CN116218802A - 一种l-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、编码基因及应用 - Google Patents

一种l-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种L‑泛解酸内酯脱氢酶及突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯/D‑泛解酸内酯中的应用。所述L‑泛解酸内酯脱氢酶源自Rhodococcus hoagii，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其经密码子优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明有益效果主要体现在：本发明转化所需的三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。本发明将中间产物酮泛解酸内酯KPL转化为DPL的过程中利用辅酶再生体系，通过将NADP+转化为NADPH，使得NADPH在体系中浓度相对稳定，转化能够高效进行。本方法具有专一性强、产物光学纯度高、有效控制KPL水解等优点，采用本方法制备DPL，添加LPL 200mM，36小时转化率达96.4％且没有KPL水解。

Description

一种L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、编码基因及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯/D-泛解酸内酯中的应用。
(二)背景技术
D-泛酸钙又称维生素B5，是辅酶A的组成部分，已经广泛应用于食品、饲料、医药、化工和化妆品等行业。D-(-)-泛解酸内酯，也称为(R)-泛解酸内酯，化学结构为D-(-)-泛解酸的γ-内酯，是合成D-(+)-泛酸的关键手性中间体。目前工业化合成D-泛解酸内酯采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线，从异丁醛和甲醛为起始原料出发，化学法合成DL-泛解酸内酯；其中的D-泛解酸内酯可以被D-泛解酸内酯水解酶立体选择性水解生成D-泛解酸，再经内酯化生成D-泛解酸内酯，留下的L-泛解酸内酯经化学消旋化为DL-泛解酸内酯重新循环拆分。DL-泛解酸内酯的拆分是合成D-泛解酸内酯中的关键步骤。水解酶的手性拆分制备工艺需要L-泛解酸内酯的消旋，D-泛解酸和L-泛解酸内酯的分离以及D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯。水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，仍然存在过程复杂、能耗物耗较高、需要消耗较多的酸碱等问题。鉴于此，开发更为直接、高效、环保的D-泛解酸内酯不对称合成方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。D-泛解酸内酯可通过氧化还原法不对称合成，该方法可通过两条不同途径实现，第一条途径先以L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸还原酶的作用下生成D-泛解酸，接着D-泛解酸在酸的作用下闭环形成D-泛解酸内酯；更为简捷的第二条途径是以混旋的DL-泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D-酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D-泛解酸内酯。与现有的水解酶催化通路相比，第二条途径工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；因此，第二条途径的氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。该途径中L-泛解酸内酯的脱氢是其关键步骤之一，由L-泛解酸内酯脱氢酶催化。该途径中酮泛解酸内酯不对称还原由NADPH依赖型共轭聚通还原酶催化，辅酶NADPH价格昂贵，因此在工业生产中往往需要偶联辅酶再生体系，将NAD(P)+转化为NAD(P)H，使体系中NAD(P)H能够稳定再生，转化能够高效进行。多酶催化转化是一种高选择性反应，可达到定向转化的目的。但多酶转化工艺多面临着酶活力低、酶稳定性低、辅酶循环再生效率低、多酶添加复杂、工程放大难等问题。而多酶重组菌全细胞参与转化能在一定程度上解决上述问题，但仍存在转化时间长、转化效果差等问题。
(三)发明内容
本发明目的是克服目前生产技术上的问题，提供一种高效简便、低成本、易于工业化生产的L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备酮基泛解酸内酯/D-泛解酸内酯中的应用。
本发明采用的技术方案是：
源自Rhodococcus hoagii的L-泛解酸内酯脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。其经密码子优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第156位、第224位、第241位、第254位进行单突变或多点联合突变获得。
优选的，所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第156位异亮氨酸突变为亮氨酸；(2)第224位苯丙氨酸突变为组氨酸；(3)第241位缬氨酸突变为异亮氨酸；(4)第254位亮氨酸突变为异亮氨酸。
更为优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5～7之一所示。
本发明所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有转氨酶活性的衍生的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白质，均属于本发明的保护范围。
本发明还涉及编码所述的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体的基因。所述L-泛解酸内酯脱氢酶RhoLPLDH及突变体编码基因序列全长均为1206bp，从第一个碱基起至第1206个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
本发明还涉及含有所述的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体编码基因的重组载体。通常的，所述载体质粒为pET28b(+)。
