JP2007174947A - 酵母株および乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化された酵母株と、その固定化された酵母株を用いることにより、高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】
乳酸合成酵素が導入された酵母株であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠した酵母株を固定化された酵母株と、その酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取乳酸の製造方法である。
【選択図】 図1
乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化された酵母株と、その固定化された酵母株を用いることにより、高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】
乳酸合成酵素が導入された酵母株であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠した酵母株を固定化された酵母株と、その酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取乳酸の製造方法である。
【選択図】 図1
Description
本発明は、醗酵や食品など様々な応用微生物工業で利用される固定化された酵母株と、その酵母株を用いて高い対糖収率で乳酸を製造する方法に関するものである。
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料生産が盛んに行われている。その中で生物由来材料である乳酸を用いたポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
乳酸の生産は、ラクトバチラス(Lactobacillus)属やラクトコッカス(Lactococcus)属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程および精製工程に多大なコストを要している。
一方、酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造法についても複数、提案されている(特許文献1〜3および非特許文献1、2参照。)。本来、乳酸生成能を持たない酵母に乳酸生成酵素遺伝子を導入し、乳酸を生産させることにより中和操作を軽減し、低コストな乳酸製造工程を構築することが可能である。
酵母は、その生理機能を巧みに利用して、多数の有用物質を工業生産する微生物として利用されている。酵母を生体触媒として工業的に利用する場合には、その機能を最大限発揮させることが重要であり、そのため種々の固定化法が現在までに開発され、実際に工業生産に応用されている。現在、工業的に開発、応用されている酵母の代表的な固定化法には、アルギン酸カルシウムやk−カラギーナンなどによるゲル包括法が知られており、エタノール生産などに利用されている(非特許文献3参照。)。固定化酵母を用いたエタノール生産の利点は、効率および生産性の向上があることである。しかしながら、固定化酵母を用いた乳酸の製造方法は知られていない。
また、固定化微生物を用いた乳酸生産として、リゾパス・オリゼ(Rhizopus orizae)の胞子をコットンシートに吸着固定し、コットンシート上で増殖させた固定化菌糸体を用いた生産が報告されている(非特許文献4参照。)。この報告内容においては、胞子を吸着固定したコットンシートをさらにステンレス製の支持体に固定して、乳酸生産に用いている。この方法では、菌糸体の増殖のばらつきから生産の不安定性および菌糸体の遊離が考えられ、連続的な生産プロセスとしては課題が残る。また、スケールに応じて、ステンレス製支持体の改良が必要でありコストを要する。それに対し、ゲル包括法は、ゲルに増殖した微生物を包括することにより大きな増殖を押さえ、安定した細胞の維持が可能であり、また、固定化菌体の再利用が可能である。ゲル包括法は、用いられるゲル材料を選択することにより、固定化菌体作製のコストを抑えられ、培養装置の改良も必要はない。リゾパス・オリゼは、菌糸体を形成して生長するために、ゲル包括法を用いた固定化を行うことはできない。また、報告によると、リゾパス・オリゼは、低pH域での生産性に問題が生じている。これに対しても、酸性条件下で生育が可能であるという酵母の特性から解決可能であり、乳酸生産能を持つ酵母株をゲル包括固定し、乳酸生産を行うことは非常に有用な技術である。
特開2001−204468号公報
特表2001−516584号パンフレット
特開2003−259878号公報
Applied and Environmental Microbiology(アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー)、71、1964(2005)
Applied and Environmental Microbiology(アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー)、71、2789(2005)
Applied and Environmental Microbiology(アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー)、44、19(1982)
Biotechnology and Bioengineering(バイオテクノロジー アンド バイオエンジニアリング)、80、1(2002)
酵母は、その生理機能を巧みに利用して、多数の有用物質を工業生産する微生物として利用されている。酵母を生体触媒として工業的に利用する場合には、その機能を最大限発揮させることが重要であり、そのため種々の固定化法が現在までに開発され、実際に工業生産に応用されている。現在、工業的に開発、応用されている酵母の代表的な固定化法には、アルギン酸カルシウムやk−カラギーナンなどによるゲル包括法が知られており、エタノール生産などに利用されている(非特許文献3参照。)。固定化酵母を用いたエタノール生産の利点は、効率および生産性の向上があることである。しかしながら、固定化酵母を用いた乳酸の製造方法は知られていない。
また、固定化微生物を用いた乳酸生産として、リゾパス・オリゼ(Rhizopus orizae)の胞子をコットンシートに吸着固定し、コットンシート上で増殖させた固定化菌糸体を用いた生産が報告されている(非特許文献4参照。)。この報告内容においては、胞子を吸着固定したコットンシートをさらにステンレス製の支持体に固定して、乳酸生産に用いている。この方法では、菌糸体の増殖のばらつきから生産の不安定性および菌糸体の遊離が考えられ、連続的な生産プロセスとしては課題が残る。また、スケールに応じて、ステンレス製支持体の改良が必要でありコストを要する。それに対し、ゲル包括法は、ゲルに増殖した微生物を包括することにより大きな増殖を押さえ、安定した細胞の維持が可能であり、また、固定化菌体の再利用が可能である。ゲル包括法は、用いられるゲル材料を選択することにより、固定化菌体作製のコストを抑えられ、培養装置の改良も必要はない。リゾパス・オリゼは、菌糸体を形成して生長するために、ゲル包括法を用いた固定化を行うことはできない。また、報告によると、リゾパス・オリゼは、低pH域での生産性に問題が生じている。これに対しても、酸性条件下で生育が可能であるという酵母の特性から解決可能であり、乳酸生産能を持つ酵母株をゲル包括固定し、乳酸生産を行うことは非常に有用な技術である。
