KR101183001B1 - 보효소 합성 강화에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법 - Google Patents

보효소 합성 강화에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법 Download PDF

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Abstract

미생물 내의 nadR 유전자를 결실, 변이, 혹은 치환시키거나, 또는, 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 도입하는 것에 의해, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 향상시킨 미생물을 이용하여 히드록시카르복실산을 생산한다.

Description

보효소 합성 강화에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법{METHOD FOR PRODUCING HYDROXYCARBOXYLIC ACID BY ENHANCING SYNTHESIS OF COENZYME}
본 발명은, 글리콜산을 비롯하여 히드록시카르복실산을 생산하는 미생물과, 미생물을 이용한 글리콜산을 비롯하여 히드록시카르복실산의 생산방법에 관한 것이다.
히드록시카르복실산류는 폴리머 원료나 의약 중간체로서 유용하여, 그 효율적인 생산방법이 요구되고 있다.
그 일례로서 글리콜산(α-히드록시아세트산)을 들 수 있다. 글리콜산은, 세정제나 화장품 원료로서 이용되어 왔지만, 최근, 가스배리어성 폴리머나 의료용 폴리머로서 유용한 폴리글리콜산의 원료로서 주목받고 있다. 가스배리어성 재료로서 주목받고 있는 이유는 폴리글리콜산 층이 높은 산소 가스배리어성을 가지고 있고, 산소의 존재하에서 변질되기 쉬운 식품이나 탄산 음료를 포장하기 위한 재료로서의 성능을 갖추고 있기 때문이다.
현행 시판되고 있는 화학합성품의 글리콜산은 적지않은 불순물(협잡물)을 포함하고 있어서, 폴리머 원료로서는 순도적으로 문제가 있다. 왜냐하면 이들의 불순물은 글리콜산의 탈수축합반응을 저해할 뿐만 아니라, 불순물의 하나인 메톡시아세 트산이 발암성이 의심되는 화합물이고, 식품이나 음료의 포장재 중에 포함되는 것이 바람직하지 않기 때문이다. 물론, 정제에 의해서 불순물을 제거하는 것은 기술적으로는 가능하지만, 실제로 그러한 정제품은 가격이 높아져서, 염가인 포장재 원료로서는 현실적이지 않다.
화학합성품의 글리콜산에서 볼 수 있는 상기의 문제점을 회피하기 위해, 에틸렌글리콜을 원료로 한 바이오법에 의한 글리콜산 제조의 시도가 실시되고 있다.
특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에 있어서, 에틸렌글리콜 함유 배지에, 피키아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 크루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 토룰로프시스(Torulopsis)속에 속하는 효모, 노카르디아(Nocardia)속에 속하는 균주, 로도코쿠스(Rhodococcus)속에 속하는 균주, 또는 에스케리치아?콜라이 B(Escherichia coli B)주(株)를 배양하고, 배양액 중으로부터 글리콜산을 분리ㆍ채취하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 글리콜산의 생산방법이 개시되어 있다.
특허 문헌 1 및 특허 문헌 2의 실시예에 기재되어 있는 글리콜산 생산방법 중에서 글리콜산 축적 농도가 가장 높은 것은, 피키아ㆍ나가니시이(Pichia naganishii)를 이용한 방법이고, 30시간의 반응으로 35.3g/L의 글리콜산이 얻어지고 있다. 피키아ㆍ나가니시이를 이용한 글리콜산 생산에 대해서는, 반응 조건이 더욱 개선되어, 120시간의 반응으로 105g/L의 글리콜산이 얻어지는 것이 비특허문헌 1에서 보고되어 있다.
특허 문헌 3에 있어서는 락토알데히드 리덕타아제를 코드하는 유전자와 락토 알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 플라스미드의 형태로 도입하는 것으로 이들 효소활성이 부여 또는 강화된 미생물을 이용하는 것에 의해, 에틸렌글리콜을 비롯한 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올을 원료로서, 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산을 생산하는 것이 가능한 것, 또한 미생물이 가지고 있는 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자를 파괴하여 상기 효소활성을 불활성화시키는 것에 의해 글리콜산의 생산력이 향상하는 것이 개시되어 있다.
상기한 종래의 방법에 의해 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산의 생산반응에 있어서는 반응에 제공하는 균체량이 많기 때문에, 그에 따른 제조원가의 상승이나 균체에서 유래하는 불순물의 협잡, 또한 히드록시카르복실산류의 제조 후에 균체를 폐기하는데 큰 노력과 비용이 든다는 문제점을 들 수 있다.
미생물에 있어서의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 생합성경로는, 아스파라긴산으로부터 퀴놀린산을 경유하여 생합성되는 경로(de novo 경로)와, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 등의 대사에 의해 생기는 니코틴아미드를 리사이클하는 경로(리사이클 경로)가 존재하고, 에스케리치아(Escherichia)속, 시겔라(Shigella)속, 살모넬라(Salmonella)속, 에르위니아(Erwinia)속, 예르시니아(Yersinia)속, 포토랍두스(Photorhabdus)속을 비롯한 장내세균에 있어서의 이들 생합성경로는, nadR(문헌에 따라서는 nadI로 불리기도 한다) 유전자가 코드하는 단백질(이하 NadR로 기재한다)에 의해 제어되고 있는 것이 공지되어 있다. 즉, NadR은 아스파라긴산으로부터의 de novo 경로 상의 L-아스파라긴산 옥시다아제 유전자와 퀴놀린산 신타아제(synthase) 유전자, 및 리사이클 경로 상의 니코틴산포스포리 보실 트랜스퍼라아제 유전자(이하 pncB라 한다)의 발현을 억제하는 것임이 공지되어 있다.
한편, NadR은 다기능 단백질이며, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생합성에 있어서 중요한 이하의 기능까지도 가지고 있다. 즉, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 전구체로 이루어지는 니코틴아미드모노뉴클레오티드의 수송, 또한 ATP와 니코틴산 리보뉴클레오티드로부터 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 전구체인 디아미드니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 생성하는 반응을 촉매하는 효소, 니코틴아미드모노뉴클레오티드아데닐 트랜스퍼라아제로서의 기능도 가지고 있는 것이 밝혀져 있다.
