導入するなどの方法を用いて作出することができる。野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に該遺伝子を導入する方法としては、該遺伝子をプラスミドの形態で微生物に導入することが例示できる。微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの文献に記載されている。

また、本実施形態に係る微生物は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを導入されることにより酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化される。ここで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．６．５．３、１．６．９９．３、または１．６．９９．５に分類され、ユビキノン、ジメチルメナキノン、メナキノン等のキノン類を電子受容体としてＮＡＤＨからＮＡＤを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。好ましくはＩ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．６．９９．３に分類されるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼであり、エシェリヒア・コリを例とするとＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｖ００３０６によって報告されているｎｄｈ遺伝子にコードされているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが例示される。

本実施形態においては、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを導入した微生物を用いて、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産することができる。必要となるプラスミドの構築や微生物への導入は当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。

また、本実施形態に係る微生物は、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性が強化される。ここで、ラクトアルデヒドレダクターゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．７７に分類され、１．２−プロパンジオールから、補酵素であるＮＡＤの存在下でラクトアルデヒドを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。

また、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２２に分類され、ラクトアルデヒドから、補酵素であるＮＡＤの存在下で乳酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指し、且つＩ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２１に分類され、グリコールアルデヒドから、補酵素であるＮＡＤの存在下でグリコール酸を生成する反応を触媒する酵素グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼの総称も併せて指すものである。なぜならば大腸菌を用いた先行文献で、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは同一の酵素であることが報告されているからである（Ｃａｂａｌｌｅｒｏ， Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５８，ｐｐ．７７８８−７７９２（１９８３））。

また、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化したとは、大腸菌を例にすると、これらの酵素の少なくとも１つの酵素活性が、野生株（又は組換え前の微生物）の２０倍以上であることが好ましく、より好ましくは１００倍以上である。こうした酵素活性が向上した微生物は、例えば、該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に導入する方法や、ゲノム内において該酵素をコードする遺伝子のプロモーターに変異を導入するなどの方法を用いて作出することができる。野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に該遺伝子を導入する方法としては、該遺伝子をプラスミドの形態で微生物に導入することが例示できる。微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの文献に記載されている。

たとえば、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が向上したエシェリヒア・コリは、以下のように作製することができる。

エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３１０５９）。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ６４５４１）。

ｆｕｃＯを取得するためにエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することでｆｕｃＯフラグメントを得る。

また、ａｌｄＡを取得するためにエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することでａｌｄＡフラグメントを得る。

さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することでＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得る。

上記の３つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを結合した後、エシェリヒア・コリに形質転換し、ＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得る。得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた菌体からプラスミドを回収する。本プラスミドを任意の宿主エシェリヒア・コリに導入することでラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が向上したエシェリヒア・コリを作製できる。

本実施形態に係る微生物は、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減される。
ここで、グリコール酸オキシダーゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．３．１５に分類され、グリコール酸からグリオキシル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。

グリコール酸オキシダーゼ活性の不活性化とは、その酵素活性が完全に消失することを意味する。また、グリコール酸オキシダーゼ活性の低減とは、その酵素活性の一部が消失することを意味し、野生株（又は組換え前の微生物）が有する微生物本来のグリコール酸オキシダーゼ活性に対して、２分の１以下であることが好ましく、より好ましくは１０分の１以下である。グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化、或いは低減するには、そのタンパク質をコードする遺伝子（以降ｇｌｃＤＥＦ遺伝子と略することがある）に変異を導入するか、欠失させる、あるいはそのタンパク質を特異的に不活性化する薬剤を添加する、紫外線を照射する、などの方法がある。遺伝子への変異導入や欠失といった遺伝子操作については、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。具体的には、エシェリヒア・コリＭＴ−１１０３２株が、ｇｌｃＤＥＦ遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子に置換することで、そのグリコール酸オキシダーゼ活性が不活性化した微生物として例示できる。

本実施形態において、ある標的酵素をコードする遺伝子を微生物に導入するにあたっての「プラスミドの形態で」とは、該遺伝子をベクターに連結し組換えプラスミドを作成し、これを形質転換等の方法で該微生物に導入する事を意味する。

また、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターと目的遺伝子を機能的に連結した際には、プラスミドが有するレプリコンの性質により、微生物細胞当たりのコピー数が一般的に少ないといわれるプラスミドを利用することでも本発明の目的を達し得る。そのようなレプリコンを有するプラスミドとしてｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０６４０３）などが例示できる。