本発明の目的は、乳酸合成酵素遺伝子を導入した固定化酵母株と、その固定化酵母株を用いることにより高い対糖収率をもたらす乳酸の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、乳酸合成酵素遺伝子を導入した酵母株を作出し、さらにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させた酵母株を固定化材料に抱埋し、該固定化乳酸生成酵母株を用いることにより安定な乳酸製造方法を発明した。該酵母株を用いることにより、エタノール生成を抑制し、高い収率で乳酸が得られ、上記課題を解決するに至った。
すなわち、本発明によれば、下記の(1)〜(5)に記載の構成にかかる発明を提供することができる。
(1)乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
(2)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる前記(1)記載の酵母株。
(3)アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる前記(1)または(2)記載の酵母株。
(4)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
(5)酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする前記(4)記載の乳酸の製造方法。
すなわち、本発明によれば、下記の(1)〜(5)に記載の構成にかかる発明を提供することができる。
(1)乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
(2)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる前記(1)記載の酵母株。
(3)アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる前記(1)または(2)記載の酵母株。
(4)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
(5)酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする前記(4)記載の乳酸の製造方法。
本発明によれば、乳酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換酵母株であって、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を必要に応じて施した酵母株を固定化し、該固定化酵母株を糖質存在下で培養することにより、エタノール合成を抑制し、高い対糖収率で乳酸を製造をすることができる。
本発明の酵母株は、乳酸合成酵素遺伝子が導入され、さらに固定化材料に抱埋されてなる固定化された酵母株であり、より好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株である。さらに必要に応じ、前記酵母株に対して、変異処理によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させてなる酵母株である。
また、本発明の乳酸の製造方法は、前記の固定化された酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物中から該乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法である。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる酵母株(微生物)は、乳酸脱水素酵素を発現する能力をもつ、乳酸合成酵素遺伝子が導入された酵母株であり、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、より好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母株などを挙げることができる。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる酵母株(微生物)は、乳酸脱水素酵素を発現する能力をもつ、乳酸合成酵素遺伝子が導入された酵母株であり、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、より好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母株などを挙げることができる。
上記サッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母株としては、サッカロマイセス・セレビシエなどを挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、配列番号1で表されるデオキシリボ核酸(以下、DNAと略す。)が変異した染色体DNAを有するサッカロマイセス・セレビシエを挙げることができる。
アルコールデヒドロゲナーゼ(以下、ADHと略す。)遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株とは、遺伝子配列に偶発的もしくは人為的に変異を誘発してなる変異を持つ酵母株であり、その結果、ADH活性が、親株の好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは10%以下のADH活性であることを特徴とする酵母株である。
ADH活性は、酵母株の無細胞抽出液を調製し、該抽出液にエタノールおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を添加し、添加したエタノールがアセトアルデヒドに変換する過程において生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)の生成量により測定することが出来る。
アルコールデヒドロゲナーゼ(以下、ADHと略す。)遺伝子配列に、欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入という変異をもつ酵母株とは、遺伝子配列に偶発的もしくは人為的に変異を誘発してなる変異を持つ酵母株であり、その結果、ADH活性が、親株の好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは10%以下のADH活性であることを特徴とする酵母株である。
ADH活性は、酵母株の無細胞抽出液を調製し、該抽出液にエタノールおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を添加し、添加したエタノールがアセトアルデヒドに変換する過程において生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)の生成量により測定することが出来る。