유전자 nadR를 파괴한 미생물은, 비특허문헌 2에 이미 보고되어 있지만, 이러한 미생물에 의한 히드록시카르복실산의 생산은 보고되어 있지 않다.
비특허문헌 3에 있어서는, 에스케리치아ㆍ콜라이에 pncB의 발현벡터를 도입하는 것으로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량이 향상하는 것이 보고되어 있다.
특허 문헌 1: 일본 특허공개공보 평10-174593호
특허 문헌 2: 일본 특허공개공보 평10-174594호
특허 문헌 3: 국제공개팜플렛 제2005/106005호
비특허문헌 1: Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol.65(10), pp.2265-2270, (2001)
비특허문헌 2: J.Bacteriol., Vol.187(8), pp. 2774-2782, (2005)
비특허문헌 3: Metabolic Engineering, Vol. 4, pp. 238-247, (2002)
발명의 개시
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 히드록시카르복실산류를 적은 균체량으로 효율좋게 생산할 수 있는, 미생물에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법, 및 상기 생산방법에 적합한 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의검토를 거듭한 결과, 미생물을 이용하여 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 방법에 있어서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 강화한 미생물을 이용하는 것에 의해 히드록시카르복실산류를 효율좋게 제조할 수 있는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 이하의 [1]에서 [19]에 기재된 바와 같다.
[1] 미생물을 이용하여 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 제조하는 방법에 있어서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 강화한 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 히드록시카르복실산의 생산방법.
[2] 미생물이, 하기 (1) 및 (2) 중 적어도 하나의 유전자 조작을 실시하는 것에 의해 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 강화한 미생물인 것을 특징으로 하는 [1]의 생산방법.
(1) 미생물 내의 nadR 유전자를 결실, 변이, 또는 치환시키는 것.
(2) 미생물 내의 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자를 조입한 플라스미드를 미생물에 도입하는 것.
[3] 미생물이, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력을 강화한 미생물인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 생산방법.
[4] 미생물이, NADH 디히드로게나아제의 유전자를 조입(짜넣은)한 플라스미드를 도입하는 것에 의해 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력을 강화한 미생물인 것을 특징으로 하는 [3]의 생산방법.
[5] 미생물이, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제 중 적어도 하나의 효소활성을 강화한 미생물인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 생산방법.
[6] 미생물이, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제 중 적어도 하나의 효소활성을 강화한 미생물인 것을 특징으로 하는 [3]에 기재된 생산방법.
[7] 미생물이, 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감한 미생물인 것을 특징으로 하는 [1], [3], [5] 또는 [6]에 기재된 생산방법.
[8] 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올이 에틸렌글리콜이고, 히드록시카르복실산이 글리콜산인 것을 특징으로 하는 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 생산방법.
[9] 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제 중 적어도 하나인 효소활성을 강화하고, 또한, 하기 (1) 및 (2) 중 적어도 하나의 유전자 조작을 실시하는 것에 의해 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 강화한 미생물.
(1) 미생물 내의 nadR 유전자를 결실, 변이, 또는 치환시키는 것.
(2) 미생물 내의 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자를 조입한 플라스미드를 미생물에 도입하는 것.
[10] 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력을 강화한 것을 특징으로 하는 [9]에 기재된 미생물.
[11] NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화하고, 또한, 하기 (1) 및 (2) 중 적어도 하나의 유전자 조작을 실시하는 것에 의해 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 강화한 미생물.
(1) 미생물 내의 nadR 유전자를 결실, 변이, 또는 치환시키는 것.
(2) 미생물 내의 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자를 조입한 플라스미드를 미생물에 도입하는 것.
[12] 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감한 것을 특징으로 하는 [9] 또는 [10]에 기재된 미생물.
[13] 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감한 것을 특징으로 하는 [11]에 기재된 미생물.
[14] 미생물이 에스케리치아속, 시겔라속, 살모넬라속, 에르위니아속, 예르시니아속, 포토랍두스속 중 어느 하나가 [1]~[8] 중 어느 하나에 기재된 생산방법.
[15] 미생물이 에스케리치아ㆍ콜라이인 [14]에 기재된 생산방법.
[16] 미생물이 에스케리치아속, 시겔라속, 살모넬라균속, 에르위니아속, 예르시니아속, 포토랍두스속 중 어느 하나가 [9], [10], [12] 중 어느 하나에 기재된 미생물.
[17] 미생물이 에스케리치아속, 시겔라속, 살모넬라균속, 에르위니아속, 예르시니아속, 포토랍두스속 중 어느 하나가 [11] 또는 [13]에 기재된 미생물.
[18] 미생물이 에스케리치아ㆍ콜라이인 [16]에 기재된 미생물.
[19] 미생물이 에스케리치아ㆍ콜라이인 [17]에 기재된 미생물.
본 발명에 따라 히드록시카르복실산류를 적은 균체량으로 효율좋게 생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면 히드록시카르복실산류의 생산에 적합한 미생물을 제공할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 실시형태는, 히드록시카르복실산의 생산방법이다. 이 방법은, 미생물을 이용하여 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 제조하는 방법에 있어서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력을 강화한 미생물을 이용하는 것이다.
미생물은, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 능력을 본래 가지는지의 여부에 관계없이, 어떠한 수단을 이용하는 것에 의해 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 능력을 가질 수 있는 미생물이면 어떤 미생물이어도 좋다. 바람직하게는 에스케리치아(Escherichia)속, 시겔라(Shigella)속, 살모넬라(Salmonella)속, 에르위니아(Erwinia)속, 예르시니아(Yersinia)속, 포토랍두스(Photorhabdus)속에 속하는 미생물 등이 예시되고, 보다 바람직하게는 에스케리치아ㆍ콜라이(Escherichia coli)가 예시된다.