本実施形態の生産方法を実施するに際しては、通常、培地を用いて微生物を培養して増殖させて必要量の微生物菌体を得る。

培養に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオン、その他が必要に応じて適宜使用される。有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。

培養に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
また、培地組成は、ポリペプトン ０．５ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下、Ｆｅ_２ＳＯ_４０．０２ｇ／Ｌ以上０．３ｇ／Ｌ以下、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、ＫＨ_２ＰＯ_４０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４０．３ｇ／Ｌ以上１５ｇ／以下（溶媒は水）とすると好ましい。

本実施形態に係る微生物の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、ｐＨと温度を適切に制御しながら培養する。好気条件であっても、嫌気条件であってもよいが、好ましくは、好気条件とする。通気量は、培地１Lあたり０．２Ｌ／ｍｉｎ以上３Ｌ／ｍｉｎ以下とすると好ましく、０．５Ｌ／ｍｉｎ以上２Ｌ／ｍｉｎ以下とするとより好ましい。また、攪拌速度は、２００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下とすると好ましく、５００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍ以下とするとより好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることができる。また、上記の通気、攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることでも培養が可能である。
ｐＨは５以上８以下とすることが好ましく、ｐＨ７．０以上７．４以下とするとより好ましく、ｐＨ７．２とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることができる。
また、温度は、２５℃以上４０℃以下とすることが好ましく、３３℃以上３７℃以下とするとより好ましく、３５℃とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることができる。
培養に必要な時間は１２時間以上５０時間以下とする。これにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることができる。

本実施形態の生産方法に使用される溶媒としては、リン酸カリウム緩衝液などの緩衝液や、前述の微生物の培養に用いた培地、及び純水を例示することができる。また、原料の脂肪族多価アルコールと溶媒との混合液に、先に培養により得られた微生物菌体を接触させて反応を行うことができる。微生物菌体は、培養が終わった培養液そのものを使用する方法や、培養液から菌体のみを回収して使用する方法が例示できる。

本実施形態の生産方法における反応に際して、反応条件は特別の制限はなく、ｐＨと温度を適切に制御しながら反応する。
例えば、ｐＨは６以上９以下とすると好ましく、ｐＨ７．０以上８．０以下とするとより好ましく、ｐＨ７．２とすると最も好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。
また、温度は、２０℃以上４５℃以下の範囲内が好ましく、３０℃以上４０℃以下とすると特に好ましく、３５℃が最も好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。
また、反応は、好ましくは、好気条件とする。通気量は、反応液１Ｌあたり０．１Ｌ／ｍｉｎ以上２．０Ｌ／ｍｉｎ以下とすると好ましく、０．２Ｌ／ｍｉｎ以上１．０Ｌ／ｍｉｎ以下とするとより好ましい。また、攪拌速度は、２００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下とすると好ましく、４００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍ以下とするとより好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。また、上記の通気、攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることでも反応が可能である。
また、反応時間は１２時間以上９６時間以下とすることにより、収率８０％以上でヒドロキシカルボン酸を得ることができる。

以上のようにして得られた反応液中に蓄積した生産物であるヒドロキシカルボン酸を回収する方法としては、特に制限はないが、例えば反応液から菌体を遠心分離などで除去した後、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離方法で分離する方法が採用できる。

（製造例１）エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｎａｄＲ欠失株の作製
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６において公知であり、該塩基配列において４６２５３１７番目の塩基から４６２６５７０番目の塩基にｎａｄＲ遺伝子がコードされている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡのｎａｄＲ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、配列番号１（ＡＧＧＡＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＧＧ）及び配列番号２（ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＡＴＡＴＣＴＣＡＴＴＡＴＡＡＧＴＣＧＴＣＧ）並びに配列番号３（ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧ）及び配列番号４（ＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＣＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化することにより、それぞれ約８５０ｂｐ、９７０ｂｐのフラグメントを得た。

このＤＮＡフラグメントを、温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｅｎｅ，２４１，１８５−１９１（２０００））をＮｄｅＩ、ＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子とリガーゼを用いて連結した。

こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で一晩培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、野生株ＭＧ１６５５においてはｎａｄＲ遺伝子を含むｎａｄＲ遺伝子近傍領域の約３．３ｋｂｐ断片を増幅させ、増幅した断片について、ｎａｄＲ遺伝子にはその認識配列が存在せず、カナマイシン耐性遺伝子にはその認識配列が存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理することで、ｎａｄＲ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されている株を選抜し、得られた株をＭＧ１６５５ｎａｄＲ遺伝子欠失株（以下△ｎａｄＲ株と略することがある）と命名した。

なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

（製造例２）エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｇｌｃＤＥＦ欠失株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼの遺伝子（以下、ｇｌｃＤＥＦと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｌ４３４９０）。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡのｇｌｃＤＥＦ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、配列番号５（ＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧ）及び配列番号６（ＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＴＧＧ）並びに配列番号７（ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧ）及び配列番号８（ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣ）のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化することにより、それぞれ約６７０ｂｐ、７９０ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを、温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｅｎｅ，２４１，１８５−１９１（２０００））をＫｐｎＩ、ＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。

得られたコロニーを、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＸｂａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理を行った。トランスポゾンＴｎ１０（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１８３０）をテンプレートとして、配列番号９（ＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＧＴＴＡＣＣＧ）と配列番号１０（ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＧ）のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行いテトラサイクリン耐性遺伝子を得、このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ処理し、先の平滑末端処理したプラスミドと連結した。

得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとテトラサイクリン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をテトラサイクリン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにテトラサイクリン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをテトラサイクリン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で一晩培養し、更にテトラサイクリン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをテトラサイクリン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｌｃＤＥＦを含むｇｌｃＤＥＦ近傍領域を増幅させた。

このＰＣＲによって、野生株ＭＧ１６５５株をはじめとするｇｌｃＤＥＦがテトラサイクリン耐性遺伝子に置換されていない株においては約４．０ｋｂｐ断片が増幅される一方、ｇｌｃＤＥＦ領域がテトラサイクリン耐性遺伝子に置換された株においては約２．２ｋｂｐ断片が増幅される。ＰＣＲによって約２．２ｋｂｐ断片が増幅された株を選抜しＭＧ１６５５ｇｌｃＤＥＦ欠失株（以下△ｇｌｃＤＥＦ株と略することがある）と命名した。

（製造例３）エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｎａｄＲ＆ｇｌｃＤＥＦ欠失株の作製
製造例１で得られた△ｎａｄＲ株に対して、製造例２と同様にしてｇｌｃＤＥＦを欠失させた。得られた株をＭＧ１６５５ｎａｄＲ＆ｇｌｃＤＥＦ欠失株（以下△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ株と略することがある）と命名した。

（製造例４）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターの構築
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３１０５９）。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ６４５４１）。
ｆｕｃＯを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、配列番号１１（ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧ）と配列番号１２（ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．２ｋｂｐのｆｕｃＯフラグメントを得た。

ａｌｄＡを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、配列番号１３（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣ）と配列番号１４（ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化することで約１．５ｋｂｐのａｌｄＡフラグメントを得た。

さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、配列番号１５（ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ）と配列番号１６（ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。

上記の３つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からプラスミドを回収し、このプラスミドをｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡと命名した。

（実施例１）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターによる△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ株形質転換体の構築
製造例４で得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡを製造例３で得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を得た。

（製造例５）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターによる△ｇｌｃＤＥＦ株形質転換体の構築
製造例４で得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡを製造例２で得られた△ｇｌｃＤＥＦ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を得た。

（実施例２）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株によるグリコール酸生産
実施例１において得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を前培養として三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬに植菌し、一晩、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、以下に示す組成の培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ_３水溶液で調整）で行った。前記の条件で最初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの時間を培地中のグルコース濃度０．１ｇ／Ｌ未満となるような可変速度でグルコースを全量で４０ｇ供給した。

＜培地組成＞
ポリペプトン：７ｇ／Ｌ
グルコース：３０ｇ／Ｌ
Ｆｅ_２ＳＯ_４：０．０９ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＨＰＯ_４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ_２ＰＯ_４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：５ｇ／Ｌ
溶媒：水

培養開始後２４時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌した。集菌後の湿菌体を４．５ｇ秤量し、エチレングリコール６５ｇと共に蒸留水に懸濁し最終液量を５００ｍｌとした。懸濁液をＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に移し７０時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度５５０ｒｐｍ、反応温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ_３水溶液で調整）で行った。得られた反応液中のグリコール酸蓄積量を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーを用い、以下の設定にて定量した。

カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化工社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．１）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器
測定波長：２８０ｎｍ

また、湿菌体の一部を５０℃で乾燥させた後の乾燥重量から、反応に使用した菌体の乾燥菌体重量を求めた。
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株の乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量は２７．１ｇであった。

また、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株の生育速度は、比較例１における△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株と同様のものであり、ｎａｄＲ遺伝子の破壊による生育の遅延が起きていないことが確認された。