ADH活性が低下した酵母株は、ADHタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ADH1遺伝子に変異が生じているために、当該遺伝子がコードするタンパク質を生産しない、もしくは非活性型または活性が低下した形で生産する酵母株であればいずれの酵母株でもよく、該変異としては、例えば、ADH1タンパク質をコードするDNAの全部もしくは一部が欠損している変異、および該タンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失または置換された変異などを挙げることができる。
本発明において、ADH1タンパク質をコードするDNAの全部もしくは一部が欠損しているとは、該染色体DNAの塩基配列において、少なくとも1以上のアミノ酸残基が欠失した変異を有するDNAを挙げることができる。ADH1タンパク質のアミノ酸配列において、少なくとも1以上のアミノ酸が欠失した変異とは、ADH1タンパク質をコードするDNAに対し、部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失した変異をいう。
本発明において、ADH1タンパク質をコードするDNAの全部もしくは一部が欠損しているとは、該染色体DNAの塩基配列において、少なくとも1以上のアミノ酸残基が欠失した変異を有するDNAを挙げることができる。ADH1タンパク質のアミノ酸配列において、少なくとも1以上のアミノ酸が欠失した変異とは、ADH1タンパク質をコードするDNAに対し、部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失した変異をいう。
部位特異的変異の導入は、「モレキュラークローニング」(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))、「カレント プロトコールズ イン モレキュラーバイオロジー」(Current Protocols in Morecular Biology, John Wiley & Sons(1987−1997))および「メソッズ イン エンザイモロジー」(Methods in Enzymology)等に記載の方法に準じて行うことができる。部位特異的変異の導入は、具体的には、変異を挿入しようとするDNAを適当なベクターにクローニングし、該クローン化DNAに対して変異処理を施すことにより行うことができる。例えば、変異を入れようとする箇所にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドに対して塩基置換を施し、該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ反応により変異DNAを合成することによる変異導入方法が挙げられるが、本発明における変異導入方法はこれに限定されるものではない
上記したADH1遺伝子の全部もしくは一部が欠損した変異を有する酵母株の該DNAが、野生型株のADH1遺伝子の全部もしくは一部を欠損しているか否かは、該酵母株と親株のADH1タンパク質をコードするDNA領域をポリメラーゼ チェイン リアクション(Polymerase Chain Reaction)(以下、PCRと略す。)により増幅させ、その増幅サイズを比較することにより確認することができる。上記親株とは、上記変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株および遺伝子組み換え技術を用いて造成した組み換え株であってもよい。
上記したADH1遺伝子の全部もしくは一部が欠損した変異を有する酵母株の該DNAが、野生型株のADH1遺伝子の全部もしくは一部を欠損しているか否かは、該酵母株と親株のADH1タンパク質をコードするDNA領域をポリメラーゼ チェイン リアクション(Polymerase Chain Reaction)(以下、PCRと略す。)により増幅させ、その増幅サイズを比較することにより確認することができる。上記親株とは、上記変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株および遺伝子組み換え技術を用いて造成した組み換え株であってもよい。
導入される乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、酵母株において生産されうる酵素をコードするDNAであれば特に限定されないが、該酵素の活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするDNAが好ましい。酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするDNAとしては、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる該酵素活性が強い乳酸脱水素酵素をコードするDNAや、強力なプロモーターの支配下に該酵素をコードするDNAを連結したDNAなどを挙げることができる。具体的な乳酸脱水素酵素としては、ホモ・サピエンス(Homo Sapiens)由来のL−乳酸脱水素酵素遺伝子(以下、L−ldh―hと略す。)またはボス・トウラス(Bos taurus)由来のL−乳酸脱水素酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。
図1は、本発明で用いられるldh−b発現用プラスミドpTRS11の構造を示す構築図である。
L−ldh−h遺伝子の発現様式としては、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、染色体への導入による発現、またはプラスミドによる発現など特に限定されないが、プラスミドによる発現を微生物としてサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を用いる場合は、例えば、L−ldh―h遺伝子をpTRS11(図1)に連結したマルチコピー発現プラスミドpTRS48を挙げることができる。
pTRS48を有する形質転換酵母株の培養は、乳酸脱水素酵素が発現する培養法であれば特に限定されないが、pTRS48を有するサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の場合は、例えば、SC−Ura培地[20g/l グルコース、6.7g/l Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids(ディフコ社製)、Drop―out supplement without uracil(シグマ社製)]を前培養の培地として用いて一晩培養後、得られた培養液を終濃度が1%になるように、SC−Ura培地に接種して培養する方法を挙げることができる。
酵母株の固定化に用いられる固定化材料(担体)としては、酵母細胞を包括できるものであればいずれの担体でもよいが、例えば、アルギン酸カルシウムゲル、k−カラギーナン、ポリアクリルアミド、低メトキシペクチンゲル、寒天ゲルおよびシリカゾルなどが挙げられる。