또한, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올이란, 탄소쇄(炭素鎖)의 말단에 수산기를 가지고, 또한 분자 내에 2개 이상의 수산기를 가지는 지방족 화합물이면 그 구조에 특별히 제한은 없지만, 그러한 화합물로서 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 글리세롤, 1,3-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올, 1,2,4-부탄트리올 등을 예시할 수 있다.
또한, 히드록시카르복실산이란, 상기한 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올 분자 내의 수산기를 가지는 말단 탄소 중 하나가 산화되어 카르복실산으로 되어 있는 것이다. 그러한 화합물로서 글리콜산, 히드록시에톡시아세트산, 글리세린산, 3-히드록시프로판산, 2-히드록시부탄산, 3-히드록시부탄산, 4-히드록시부탄산, 2,4-디히드록시부탄산 등을 예시할 수 있다.
본 실시형태에서는, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로서, 에틸렌글리콜을 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 히드록시카르복실산으로서, 글리콜산을 적합하게 사용할 수 있다.
본 실시형태에 관한 미생물은, 하기 (1) 및 (2) 중 적어도 하나의 유전자 조작을 실시하는 것에 의해 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력이 강화된다.
(1) 미생물 내의 nadR 유전자를 결실, 변이, 또는 치환시키는 것.
(2) 미생물 내의 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자를 조입한 플라스미드를 미생물에 도입하는 것.
여기서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드란, 산화형 및 환원형의 명기가 없는 한 그 모두를 지칭한다.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력이 강화되었다는 것는, 미생물 내의 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(이하 NAD로 약칭하는 경우가 있다) 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(이하 NADH로 약칭하는 경우가 있다)의 함량의 합계가, 미생물의 야생주(또는 재조합 전의 미생물)에 대해서 유의하게 향상하고 있는 상태를 지칭하고, 바람직하게는 NAD, NADH의 합계 함량이, 강화 전의 미생물의 1.2배 내지 10배이다.
또한, nadR 유전자란, 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주를 예로 하면, 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA의 전체 염기서열(GenBank accession number U00096) 중, 4625317번째의 염기로부터 4626570번째의 염기에 있어서 nadR 유전자가 코드되어 있다. 또한 살모넬라ㆍ티피뮤리움의 nadR 유전자는, GenBank accession number M85181에 의해 명확해지고 있다. 상기 미생물 이외에도 시겔라속, 에르위니아속, 예르시니아속, 포토랍두스속을 비롯한 장내세균과에 있어서 nadR 유전자가 존재하고 있는 것이 나타나고 있다(Gerasimova, AV., 등, Journal of Bioinformatics and Computational Biology, Vol. 3, pp. 1007-1019(2005)).
nadR 유전자에 대하여 결실 혹은 변이시키거나, 또는 치환시킨 미생물은, 당업자에 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 얻을 수 있다. nadR 유전자에 관하여 결실 혹은 변이시키거나, 또는 치환시킨 미생물의 일례로서 에스케리치아ㆍ콜라이 MT-11032주를 예시할 수 있다.
히드록시카르복실산의 생산방법에 있어서는, 에스케리치아ㆍ콜라이 MT-11032주를 사용하는 것이 가능하다. 에스케리치아ㆍ콜라이 MT-11032주는, nadR 유전자가 카나마이신 내성 유전자에 치환되어 있고, 또한, 후술하는 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자인 glcDEF가 테트라사이클린 내성 유전자에 치환되는 것에 의해 글리콜산옥시다아제 활성이 불활성화하고 있다. 본 균주는, FERM BP-10773의 기탁 번호로, 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1방 1고 중앙 제6의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터에, 특허 수속 상의 미생물의 기탁 등의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약에 근거하여 기탁되어 있다. 또한, 본 기탁은, 평성 18년(2006년) 2월 14일에 기탁된 FERM P-20797로부터 이관된 것이다.
여기서, 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제란, 국제생화학연합(이하, 「I.U.B.」라고 한다) 효소 위원회 보고에 준거한 효소 번호 2. 4. 2. 11로 분류되고, 니코틴산과 5-포스포리보실-1α-이인산으로부터, 니코틴산 모노뉴클레오티드를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 가리킨다.
니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자(이하, pncB로 약칭하는 것이 있다)를 조입한 플라스미드를 도입한 미생물을 이용하여, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산할 수 있다. 미생물에의 유전자의 도입에 이용되는 게놈 DNA의 조제, 플라스미드의 조제, DNA의 절단 및 연결, 형질 전환, PCR(Polymerase Chain Reaction), 프라이머로서 사용하는 올리고뉴클레오티드의 설계, 합성 등의 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 실시할 수 있다. 이들 방법은, Sambrook, J., 등, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) 등에 기재되어 있다.
또한, 본 실시형태에 관한 미생물은, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력이 강화된다. 여기서, NAD 재생능력을 강화한다는 것은, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올의 산화 반응에 의해 히드록시카르복실산을 생산할 때에 생긴 NADH를 NAD로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이, 강화 전에 비해 유의하게 향상하고 있는 상태를 의미한다. 그러한 효소로서 글루타민산디히드로게나아제, 글루코오스디히드로게나아제, NADH 옥시다아제, NADH 디히드로게나아제가 예시된다. NAD 재생능력을 강화하는 경우, 그 후의 정제 등의 공정에 있어서 부하되는 것과 같은 화합물이 증가하지 않는 것이 바람직하다. NADH를 NAD로 변환하는 반응을 촉매하는 효소로서, NADH 디히드로게나아제가 바람직하다. NADH를 NAD로 변환하는 반응을 촉매하는 효소가 에스케리치아ㆍ콜라이 유래 NADH 디히드로게나아제인 경우를 예로 하면, 그 활성이 야생주(또는 재조합 전의 미생물)에 비해 2배 이상 향상하고 있는 것이 바람직하다.