（比較例１）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株によるグリコール酸生産
製造例５で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄ株の乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量は２０．２ｇであった。

（参考例１）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株における細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量の測定
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株、および△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を実施例２と同様に培養した。

培養開始後２４時間の△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株および△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株それぞれを２本の微量遠沈管に１ｍＬずつサンプリングし、４℃で遠心、集菌した。２本の遠沈管のうち１本をＮＡＤ測定、１本をＮＡＤＨ測定に使用し、それぞれ以下の処理を行った。
ＮＡＤ測定用のサンプルには、集菌した湿菌体１．５ｍｇあたり４００μＬの０．０４ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を加え懸濁した。懸濁液を９０℃で３分加熱の後、氷上で急冷した。この処理液の上清を用い、以下に示す組成の反応液を作成した。なお１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌとしてｐＨ９．０のものを用いた。またアルコールデヒドロゲナーゼとしてＳＩＧＭＡ社製アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ３２６３）を１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で溶解し、４００ユニット／ｍＬ（ただし１ユニットはｐＨ８．８、２５℃の条件下、１分間に１μｍｏｌのエタノールをアセトアルデヒドに変換するのに必要な酵素量）としたものを使用した。反応液の４５０ｎｍにおける吸光度をテトラカラーワン（生化学工業社製）のプロトコールに従って測定した。なおＳＩＧＭＡ社製ＮＡＤの溶液について同様の処理を施したものを測定することにより検量線を作成し、サンプルのＮＡＤ濃度を求めた。

ＮＡＤＨ測定用のサンプルには、集菌した湿菌体１．５ｍｇあたり４００μＬの０．０４ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を加え懸濁した。懸濁液を９０℃で３分加熱の後、氷上で急冷した。この処理液の上清を用い、以下に示す組成の反応液を作成した。なお１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌとしてｐＨ８．８のものを用いた。またアルコールデヒドロゲナーゼとしてＳＩＧＭＡ社製アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ３２６３）を１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で溶解し、４００ユニット／ｍＬ（ただし１ユニットはｐＨ８．８、２５℃の条件下、１分間に１μｍｏｌのエタノールをアセトアルデヒドに変換するのに必要な酵素量）としたものを使用した。

反応液の４５０ｎｍにおける吸光度をテトラカラーワン（生化学工業社製）のプロトコールに従って測定した。なおＳＩＧＭＡ社製ＮＡＤＨの溶液について、同様の処理を施したものを測定することにより検量線を作成し、サンプルのＮＡＤＨ濃度を求めた。

その結果、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株のＮＡＤ量、ＮＡＤＨ量は、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株と比較して、それぞれ１．７倍、１．６倍増加していた。これによりｎａｄＲ遺伝子を欠失させた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株では、ＮＡＤおよびＮＡＤＨ、すなわちニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生産能が強化されていることが確認された。

＜反応液組成＞
サンプル上清：２５μＬ
１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ：２５μＬ
２５％エタノール：１０μＬ
純水：２０μＬ
テトラカラーワン（生化学工業社製）：１０μＬ
アルコールデヒドロゲナーゼ：１０μＬ

（製造例６）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターの構築
エシェリヒア・コリのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ｎｄｈと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｖ００３０６）。

ｎｄｈを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、配列番号１７（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧ）と配列番号１８（ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅することで約１．３ｋｂｐのｎｄｈフラグメントを得た。得られたｎｄｈフラグメントをＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ処理した。このＤＮＡフラグメントと、製造例４で作成したｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し平滑末端処理、脱リン酸化処理を行ったフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、得られたプラスミドをｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈと命名した。

（実施例３）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターによる△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ株形質転換体の構築
製造例６で得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈを製造例３で得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株を得た。

（実施例４）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株によるグリコール酸生産
実施例３で得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。なお、この菌株について、実施例２で培養した結果と比較してｎｄｈを強化することによる生育の遅延は観察されなかった。△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株の乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量を、比較例１および実施例２の結果とあわせて表１に示した。

比較例１と実施例２の比較から、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能の強化により、グリコール酸の生産性は１．３倍に向上した。

また、比較例１と実施例４の比較から、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能の強化および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能の強化によりグリコール酸の生産性は３．６倍に向上した。

（製造例７）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ同時発現ベクターの構築
エシェリヒア・コリのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子（ｐｎｃＢ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０５５６８）。