优选的，所述载体为双表达载体，具体可为pETDuet-1质粒或pCDFDuet-1质粒或pACYCDuet-1质粒，所述共轭聚酮还原酶基因(GenBank NO.CAG61069.1)来自光滑念珠菌Candida glabrata，经密码子优化后核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述葡萄糖脱氢酶基因(GenBank NO.KM817194.1)来自Exiguobacterium sibirium DSM17290，经密码子优化后核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。所述共表达载体的构建方法是将CglCPR和GDH基因分别插入双表达载体的不同多克隆位点。
本发明还涉及含有所述的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体编码基因的基因工程菌。所述重组菌表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，所述基因工程菌为L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体与共轭聚酮还原酶CglCPR和葡萄糖脱氢酶GDH三酶共表达工程菌，按如下方法构建获得：将含有L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体编码基因的pET28b(+)的重组质粒与双连接CglCPR和GDH的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选双抗性三酶重组共表达工程菌；所述共轭聚酮还原酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明还涉及所述L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体在微生物催化L-泛解酸内酯制备酮基泛解酸内酯中的应用。
进一步，本发明还涉及所述L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体在微生物催化制备D-泛解酸内酯中的应用。具体的，所述应用为利用上述的多酶共表达重组菌催化底物L-泛解酸内酯并偶联辅酶再生体系，所述辅酶再生体系以葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP+转化为NADPH。利用上述多酶共表达重组菌，催化200mM L-泛解酸内酯转化生产D-泛解酸内酯，36h时，DPL转化收率达到96.4％并且没有中间产物KPL水解。
进一步，所述应用为：将共表达的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、50mM的PB缓冲液(0.05MNa2HPO4，0.05MNaH2PO4)为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm(优选30℃、800rpm)条件下进行反应，于发酵液中获得D-泛解酸内酯。
所述转化体系中，底物加入终浓度10～400mM(优选100～200mM)，葡萄糖加入终浓度15～600mM(优选150～300mM)，催化剂用量以菌体湿重计为10～100g WCW/L(WCW细胞湿重)。
所述湿菌体可按如下方法制备：将含RhoLPLDH或突变体和CglCPR、GDH三酶的共表达工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素或50μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL硫酸链霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素或50μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL硫酸链霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h(OD600＝0.6-0.8)，培养液中加入终浓度为0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得表达RhoLPLDH或突变体蛋白和CglCPR、GDH蛋白的湿菌体。
本发明基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，蒸馏水溶解，调节pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素进行优化。
本发明有益效果主要体现在：本发明转化所需的三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。本发明将中间产物酮泛解酸内酯KPL转化为DPL的过程中利用辅酶再生体系，通过将NADP+转化为NADPH，使得NADPH在体系中浓度相对稳定，转化能够高效进行。本方法具有专一性强、产物光学纯度高、有效控制KPL水解等优点，采用本方法制备DPL，添加LPL 200mM，36小时转化率达96.4％且没有KPL水解。
(四)附图说明
图1为L-泛解酸内酯脱氢酶RhoLPLDH、共轭聚酮还原酶CglCPR和葡萄糖脱氢酶EsGDH三酶偶联催化L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯的反应示意图。
图2为不同组合的三酶共表达重组菌示意图。
图3为三酶共表达重组菌催化性能的比较。
图4为三酶共表达重组菌催化200mM L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯反应进程图；1为50g/L Strain2，2为50g/L Strain1，3为100g/L Strain1。
图5为三酶共表达重组菌催化不同浓度L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯反应进程图；1为200mM底物，2为250mM底物，3为300mM底物，4为400mM底物。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：
实施例1：L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体感受态的制备
1、出发菌株：