アルギン酸カルシウムゲルへの酵母細胞を包埋する方法としては、上記の酵母株を所定の菌体量になるまで培養した培養液から、菌体を遠心分離やろ過などの分離法により回収し、1%アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁し、懸濁液をCaCl2を含む水溶液中に滴下することにより、酵母細胞を包埋することができる。得られた固定化酵母株をSC−Ura培地に接種し、一定時間培養したときの培養液中の乳酸生産量を測定する。
培養液中の乳酸濃度は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる方法で定量することができ、例えば、培養液を遠心分離して培養液上清を調整し、該培養液上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することで培養液の、例えば、乳酸やピルビン酸等の有機酸濃度を定量することができる。
ADH1タンパク質をコードする遺伝子が変異を有する酵母株の製造方法としては、[1]相同組み換え法などを用いて、ADH1タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部が欠損した酵母株を製造する方法や、[2]相同組み換え法などを用いて、ADH1タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも1以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは挿入等の変異を有するアミノ酸配列をコードするDNAを染色体上に有する微生物を製造する方法などが挙げられる。
上記[1]の方法としては、直鎖DNAによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株を用いる方法を挙げることができる。直鎖DNAとしては、例えば、LEU2遺伝子の両端にADH1遺伝子の内部または近傍の配列と相同性を有するDNAを配置した直鎖DNAを挙げることができる。
該直鎖DNAを、直鎖DNAによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株に常法により導入し、ロイシン要求性回復株を選択することにより、ADH1遺伝子欠損または部分欠損酵母株を取得することができる。
上記[2]の方法としては、ADH1遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより、該遺伝子がコードするアミノ酸配列において、少なくとも1以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする変異型遺伝子を取得し、相同組み換え法を用いることにより、染色体DNA上にある野生型ADH1遺伝子が変異型ADH1遺伝子に置換された染色体DNAを有する酵母株を作出する方法などを挙げることができる。
本発明で用いられる酵母株は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入した酵母株に、上記方法によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を施すことにより製造することができるが、該酵母株がすでに目的とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性が野生株より明らかに低下している場合は、必ずしも変異処理を施す必要はない。
本発明で用いられる酵母株は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入した酵母株に、上記方法によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理を施すことにより製造することができるが、該酵母株がすでに目的とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性が野生株より明らかに低下している場合は、必ずしも変異処理を施す必要はない。
また、本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成酵素(乳酸脱水素酵素)をコードする遺伝子を組み込んだ固定化酵母株であり、かつ必要に応じADH1をコードするDNAの全部もしくは一部が欠損、欠失、置換または挿入等の変異を有する染色体DNAを保持する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低い酵母株を固定化し、該固定化された酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該乳酸脱水素酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から該乳酸を採取する乳酸の製造方法である。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株の培養は、下記した通常の方法に従って行うことができる。本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株を培養する培地は、該固定化酵母株が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該酵母株が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
生成した乳酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする乳酸を単離し、精製することができる。例えば、特開2001−204464公報および特開平9−135698などに公開されているような方法により精製することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株の培養は、下記した通常の方法に従って行うことができる。本発明の乳酸の製造方法に用いられる固定化酵母株を培養する培地は、該固定化酵母株が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該酵母株が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
生成した乳酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする乳酸を単離し、精製することができる。例えば、特開2001−204464公報および特開平9−135698などに公開されているような方法により精製することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
(実施例1) 固定化酵母株を用いた乳酸の生産