이러한 효소활성이 향상한 미생물은, 예를 들면, 상기 효소를 코드하는 유전자를 유전자재조합 기술을 이용하여 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 도입하는 방법이나, 게놈 내에 있어서 상기 효소를 코드하는 유전자의 프로모터에 변이를 도입하는 등 방법을 이용하여 만들어낼 수 있다. 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 상기 유전자를 도입하는 방법으로서는, 상기 유전자를 플라스미드의 형태로 미생물에 도입하는 것을 예시할 수 있다. 미생물에의 유전자의 도입에 사용되는 게놈 DNA의 조제, 플라스미드의 조제, DNA의 절단 및 연결, 형질전환, PCR, 프라이머로서 사용하는 올리고뉴클레오티드의 설계, 합성 등의 방법은, 당업자에 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 실시할 수 있다. 이들 방법은, 상기 Sambrook, J. 등의 문헌에 기재되어 있다.
또한, 본 실시형태에 관한 미생물은, NADH 디히드로게나아제의 유전자를 조입한 플라스미드가 도입되는 것에 의해 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력이 강화된다. 여기서, NADH 디히드로게나아제란, I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소 번호 1. 6. 5. 3, 1. 6. 99. 3, 또는 1. 6. 99. 5로 분류되고, 유비퀴논, 디메틸메나퀴논, 메나퀴논 등의 퀴논류를 전자 수용체로서 NADH로부터 NAD를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 지칭한다. 바람직하게는 I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소 번호 1. 6. 99. 3으로 분류되는 NADH 디히드로게나아제이고, 에스케리치아ㆍ콜라이를 예로 하면 GenBank accession number V00306에 의해 보고되어 있는 ndh 유전자에 코드되어 있는 NADH 디히드로게나아제가 예시된다.
본 실시형태에 있어서는, NADH 디히드로게나아제의 유전자를 조입한 플라스미드를 도입한 미생물을 이용하여, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산할 수 있다. 필요로 하는 플라스미드의 구축이나 미생물에의 도입은 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 실시할 수 있다.
또한, 본 실시형태에 관한 미생물은, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제 중 적어도 하나의 효소활성이 강화된다. 여기서, 락토알데히드 리덕타아제란, I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소번호 1. 1. 1. 77로 분류되고, 1.2-프로판디올로부터, 보효소인 NAD의 존재하에서 락토알데히드를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 가리킨다.
또한, 락토알데히드 디히드로게나아제란, I.U.B.효소 위원회 보고에 준거한 효소 번호 1. 2. 1. 22로 분류되고, 락토알데히드로부터, 보효소인 NAD의 존재하에서 젖산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 총칭을 지칭하고, 한편 I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소 번호 1. 2. 1. 21로 분류되고, 글리콜알데히드로부터, 보효소인 NAD의 존재하에서 글리콜산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소 글리콜알데히드 디히드로게나아제의 총칭도 아울러 지칭하는 것이다. 왜냐하면 대장균을 이용한 선행문헌에서, 락토알데히드 디히드로게나아제와 글리콜알데히드 디히드로게나아제는 동일한 효소인 것으로 보고되어 있기 때문이다(Caballero, E., 등, J. Biol. Chem., Vol. 258, pp. 7788-7792(1983)).
또한, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제 중 적어도 하나의 효소활성을 강화한 것은, 대장균을 예로 하면, 이들 효소 중 적어도 하나의 효소활성이, 야생주(또는 재조합 전의 미생물)의 20배 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100배 이상이다. 이러한 효소활성이 향상된 미생물은, 예를 들면, 상기 효소를 코드하는 유전자를 유전자재조합 기술을 이용하여 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 도입하는 방법이나, 게놈 내에 있어서 상기 효소를 코드하는 유전자의 프로모터에 변이를 도입하는 등의 방법을 이용하여 만들어낼 수 있다. 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 상기 유전자를 도입하는 방법으로서는, 상기 유전자를 플라스미드의 형태로 미생물에 도입하는 것을 예시할 수 있다. 미생물에의 유전자의 도입에 사용되는 게놈 DNA의 조제, 플라스미드의 조제, DNA의 절단 및 연결, 형질전환, PCR, 프라이머로서 사용하는 올리고뉴클레오티드의 설계, 합성 등의 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 실시할 수 있다. 이들 방법은, 상기 Sambrook, J. 등의 문헌에 기재되어 있다.
예를 들어, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 효소활성이 향상된 에스케리치아ㆍ콜라이는, 이하와 같이 제작할 수 있다.
에스케리치아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제의 유전자(이하, fucO로 약칭하는 경우가 있다)의 염기서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number M31059). 또한, 에스케리치아ㆍ콜라이의 락토알데히드 디히드로게나아제의 유전자(이하, aldA로 약칭하는 경우가 있다)의 염기서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number M64541).
fucO를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소로 소화하는 것에 의해 fucO 프래그먼트를 얻는다.
또한, aldA를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소로 소화하는 것에 의해 aldA 프래그먼트를 얻는다.
또한, 글리세르알데히드 3-인산탈수소효소(GAPDH) 프로모터를 취득하기 위해 에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소로 소화하는 것에 의해 GAPDH 프로모터를 코드하는 DNA 프래그먼트를 얻는다.
상기의 3개의 DNA 프래그먼트와, 플라스미드를 제한효소로 소화하는 것에 의해 얻어지는 프래그먼트를 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이로 형질전환하여, LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻는다. 얻어진 콜로니를 LB 액체배지에 배양하고, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수한다. 본 플라스미드를 임의의 숙주 에스케리치아ㆍ콜라이에 도입하는 것으로 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 효소활성을 향상한 에스케리치아ㆍ콜라이를 제작할 수 있다.
본 실시형태에 관한 미생물은, 글리콜산옥시다아제 활성이 불활성화되거나 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감된다.
여기서, 글리콜산옥시다아제란, I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소 번호 1. 1. 3. 15로 분류되고, 글리콜산으로부터 글리옥실산을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 지칭한다.