以实验室保藏工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDH、E.coliBL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDHL254I/V241I、E.coliBL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDHL254I/V241I/I156L、E.coliBL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDHL254I/V241I/V308L、E.coliBL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDHL254I /V241I/I156L/F224H(突变体RhoLPLDHL254I/V241I/I156L的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，突变体RhoLPLDHL254I/V241I/I156L/V308L的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，突变体RhoLPLDHL254I /V241I/I156L/F224H的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，突变体RhoLPLDHL254I/V241I的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，构建方法参考CN 113564136A)为原始菌株，活化并制备化学感受态。
实施例2：CglCPR与GDH共表达质粒的构建及转化
1、CglCPR单表达质粒的构建
以菌株E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-mcs2-CglCPR中载体pACYCDuet1-mcs2-CglCPR为模板，设计表达CglCPR的目的基因片段扩增引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。以pACYCDuet1、pCDFDuet1和pETDuet1质粒为模板，分别设计多克隆位点1(mcs1)和多克隆位点2(mcs2)的载体扩增引物，进行PCR。
PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，1μL DNA聚合酶Phanta(诺唯赞，中国)和20μL超纯水。
根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1-4min)，72℃终延伸10min，16℃保温。
PCR产物消化：PCR体系中加入2μL DpnⅠ,5μL CutSmart,37℃消化1h。
PCR产物清洁回收：参照AxyPrep清洁试剂盒。用NanoDrop测定清洁PCR产物的核酸浓度。
一步克隆重组：参照诺唯赞ClonExpress II One Step Cloning Kit。
将重组产物分别通过热激转化到BL21(DE3)感受态细胞中，在含终浓度25μg/mL氯霉素或50μg/mL硫酸链霉素或50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中筛选CglCPR连接的阳性克隆子。DNA测序验证。获得pACYCDuet1、pCDFDuet1和pETDuet1不同多克隆位点连接CglCPR的重组质粒。
2、CglCPR和GDH双表达质粒的构建
以菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH中载体pET28b-GDH为模板，设计表达GDH的目的基因片段扩增引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。以pACYCDuet1-CglCPR、pCDFDuet1-CglCPR和pETDuet1-CglCPR质粒为模板，分别设计另一个空多克隆位点的载体扩增引物，进行PCR。PCR产物经消化、清洁回收后，参照诺唯赞ClonExpress II One Step Cloning Kit，将GDH的目的基因片段一步克隆重组到pACYCDuet1-CglCPR、pCDFDuet1-CglCPR和pETDuet1-CglCPR载体中，构建CglCPR和GDH双表达重组质粒。
3、三酶表达重组菌的构建
将步骤2成功构建的双酶表达重组质粒分别转化至E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDH及其突变体感受态细胞中，涂布在对应抗性的10mL LB平板培养基中，在37℃培养12-16h。菌落PCR验证表达RhoLPLDH及其突变体、CglCPR和GDH的目的基因均存在于重组菌中。成功构建的重组表达工程菌见图2。
实施例3：L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、共轭聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的诱导表达
将实施例2成功构建的重组表达工程菌，例如E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoLPLDH/pACYCDuet1-m1-CglCPR-m2-GDH分别接种到含有双抗性，例如终浓度50μg/mL卡那霉素和终浓度25μg/mL氯霉素的10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有双抗性，例如终浓度50μg/mL卡那霉素和终浓度25μg/mL氯霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，37℃、180rpm培养至OD600为0.6-0.8之间，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，菌株置于28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。
以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液或全细胞催化L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯。
实施例4：三酶重组表达工程菌催化能力的比较
将实施例3诱导表达的L-泛解酸内酯脱氢酶、共轭聚通还原酶和葡萄糖脱氢酶蛋白的湿菌体作为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，比较各重组菌催化LPL生成DPL的能力及中间产物KPL的积累情况。反应体系选择为1mL，催化剂用量菌体湿重20g/L，底物终浓度100mM，葡萄糖终浓度150mM，pH 7.5、50mM PB缓冲液为反应介质，30℃、1200rpm涡旋振荡反应1h，取反应液200μL加入50μL 6M盐酸(酸化)，加入200μL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相。乙酸乙酯样品，采用GC检测L-泛解酸内酯、酮泛解酸内酯和D-泛解酸内酯的浓度并计算三种组分的浓度百分比。