Saccharomyces cerevisiae NBRC10505株のゲノムDNA上に存在するピルビン酸脱炭酸酵素(Pyruvate decarboxylase)1遺伝子(以下、PDC1遺伝子と略す。)をTRP1をコードする遺伝子と置換した遺伝子組み換え株(以下、Δpdc1株と略す。)を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δpdc1株は、次のようにして作出した。pRS424プラスミドDNAを鋳型にし、配列番号2および配列番号3で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、TRP1遺伝子の5’上流に配列番号4で示した配列、3’下流に配列番号5で示した配列が付加したDNA断片を増幅させた。PCRは、宝酒造社製のLA−Taqを用いて、鋳型とするプラスミドDNA10ng、各プライマー10pmolを含む反応液LA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃の温度で10分間保温後、94℃の温度で30秒間、55℃の温度で30秒間、72℃の温度で1分30秒間のサイクルを25回繰り返した後、72℃の温度で4分間保温する条件で行った。増幅したDNA断片はQuantum Prep PCR Kleen Spin Columns(Bio−Rad社製)を用いて精製した。該DNA1μgを用いて、NBRC10505株を形質転換した。形質転換はYEASTMAKER Yeast Transformation System(CLONTECH社製)を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするNBRC10505株は、トリプトファン合成能を欠損した株であり、該DNA断片上にあるTRP1遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムDNA上に該DNAが二回相同組み換えにより挿入されたΔpdc1株を選択することができる。次に、Δpdc1株をプラスミドpTRS48を用いて形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔpdc1株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、pTRS48プラスミドDNA上にあるURA3遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でpTRS48を有した形質転換体を選択することができる。
Saccharomyces cerevisiae NBRC10505株のゲノムDNA上に存在するピルビン酸脱炭酸酵素(Pyruvate decarboxylase)1遺伝子(以下、PDC1遺伝子と略す。)をTRP1をコードする遺伝子と置換した遺伝子組み換え株(以下、Δpdc1株と略す。)を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δpdc1株は、次のようにして作出した。pRS424プラスミドDNAを鋳型にし、配列番号2および配列番号3で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、TRP1遺伝子の5’上流に配列番号4で示した配列、3’下流に配列番号5で示した配列が付加したDNA断片を増幅させた。PCRは、宝酒造社製のLA−Taqを用いて、鋳型とするプラスミドDNA10ng、各プライマー10pmolを含む反応液LA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃の温度で10分間保温後、94℃の温度で30秒間、55℃の温度で30秒間、72℃の温度で1分30秒間のサイクルを25回繰り返した後、72℃の温度で4分間保温する条件で行った。増幅したDNA断片はQuantum Prep PCR Kleen Spin Columns(Bio−Rad社製)を用いて精製した。該DNA1μgを用いて、NBRC10505株を形質転換した。形質転換はYEASTMAKER Yeast Transformation System(CLONTECH社製)を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするNBRC10505株は、トリプトファン合成能を欠損した株であり、該DNA断片上にあるTRP1遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムDNA上に該DNAが二回相同組み換えにより挿入されたΔpdc1株を選択することができる。次に、Δpdc1株をプラスミドpTRS48を用いて形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔpdc1株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、pTRS48プラスミドDNA上にあるURA3遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でpTRS48を有した形質転換体を選択することができる。
作製した組み換え株、Δpdc1(pTRS48)株を10mlSC−Ura培地を用いて30℃の温度で24時間振とう培養した。10mlの該培養液を100mlのSC−Ura培地に接種し、30℃の温度で24時間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を回収し、湿重量5gの菌体を1%アルギン酸ナトリウム溶液10mlに懸濁した。該懸濁液を次の組成からなる溶液(以下、Glucose sol.と略す。)
[Glucose sol.の組成]
・Glucose 100g/L
・CaCl2 90mM
・KH2PO4 15mM
に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を、50mlのSC−Ura培地[100g/l グルコース、6.7g/l Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids(ディフコ社製)、Drop―out supplement without uracil(シグマ社製)]に接種し、30℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始14時間後に培養液を1ml採取し、該培養液中の乳酸濃度をHPLCを用いて、またエタノール濃度をGCを用いて測定した。HPLCおよびGCの分析条件を以下に示す。
[Glucose sol.の組成]
・Glucose 100g/L
・CaCl2 90mM
・KH2PO4 15mM
に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を、50mlのSC−Ura培地[100g/l グルコース、6.7g/l Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids(ディフコ社製)、Drop―out supplement without uracil(シグマ社製)]に接種し、30℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始14時間後に培養液を1ml採取し、該培養液中の乳酸濃度をHPLCを用いて、またエタノール濃度をGCを用いて測定した。HPLCおよびGCの分析条件を以下に示す。
[HPLC分析条件]
・カラム:Shim-Pack SPR-H(島津社製)
・移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
・反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
・検出方法:電気伝導度
・カラム温度:45℃
[GC分析条件]
・カラム:TC−1
・キャリアガス:ヘリウム
・流速:7ml/min.