글리콜산옥시다아제 활성의 불활성화란, 그 효소활성을 완전히 소실하는 것을 의미한다. 또한, 글리콜산옥시다아제 활성의 저감이란, 그 효소활성의 일부가 소실하는 것을 의미하고, 야생주(또는 재조합 전의 미생물)가 가지는 미생물 본래의 글리콜산옥시다아제 활성에 대하여, 2분의 1 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10분의 1 이하이다. 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화, 혹은 저감하는 데에는, 그 단백질을 코드하는 유전자(이하 glcDEF 유전자로 약칭하는 경우가 있다)에 변이를 도입하거나, 결실시키거나, 혹은 그 단백질을 특이적으로 불활성화하는 약제를 첨가하는, 자외선을 조사하는, 등의 방법이 있다. 유전자에의 변이 도입이나 결실을 한 유전자 조작에 대해서는, 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 실시할 수 있다. 구체적으로는, 에스케리치아ㆍ콜라이 MT-11032주가, glcDEF 유전자를 테트라사이클린 내성 유전자로 치환하는 것으로, 그 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화한 미생물로서 예시할 수 있다.
본 실시형태에 있어서, 어떤 표적 효소를 코드하는 유전자를 미생물에 도입하는 데에 있어서의 「플라스미드의 형태로」란, 상기 유전자를 벡터에 연결하여 재조합 플라스미드를 작성하고, 이를 형질 전환 등의 방법으로 상기 미생물에 도입하는 것을 의미한다.
또한, 항상적으로 미생물 내에서 기능하는 강력 프로모터와 목적 유전자를 기능적으로 연결했을 때에는, 플라스미드가 가지는 레플리콘의 성질에 의해, 미생물 세포 당 카피수가 일반적으로 적다고 하는 플라스미드를 이용하는 것도 본 발명의 목적을 달성할 수 있다. 그와 같은 레플리콘을 가지는 플라스미드로서 pACYC184(GenBank accession number X06403) 등을 예시할 수 있다.
본 실시형태의 생산방법을 실시할 때에는, 통상, 배지를 이용하여 미생물을 배양하여 증식시켜 필요량의 미생물균체를 얻는다.
배양에 사용되는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기이온 및 필요에 따라 그 외의 유기 미량성분을 함유하는 배지이면 특별히 제한은 없다. 탄소원으로서는, 글루코오스, 프럭토오스(fructose), 당밀 등의 당류, 푸말산, 구연산, 숙신산 등의 유기산, 메탄올, 에탄올, 글리세롤 등의 알코올류, 그 외가 적당히 사용된다. 질소원으로서는, 유기암모늄염, 무기암모늄염, 암모니아가스, 암모니아수, 단백질 가수분해물 등의 무기 및 유기의 질소원, 그 외가 적당히 사용된다. 무기이온으로서는, 마그네슘이온, 인산이온, 칼륨이온, 철이온, 망간이온, 황산이온, 그 외가 필요에 따라 적당히 사용된다. 유기 미량성분으로서는, 비타민, 아미노산 등 및 이들을 함유하는 효모 엑기스, 펩톤, 옥수수 침지액(Corn Steep Liquor), 카세인 분해물, 그 외가 적당히 사용된다.
배양에 사용되는 배지로서는, 공업적 생산에 제공하는 점을 고려하면 액체배지가 바람직하다.
또한, 배지조성은, 폴리펩톤 0.5g/L 이상 10g/L 이하, Fe2SO4 0.02g/L 이상 0.3g/L 이하, K2HPO4 0.5g/L 이상 5g/L 이하, KH2PO4 0.5g/L 이상 5g/L 이하, MgSO4?7H2O 0.5g/L 이상 5g/L 이하, (NH4)2SO4 0.3g/L 이상 15g/L 이하(용매는 물)로 하면 바람직하다.
본 실시형태에 관한 미생물의 배양시에, 배양 조건은 특별한 제한은 없고, pH와 온도를 적절히 제어하면서 배양한다. 호기 조건에 있어서도, 혐기 조건에 있어서도 좋지만, 바람직하게는, 호기 조건으로 한다. 통기량은, 배지 1L 당 0.2L/min 이상 3L/min 이하이면 바람직하고, 0.5L/min 이상 2L/min 이하이면 보다 바람직하다. 또한, 교반속도는, 200rpm 이상 1000rpm 이하이면 바람직하고, 500rpm 이상 800rpm 이하이면 보다 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 균체 중량 당 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다. 또한, 상기의 통기, 교반 조건과 상당하는 용존산소 공급을 실현할 수 있는 기포탑 등을 사용하는 것으로도 배양이 가능하다.
pH는 5 이상 8 이하로 하는 것이 바람직하고, pH7.0 이상 7.4 이하이면 보다 바람직하고, pH7.2로 하면 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 균체 중량 당 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다.
또한, 온도는, 25℃ 이상 40℃ 이하로 하는 것이 바람직하고, 33℃ 이상 37℃ 이하이면 보다 바람직하고, 35℃로 하면 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것으로, 균체 중량 당 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다.
배양에 필요한 시간은 12시간 이상 50시간 이하로 한다. 이것에 의해, 균체 중량 당 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다.
본 실시형태의 생산방법에 사용되는 용매로서는, 인산칼륨 완충액 등의 완충액이나, 상술한 미생물의 배양에 사용한 배지, 및 순수를 예시할 수 있다. 또한, 원료의 지방족 다가알코올과 용매와의 혼합액에, 먼저 배양에 의해 얻어진 미생물균체를 접촉시켜 반응을 실시할 수 있다. 미생물균체는, 배양이 끝난 배양액 자체를 사용하는 방법이나, 배양액으로부터 균체만을 회수하여 사용하는 방법을 예시할 수 있다.
본 실시형태의 생산방법에 있어서의 반응시에, 반응 조건은 특별한 제한은 없고, pH와 온도를 적절히 제어하면서 반응한다.