经过多次催化验证，最终确定的优势重组菌分别为E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I/L254I/L156L/pACYCDuet1-m1-CglCPR-m2-GDH、E.coli BL21(DE3)/pET28b-RopDH/pACYCDuet-m1-GDH-m2-CglCPR、E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I /L254I/V308L/pACYCDuet-m1-CglCPR-m2-GDH、E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I /L254I/L156L/F224H/pACYCDuet-m1-GDH-m2-CglCPR。这四个重组菌在催化比较中，没有中间产物KPL水解，其中E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I/L254I/L156L/pACYCDuet1-m1-CglCPR-m2-GDH和E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I/L254I/L156L/F224H/pACYCDuet-m1-GDH-m2-CglCPR二个重组菌底物LPL剩余最少，生成的产物DPL最高，见图3。
实施例5：三酶共表达重组菌催化200mM L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯
以实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I/L254I/L156L/pACYCDuet1-m1-CglCPR-m2-GDH(Strain1)和E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I /L254I/L156L/F224H/pACYCDuet-m1-GDH-m2-CglCPR(Strain2)湿菌体为催化剂一锅法催化L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯。
在5mL反应体系中，菌体加入量为为50或100g/L，底物L-泛解酸内酯的投料量为200mM，葡萄糖浓度为300mM，以pH 7.0、50mM的PB缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、800rpm条件下反应，1M NaOH调节反应pH，维持pH 7.0-7.5。采用实施例5方法检测，催化结果见图4。50g/L Strain1和Strain2催化200mM LPL时，Strain1在10h完全催化底物LPL，但KPL未及时反应造成水解，使得DPL的36h的收率为81.8％。Strain2催化底物LPL的反应速度比Strain1略慢，KPL水解比Strain1更高，DPL的36h的收率为68.1％。但100g/L Strain2催化200mM LPL时，LPL的反应速度相较于50g/L催化剂用量更慢，没有中间产物KPL的水解，DPL的24h收率即达到99.3％。
实施例6：三酶共表达重组菌催化L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯
以实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-RhoDHL241I/L254I/L156L/F224H/pACYCDuet-m1-GDH-m2-CglCPR(Strain2)湿菌体为催化剂一锅法催化浓度200-400mM的L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯。
在5mL反应体系中，菌体加入量为为100g/L，底物L-泛解酸内酯的投料量为200，250，300和400mM，葡萄糖浓度为底物的1.5倍，以pH 7.0、50mM的PB缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、800rpm条件下反应，1M NaOH调节反应pH，维持pH 7.0-7.5。采用实施例5方法检测，催化结果见图5。Strain2催化200mM LPL时，于实施例5相比LPL的反应速度下降，36h时LPL剩余4.0％，没有KPL水解，DPL收率为96.4％。随着底物浓度的升高，整体催化能力减弱，LPL剩余增多，KPL水解增多，终产物DPL收率降低。总体来看，Strain2催化200mM LPL构象反转获得最高收率的DPL。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.源自Rhodococcus hoagii的L-泛解酸内酯脱氢酶，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第156位、第224位、第241位、第254位进行单突变或多点联合突变获得。
3.如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第156位异亮氨酸突变为亮氨酸；(2)第224位苯丙氨酸突变为组氨酸；(3)第241位缬氨酸突变为异亮氨酸；(4)第254位亮氨酸突变为异亮氨酸。
4.如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5～7之一所示。
5.编码权利要求1或2所述的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体的基因。
6.含有权利要求5所述的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体编码基因的重组载体。
7.含有权利要求5所述的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体编码基因的基因工程菌。
8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体与共轭聚酮还原酶CglCPR和葡萄糖脱氢酶GDH三酶共表达工程菌，按如下方法构建获得：将含有L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体编码基因的pET28b(+)的重组质粒与双连接CglCPR和GDH的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选双抗性三酶重组共表达工程菌；所述共轭聚酮还原酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.权利要求1或2所述L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体在微生物催化L-泛解酸内酯制备酮基泛解酸内酯中的应用。
10.权利要求1或2所述L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体在微生物催化制备D-泛解酸内酯中的应用。
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