・オーブン温度:100℃
・インジェクション温度:200℃
・検出器温度:200℃
・検出器:FID(Frame Ion Detecter)
その結果、乳酸が12.0g/l、エタノールが37.7g/l生産された。乳酸の対糖収率は12.1%であった。また、乳酸の生産速度は0.87g/l/hと算出された。
・カラム:Shim-Pack SPR-H(島津社製)
・移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
・反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
・検出方法:電気伝導度
・カラム温度:45℃
[GC分析条件]
・カラム:TC−1
・キャリアガス:ヘリウム
・流速:7ml/min.
・オーブン温度:100℃
・インジェクション温度:200℃
・検出器温度:200℃
・検出器:FID(Frame Ion Detecter)
その結果、乳酸が12.0g/l、エタノールが37.7g/l生産された。乳酸の対糖収率は12.1%であった。また、乳酸の生産速度は0.87g/l/hと算出された。
次に、固定化酵母株の再利用を検討した。
上記のように、Δpdc1(pTRS48)株を培養し、得られた菌体を上記のようにアルギン酸カルシウムゲルに固定化した。固定化したΔpdc1(pTRS48)株を40mlのSC−Ura培地に接種し、30℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始6時間後に培養液中の乳酸濃度を測定し(1)、該培養液を新しい40mlのSC−Ura培地に交換し、再度30℃の温度でゆっくりと振とう培養した。12時間後に乳酸濃度を測定し(2)、再び培養液を新しい40mlのSC−Ura培地に交換し、さらに6時間、30℃の温度でゆっくりと振とう培養した後、乳酸濃度を測定した(3)。(1)〜(3)のそれぞれの培養液中の乳酸濃度を測定したところ、(1)8.5g/L、(2)11.0g/L、(3)7.8g/Lであり、生産速度は、(1)1.4g/L/h、(2)0.92g/L/h、(3)1.3g/L/hと算出され、包括固定した酵母株を用いることにより、繰り返し安定した乳酸生産が行うことができる。各培養液は100倍希釈し、乳酸濃度を測定した。乳酸濃度の測定は、F−キット(L−乳酸)(JKインターナショナル社製)を用いて行った。
(実施例2) 固定化アルコールデヒドロゲナーゼ活性低下形質転換酵母株を用いた乳酸の生産
Δpdc1株のゲノムDNA上に存在するAlcohol dehydrogenase 1(以下、ADH1遺伝子と略す。)遺伝子座を欠失した遺伝子組み換え株(以下、Δadh1株と略す)を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δadh1株は、次のようにして作出した。pRS405プラスミドDNAを鋳型にし、配列番号6および配列番号7で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、LEU2遺伝子の5’上流に配列番号8で示した配列、3’下流に配列番号9で示した配列が付加したDNA断片を増幅させた。PCRおよび増幅したDNA断片の精製は、上記記載の方法に準じた。該DNA1μgを用いて、Δpdc1株を形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔpdc1株は、ロイシン合成能を欠損した株であり、該DNA断片上にあるLEU2遺伝子の働きにより、ロイシン非添加培地上でゲノムDNA上に該DNAが二回相同組み換えにより挿入されたΔadh1株を選択することができる。次に、Δadh1株をプラスミドpTRS48を用いて形質転換した。形質転換は、上記(実施例1)記載の方法に準じた。宿主とするΔpdc1株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、pTRS48プラスミドDNA上にあるURA3遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でpTRS48を有した形質転換体を選択することができる。
Δpdc1株のゲノムDNA上に存在するAlcohol dehydrogenase 1(以下、ADH1遺伝子と略す。)遺伝子座を欠失した遺伝子組み換え株(以下、Δadh1株と略す)を、二回相同組み換えを用いて作出した。Δadh1株は、次のようにして作出した。pRS405プラスミドDNAを鋳型にし、配列番号6および配列番号7で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、LEU2遺伝子の5’上流に配列番号8で示した配列、3’下流に配列番号9で示した配列が付加したDNA断片を増幅させた。PCRおよび増幅したDNA断片の精製は、上記記載の方法に準じた。該DNA1μgを用いて、Δpdc1株を形質転換した。形質転換は、上記記載の方法に準じた。宿主とするΔpdc1株は、ロイシン合成能を欠損した株であり、該DNA断片上にあるLEU2遺伝子の働きにより、ロイシン非添加培地上でゲノムDNA上に該DNAが二回相同組み換えにより挿入されたΔadh1株を選択することができる。次に、Δadh1株をプラスミドpTRS48を用いて形質転換した。形質転換は、上記(実施例1)記載の方法に準じた。宿主とするΔpdc1株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、pTRS48プラスミドDNA上にあるURA3遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でpTRS48を有した形質転換体を選択することができる。
作製した組み換え株、Δadh1(pTRS48)株を10mlSC−Ura培地を用いて30℃の温度で48時間振とう培養した。10mlの該培養液を100mlのSC−Ura培地に接種し、30℃の温度で48時間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を回収し、1%アルギン酸ナトリウム溶液10mlに懸濁した。該懸濁液をGlucose sol.に滴下し、アルギン酸カルシウムゲルに酵母株を固定化した。該固定化酵母株を50mlのSC−Ura培地に接種し、30℃の温度でゆっくりと振とう培養した。培養開始14時間後に培養液を1ml採取し、該培養液中の乳酸濃度をHPLC、エタノール濃度をGCを用いて測定した。分析条件は、上記記載の条件に準じた。その結果、乳酸が11.3g/l、エタノールが2.1g/l生産された。乳酸の対糖収率は65%であった。また、乳酸の生産速度は0.81g/l/hであり、親株と同等の生産速度を示した。