예를 들면, pH는 6 이상 9 이하이면 바람직하고, pH7.0 이상 8.0 이하이면 보다 바람직하고, pH7.2이면 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것으로, 반응액에 첨가한 균체량 당 히드록시카르복실산 생산량을 높일 수 있는 효과가 얻어진다.
또한, 온도는, 20℃ 이상 45℃ 이하의 범위 내가 바람직하고, 30℃ 이상 40℃ 이하이면 특히 바람직하고, 35℃가 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 반응액에 첨가한 균체량 당 히드록시카르복실산 생산량을 높일 수 있는 효과가 얻어진다.
또한, 반응은, 바람직하게는, 호기 조건으로 한다. 통기량은, 반응액 1L 당 0.1L/min 이상 2.0L/min 이하이면 바람직하고, 0.2L/min 이상 1.0L/min 이하이면 보다 바람직하다. 또한, 교반 속도는, 200rpm 이상 1000rpm 이하이면 바람직하고, 400rpm 이상 800rpm 이하이면 보다 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 반응액에 첨가한 균체량 당 히드록시카르복실산 생산량을 높일 수 있는 효과가 얻어진다. 또한, 상기의 통기, 교반 조건과 상당하는 용존산소 공급을 실현할 수 있는 기포탑 등을 이용하는 것으로도 반응이 가능하다.
또한, 반응 시간은 12시간 이상 96시간 이하로 하는 것에 의해, 수율 80% 이상으로 히드록시카르복실산을 얻을 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어진 반응액 중에 축적한 생산물인 히드록시카르복실산을 회수하는 방법으로서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 반응액으로부터 균체를 원심분리 등으로 제거한 후, 합성 흡착 수지를 이용하는 방법이나 침전제를 사용하는 방법, 그 외 통상의 채취 분리 방법으로 분리하는 방법을 채용할 수 있다.
상술한 목적, 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은, 이하에 서술하는 바람직한 실시형태, 및 그에 부수하는 이하의 도면에 의해서 더 명확하게 된다.
[도 1] 참고예 3에 있어서의 세포내의 NADH/NAD비(NADH 함량/NAD 함량)의
경시변화를 나타낸 그래프이다. 도면 중의 □는 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주의 NADH/NAD비를 나타낸다. 도면 중 ○는, △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 NADH/NAD비를 나타낸다.
[도 2] 실시예 9에 있어서의 글리콜산 축적량의 경시변화를 나타낸 그래프이다. 도면 중 ○는 30℃에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중의 □는 35℃에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중의 △는 37℃에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중의 ×는 40℃에서의 반응 결과를 나타낸다.
[도 3] 실시예 10에 있어서의 글리콜산 축적량의 경시변화를 나타낸 그래프이다. 도면 중 ○는 pH7.7에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중 △는 pH7.2에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중 □는 pH6.5에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중 ×는 pH6.0에서의 반응 결과를 나타낸다. 도면 중 ◇은 pH4.3에서의 반응 결과를 나타낸다.
(제조예 1) 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655nadR 결실주의 제작
에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA의 전체 염기서열은, GenBank accession number U00096에 공지되고, 상기 염기서열에 있어서 4625317번째의 염기로부터 4626570번째의 염기에 nadR 유전자가 코드되어 있다. 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA의 nadR 유전자 근방 영역의 유전자 정보에 근거하여 작성된, 서열번호 1(AGGAAGTGCCATTCTGATTGG) 및 서열번호 2(GGAATTCGTATATCTCATTATAAGTCGTCG) 및 서열번호 3(GGAATTCGTGATGAAACTGCTCAAAGG) 및 서열번호 4(TTGGTACCTGATGACCTGAGCTTCTCG)로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 하여 PCR을 실시했다. 얻어진 DNA 프래그먼트를 각각, 제한효소 NdeI와 EcoRI, EcoRI와 KpnI로 소화하는 것에 의해, 각각 약 850bp, 970bp의 프래그먼트를 얻었다.
이 DNA 프래그먼트를, 온도 감수성 클로닝 벡터-pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)(Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191(2000))을 NdeI, KpnI로 소화하여 얻어지는 프래그먼트와 혼합하고, 리가아제를 사용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이DH5α주(토요방적사 제)로 형질전환하여, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 30℃에서 생육하는 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 액체배지에서, 30℃에서 하룻밤 배양하고, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수했다. 회수한 플라스미드를 EcoRI로 소화하고, pUC4K 플라스미드(GenBank accession number X06404)(Pharmacia)를 EcoRI로 소화하는 것에 의해 얻어지는 카나마이신 내성 유전자와 리가아제를 사용 하여 연결했다.
이렇게 하여 얻어진 플라스미드를 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주에 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10㎍/ml와 카나마이신 50㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 30℃에서 하룻밤 배양하여, 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체를 카나마이신 50㎍/ml를 포함하는 LB 액체배지에 접종하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 이어서 이들 배양균체가 얻어지도록 카나마이신 50㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도포하고, 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를 카나마이신 50㎍/ml를 포함하는 LB 액체배지에, 30℃에서 하룻밤 배양하고, 한번 더 카나마이신 50㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도포하여 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다.
출현한 콜로니중에서 무작위로 100콜로니를 픽업하고, 각각을 카나마이신 50㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트와, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육시켜, 카나마이신을 포함하는 LB 한천 플레이트에만 생육하는 클로람페니콜 감수성의 클론을 선택했다. 또한, 이들 목적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해, 야생주MG1655에 있어서는 nadR 유전자를 포함하는 nadR 유전자 근방 영역의 약 3.3kbp 단편을 증폭시키고, 증폭한 단편에 대해서, nadR 유전자에는 그 인식 서열이 존재하지 않고, 카나마이신 내성 유전자에는 그 인식 서열이 존재하는 제한효소 HindIII로 처리하는 것으로, nadR 유전자가 카나마이신 내성 유전자에 치환되어 있는 주를 선발하고, 얻어진 주를 MG1655nadR 유전자 결실 주(이하 △nadR주로 약칭하는 경우가 있다)라고 명명했다.
또한 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에서 입수할 수 있다.