ｐｎｃＢを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、配列番号１９（ＣＧＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣ）及び配列番号２０（ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＧＣＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅することで約１．２ｋｂｐのｐｎｃＢフラグメントを得た。さらに得られたｐｎｃＢフラグメントをＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ処理した。このＤＮＡフラグメントと、製造例４で作成したｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、平滑末端処理、脱リン酸化処理を行ったフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、該プラスミドをｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢと命名した。

（実施例５）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ同時発現ベクターによる△ｇｌｃＤＥＦ形質転換体の構築
製造例７で得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢを製造例２で得られた△ｇｌｃＤＥＦ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株を得た。

（実施例６）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株によるグリコール酸生産
実施例５で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株における乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量は２６．７ｇであった。比較例１の△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株における乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸量（２０．２ｇ）と比較して、ｐｎｃＢの強化により、生産性が１．３倍に向上していた。

（参考例２）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株における細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量の測定
実施例５で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株および対照となる△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡについて、参考例１と同様に培養および細胞内ＮＡＤ量、ＮＡＤＨ量の測定を行った。その結果、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株において、ＮＡＤ量、ＮＡＤＨ量は、それぞれ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株の２．６倍、２．１倍であった。これによりｐｎｃＢを強化した△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｐｎｃＢ株では、ＮＡＤおよびＮＡＤＨ、すなわちニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生産能が強化されていることが確認された。

（参考例３）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株における細胞内ＮＡＤおよびＮＡＤＨ含量測定
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、および△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について、実施例２と同様に培養およびグリコール生産を行った。グリコール酸生産時の△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、および△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について一定時間においてサンプリングを行い、参考例１と同様に細胞内ＮＡＤ量、ＮＡＤＨ量を測定した。図１は、この時のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）、縦軸はＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）を示している。
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株において常にＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の値が小さく、ＮＡＤＨからＮＡＤを再生していることが示された。

（製造例８）ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ発現ベクターの構築
エシェリヒア・コリのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ｎｄｈと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｖ００３０６）。ｎｄｈを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号１７と配列番号２１（ＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．３ｋｂｐのｎｄｈフラグメントを得た。
上記のＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｎｄｈのＤＮＡフラグメントが正しく挿入されていることを確認したのち、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、さらに脱リン酸化処理した。
また、ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号１５と配列番号１６に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先述のＥｃｏＲＩ処理、脱リン酸化処理したプラスミドと、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からプラスミドを回収し、ＧＡＰＤＨプロモーターのフラグメントが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰｎｄｈと命名した。

（実施例７）ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ発現ベクターによる△ｎａｄＲ株形質転換体および△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ株形質転換体の構築
製造例１で得られた△ｎａｄＲ株および製造例３で得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦを製造例８で得られたプラスミドｐＧＡＰｎｄｈで形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｎａｄＲ／ｐＧＡＰｎｄｈ株および△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｎｄｈ株を得た。

（製造例９）ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ発現ベクターによるＭＧ１６５５株形質転換体の構築
製造例８で得られたプラスミドｐＧＡＰｎｄｈにより大腸菌野生株ＭＧ１６５５株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することによりＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｎｄｈ株を得た。

（実施例８）△ｎａｄＲ／ｐＧＡＰｎｄｈ株、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｎｄｈ株によるグリコール酸生産
ＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）に終濃度０．２％となるようグルコースを添加した培地５ｍＬを入れた試験管に実施例７で得られた△ｎａｄＲ／ｐＧＡＰｎｄｈ株、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｎｄｈ株および対照として△ｎａｄＲ株、ＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｎｄｈ、野生株ＭＧ１６５５株をそれぞれ植菌し、一晩、培養温度３７℃、２００ｒｐｍで攪拌培養を行った。培養液全量を遠心分離し、得られた湿菌体の重量を測定したのち、以下に示す反応液１ｍｌを作成し、試験管を用いて３０℃、２００ｒｐｍで攪拌し、４８時間グリコール酸生産を行った。

＜反応液組成＞
１ｍｏｌ／Ｌ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）：２５０μＬ
エチレングリコール：５０μＬ
菌体：培養液より回収した全菌体
純水で１ｍｌに調整

菌株それぞれの湿菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量を表２に示した。△ｎａｄＲ／ｐＧＡＰｎｄｈ株、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｎｄｈ株において顕著にグリコール酸の生産性が向上していることが示された。