本発明により、高い収率で乳酸を生産することができる。また、本発明によれば、乳酸脱水素酵素が導入された酵母株に対して、さらにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させた酵母株を固定化することにより、アルコール生成量を減少させるとともに、親株と同等の生産速度を維持しつつ、高い対糖収率で乳酸を生産することが可能であり、コスト低減を図ることができる。
配列番号2―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号3―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号4―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号5―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号6―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号7―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号8―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号9―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号3―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号4―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号5―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号6―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号7―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号8―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号9―人工DNA配列の説明:合成DNA
Claims (5)
- 乳酸合成酵素遺伝子が導入され、かつ固定化材料に抱埋されてなる酵母株。
- アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子配列に欠損、欠失、塩基置換または塩基挿入されてなる請求項1記載の酵母株。
- アルコールデヒドロゲナーゼ活性を低下させる変異処理が施されてなる請求項1または2記載の酵母株。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の酵母株を、糖質存在下で培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
- 酵母株を、糖質存在下で培養し、培養物中に乳酸合成酵素により生成する乳酸を蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することを特徴とする請求項4記載の乳酸の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005375627A JP2007174947A (ja) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | 酵母株および乳酸の製造方法 |
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JP2005375627A JP2007174947A (ja) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | 酵母株および乳酸の製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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Family
ID=38300764
Family Applications (1)
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JP2005375627A Pending JP2007174947A (ja) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | 酵母株および乳酸の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP2007174947A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9453246B2 (en) | 2013-12-04 | 2016-09-27 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Yeast cell having reduced ethanol productivity and use of the yeast cell |
CN114134137A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-04 | 北京师范大学 | 甲状腺激素干扰物的检测方法及检测试剂盒 |
-
2005
- 2005-12-27 JP JP2005375627A patent/JP2007174947A/ja active Pending
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US9453246B2 (en) | 2013-12-04 | 2016-09-27 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Yeast cell having reduced ethanol productivity and use of the yeast cell |
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