(제조예 2) 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655glcDEF 결실주의 제작
에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA의 전체 염기서열은 공지되어 있고(GenBank accession number U00096), 에스케리치아ㆍ콜라이의 글리콜산옥시다아제의 유전자(이하, glcDEF로 약칭하는 경우가 있다)의 염기서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number L43490).
에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA의 glcDEF 근방 영역의 유전자 정보에 근거하여 작성된, 서열번호 5(TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG) 및 서열번호 6(TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG) 및 서열번호 7(GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG) 및 서열번호 8(AACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC)의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 실시했다. 얻어진 DNA 프래그먼트를 각각, 제한효소 KpnI와 XbaI, XbaI와 PstI로 소화하는 것에 의해, 각각 약 670bp, 790bp의 프래그먼트를 얻었다. 이 DNA 프래그먼트를, 온도 감수성 클로닝 벡터-pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)(Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191(2000))을 KpnI, PstI로 소화하여 얻어지는 프래그먼트와 혼합하고, 리가아제를 사용하여 결합한 후, DH5α주에 30℃에서 형질전환하여, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻었다.
얻어진 콜로니를, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 액체배지에서, 30℃에서 하룻밤 배양하여, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수했다. 회수한 플라스 미드를 XbaI로 소화하고, T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단처리를 실시했다. 트랜스포존 Tn10(GenBank accession number J01830)을 템플릿으로 하고, 서열번호 9(CAGCTGACTCGACATCTTGGTTACCG)와 서열번호 10(CAGCTGCAAGAGGGTCATTATATTTCG)의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR을 실시하고 테트라사이클린 내성 유전자를 얻고, 이 DNA 단편을 T4 DNA 폴리뉴클레오티드키나아제 처리하고, 먼저 평활 말단 처리한 플라스미드와 연결했다.
얻어진 플라스미드를 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주에 30℃에서 형질전환하여, 클로람페니콜 10㎍/ml와 테트라사이클린 30㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에서 30℃에서 하룻밤 배양하여, 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체를 테트라사이클린 30㎍/ml를 포함하는 LB 액체배지에 접종하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 이어서 이들 배양균체가 얻어지도록 테트라사이클린 30㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도포하여, 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를 테트라사이클린 30㎍/ml를 포함하는 LB 액체배지에서, 30℃에서 하룻밤 배양하고, 또 한번 테트라사이클린 30㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도포하여 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다.
출현한 콜로니 중에서 무작위로 100콜로니를 픽업하여, 각각을 테트라사이클린 30㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트와, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육시켜, 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천 플레이트에만 생육하는 클로람페니콜 감수성의 클론을 선택했다. 또한 이들 목적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해, glcDEF를 포함하는 glcDEF 근방 영역을 증폭시켰다.
이 PCR에 의해서, 야생주MG1655주를 비롯한 glcDEF가 테트라사이클린 내성 유전자에 치환되어 있지 않은 주에 있어서는 약 4.0kbp 단편이 증폭되는 한편, glcDEF 영역이 테트라사이클린 내성 유전자에 치환된 주에 있어서는 약 2.2kbp 단편이 증폭된다. PCR에 의해서 약 2.2kbp 단편이 증폭된 주를 선발하여 MG1655glcDEF 결실주(이하 △glcDEF주로 약칭하는 경우가 있다)라고 명명했다.
(제조예 3) 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655nadR&glcDEF 결실주의 제작
제조예 1에서 얻어진 △nadR주에 대해서, 제조예 2와 동일하게 하여 glcDEF를 결실시켰다. 얻어진 주를 MG1655nadR&glcDEF 결실주(이하 △nadR△glcDEF주로 약칭하는 경우가 있다)라고 명명했다.
(제조예 4) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제 동시 발현 벡터의 구축
에스케리치아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제의 유전자(이하, fucO로 약칭하는 경우가 있다)의 염기서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number M31059). 또한 에스케리치아ㆍ콜라이의 락토알데히드 디히드로게나아제의 유전자(이하, aldA로 약칭하는 경우가 있다)의 염기서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number M64541).
fucO를 취득하기 위해서, 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하고, 서열번호 11(GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG) 및 서열번호 12(GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG)로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 XbaI 및 HindIII 로 소화하는 것에 의해 약 1.2kbp의 fucO 프래그먼트를 얻었다.
aldA를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하고, 서열번호 13(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC) 및 서열번호 14(GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG)로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 EcoRI 및 XbaI로 소화하는 것에 의해 약 1.5kbp의 aldA 프래그먼트를 얻었다.
또한, 글리세르알데히드 3-인산탈수소효소(GAPDH) 프로모터를 취득하기 위해 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하고, 서열번호 15(AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC) 및 서열번호 16(ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG)으로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 EcoRI로 소화하는 것에 의해 약 100bp의 GAPDH 프로모터를 코드하는 DNA 프래그먼트를 얻었다.
상기의 3개의 DNA 프래그먼트와, 플라스미드 pUC18(토요방적사 제)를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 소화하는 것에 의해 얻어지는 프래그먼트를, 리가아제를 사용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이DH5α주(토요방적사 제)로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지에, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하고, 이 플라스미드를 pGAPfucO-aldA라고 명명했다.
(실시예 1) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제 동시 발현 벡터에 의한 △nadR△glcDEF주 형질 전환체의 구축
제조예 4에서 얻어진 플라스미드 pGAPfucO-aldA를 제조예 3에서 얻어진 △nadR△glcDEF주로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주를 얻었다.
(제조예 5) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제 동시 발현 벡터에 의한 △glcDEF주 형질 전환체의 구축
제조예 4에서 얻어진 플라스미드 pGAPfucO-aldA를 제조예 2에서 얻어진 △glcDEF주로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주를 얻었다.