（実施例９）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株によるグリコール酸生産反応の温度条件検討
実施例３で得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株について実施例２と同様に培養を行った。ただし、培地中ポリペプトンの濃度を１ｇ／Ｌとした。得られた菌体について、実施例２と同様にグリコール酸生産反応を実施した。ただし反応に加える湿菌体量を７ｇ、攪拌速度を７５０ｒｐｍ、反応時間を２４時間とし、反応温度は３０℃、３５℃、３７℃、および４０℃のそれぞれの条件で実施した。図２はこの時のグリコール酸蓄積量を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）、縦軸はグリコール酸蓄積量（ｇ／Ｌ）を示している。
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株により上記条件においても十分量のグリコール酸を生産できることが示された。

（実施例１０）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株によるグリコール酸生産反応のｐＨ条件検討
実施例３で得られた△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株について実施例２と同様に培養を行った。ただし、培地中ポリペプトンの濃度を１ｇ／Ｌとした。得られた菌体について、実施例２と同様にグリコール酸生産反応を実施した。ただし、反応液のｐＨをｐＨ７．７、ｐＨ７．２、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ４．３のそれぞれの条件で制御し実施した。図３はこの時のグリコール酸蓄積量を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）、縦軸はグリコール酸蓄積濃度（ｇ／L）を示している。
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株によるグリコール酸生産はｐH６．０以上で可能であることが示された。

本発明のヒドロキシカルボン酸の生産方法および微生物は、ポリマー原料や医薬中間体として有用なグリコール酸等のヒドロキシカルボン酸類の製造に用いることができる。

非特許文献３においては、エシェリヒア・コリにｐｎｃＢの発現ベクターを導入することでニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの含量が向上することが報告されている。
特開平１０−１７４５９３号公報 特開平１０−１７４５９４号公報 国際公開第２００５／１０６００５号パンフレット Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６５（１０），ｐｐ．２２６５−２２７０，（２００１） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１８７（８）， ｐｐ．２７７４−２７８２，（２００５） Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２３８−２４７，（２００２）

培養に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
また、培地組成は、ポリペプトン０．５ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下、Ｆｅ_２ＳＯ_４０．０２ｇ／Ｌ以上０．３ｇ／Ｌ以下、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、ＫＨ_２ＰＯ_４０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４０．３ｇ／Ｌ以上１５ｇ／Ｌ以下（溶媒は水）とすると好ましい。

（比較例１）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株によるグリコール酸生産
製造例５で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株の乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量は２０．２ｇであった。

（参考例３）△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株における細胞内ＮＡＤおよびＮＡＤＨ含量測定
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、および△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について、実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。グリコール酸生産時の△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、および△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について一定時間においてサンプリングを行い、参考例１と同様に細胞内ＮＡＤ量、ＮＡＤＨ量を測定した。図１は、この時のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）、縦軸はＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）を示している。
△ｎａｄＲ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株において常にＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の値が小さく、ＮＡＤＨからＮＡＤを再生していることが示された。

Claims (19)

1. 微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する方法において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物を用いることを特徴とするヒドロキシカルボン酸の生産方法。
2. 微生物が、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
   （１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
   （２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。
3. 微生物が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化した微生物であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
4. 微生物が、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを導入することにより酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化した微生物であることを特徴とする請求項３記載の生産方法。
5. 微生物が、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
6. 微生物が、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴とする請求項３記載の生産方法。
7. 微生物が、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする請求項１、３、５又は６記載の生産方法。
8. 末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールがエチレングリコールであり、ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生産方法。
9. ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化し、かつ、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物。
   （１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
   （２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。
10. 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化したことを特徴とする請求項９記載の微生物。
11. ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化し、かつ、下記（１）および（２）の少なくとも一つの遺伝子操作を行うことによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産能を強化した微生物。
    （１） 微生物内のｎａｄＲ遺伝子を欠失、変異、又は置換させること。
    （２） 微生物内のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを微生物に導入すること。
12. グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減したことを特徴とする請求項９または１０に記載の微生物。
13. グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減したことを特徴とする請求項１１に記載の微生物。
14. 微生物がエシェリヒア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属のいずれかである請求項１〜８のいずれか１項に記載の生産方法。
15. 微生物がエシェリヒア・コリである請求項１４に記載の生産方法。
16. 微生物がエシェリヒア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属のいずれかである請求項９、１０、１２のいずれか１項に記載の微生物。
17. 微生物がエシェリヒア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルビニア属、エルシニア属、フォトラブドゥス属のいずれかである請求項１１または１３に記載の微生物。
18. 微生物がエシェリヒア・コリである請求項１６に記載の微生物。
19. 微生物がエシェリヒア・コリである請求項１７に記載の微生物。

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