(실시예 2) △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 의한 글리콜산 생산
실시예 1에서 얻어진 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주를 전 배양으로서 삼각 플라스크에 넣은 LB Broth, Miller 배양액(Difco244620) 25mL에 식균하고, 하룻밤 동안, 배양 온도 35℃, 120rpm에서 교반 배양을 실시했다. 전 배양액 전량을, 이하에 나타내는 조성의 배지 475g이 들어간 1L용적의 배양조(ABLE사 제 배양 장치 BMJ-01)로 옮겨, 배양을 실시했다. 배양은 대기압하, 통기량 0.5L/min, 교반속도 800rpm, 배양 온도 35℃, pH7.2(NH3 수용액으로 조정)에서 실시했다. 상기의 조건으로 최초의 글루코오스가 완전히 고갈한 후, 나머지의 시간을 배지 중의 글루코오스 농도 0.1g/L 미만이 되는 가변속도로 글루코오스를 전량으로 40g 공급했다.
<배양지 조성>
폴리펩톤: 7g/L
글루코오스: 30g/L
Fe2SO4: 0.09g/L
K2HPO4: 2g/L
KH2PO4: 2g/L
MgSO4?7H2O: 2g/L
(NH4)2SO4: 5g/L
용매: 물
배양개시 후 24시간의 균체를 원심분리(8000rpm, 20분간)에 의해 집균했다. 집균 후의 습균체를 4.5g 칭량하고, 에틸렌글리콜 65g과 함께 증류수에 현탁하여 최종액량을 500ml로 했다. 현탁액을 ABLE사 제 배양 장치 BMJ-01의 배양조로 옮겨 70시간 반응을 실시했다. 반응은 대기압하, 통기량 0.25L/min, 교반속도 550rpm, 반응 온도 35℃, pH7.2(NH3 수용액으로 조정)에서 실시했다. 얻어진 반응액 중의 글리콜산 축적량을, 히다치제작소 제 고속액체크로마토그래피를 이용하여, 이하의 설정에서 정량했다.
컬럼: ULTRON PS-80H(노부카즈화공사 제)
용리액: 과염소산 수용액(pH2.1)
유속: 1.0mL/min
검출기: UV 검출기
측정 파장: 280nm
또한, 습균체의 일부를 50℃에서 건조시킨 후의 건조 중량으로부터, 반응에 사용한 균체의 건조균체중량을 구했다.
△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 건조균체 1g 당 글리콜산 생산량은 27.1 g이었다.
또한, △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 생육 속도는, 비교예 1에 있어서의 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주와 같은 것이고, nadR 유전자의 파괴에 의한 생육의 지연이 일어나지 않은 것이 확인되었다.
(비교예 1)△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 의한 글리콜산 생산
제조예 5에서 얻어진 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 대해 실시예 2와 동일하게 배양 및 글리콜산 생산을 실시했다. △glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 건조균체 1g 당 글리콜산 생산량은 20.2g이었다.
(참고예 1) △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주,△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 있어서의 세포내 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 함량의 측정
△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주, 및 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주를 실시예 2와 동일하게 배양했다.
배양개시 후 24시간의 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주 및 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주 각각을 2개의 미량 원심관에 1mL씩 샘플링하고, 4℃에서 원심, 집균했다. 2개의 원심관 중 1개를 NAD 측정, 1개를 NADH 측정에 사용하고, 각각 이하의 처리를 실시했다.
NAD 측정용의 샘플에는, 집균한 습균체 1.5mg 당 400μL의 0.04mol/L의 염산 수용액을 가하여 현탁했다. 현탁액을 90℃에서 3분 가열 후, 빙상에서 급냉했다. 이 처리액의 상청을 이용하여, 이하에 나타내는 조성의 반응액을 작성했다. 또한 1 mol/L Tris-HCl로서 pH9.0의 것을 이용했다. 또한 알코올디히드로게나아제로서 SIGMA사 제 알코올디히드로게나아제(A3263)를 10mmol/L의 Tris-HCl(pH8.8)로 용해하여, 400유닛/mL(단, 1유닛은 pH8.8, 25℃의 조건하, 1분간 1μmol의 에탄올을 아세트 알데히드로 변환하는데 필요한 효소량)로 한 것을 사용했다. 반응액의 450nm에 있어서의 흡광도를 테트라컬러원(TetraColor One)(생화학공업사 제)의 프로토콜에 따라 측정했다. 또한 SIGMA사 제 NAD 용액에 있어서 동일한 처리를 실시한 것을 측정하는 것에 의해 검량선을 작성하여, 샘플의 NAD 농도를 구했다.
NADH 측정용의 샘플에는, 집균한 습균체 1.5mg 당 400μL의 0.04mol/L의 수산화 칼륨 수용액을 가하여 현탁했다. 현탁액을 90℃에서 3분 가열한 후, 빙상에서 급냉했다. 이 처리액의 상청을 이용하여, 이하에 나타내는 조성의 반응액을 작성했다. 또한 1mol/L Tris-HCl로서 pH8.8의 것을 사용했다. 또한 알코올디히드로게나아제로서 SIGMA사 제 알코올디히드로게나아제(A3263)를 10mmol/L의 Tris-HCl(pH8.8)로 용해하여, 400유닛/mL(단 1유닛은 pH8.8, 25℃의 조건하, 1분간에 1μmol의 에탄올을 아세트알데히드로 변환하는데 필요한 효소량)로 한 것을 사용했다.
반응액의 450nm에 있어서의 흡광도를 테트라컬러원(생화학공업사 제)의 프로 토콜에 따라 측정했다. 또한 SIGMA사 제 NADH의 용액에 대해서, 동일한 처리를 실시하는 것을 측정하는 것에 의해 검량선을 작성하여, 샘플의 NADH 농도를 구했다.
그 결과, △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 NAD양, NADH양은, △glcDEF/pGAPfucO-aldA주와 비교하여, 각각 1.7배, 1.6배 증가하고 있었다. 이것에 의해 nadR 유전자를 결실시킨 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에서는, NAD 및 NADH, 즉 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 생산능력이 강화되고 있는 것이 확인되었다.
<반응액 조성>
샘플 상청: 25μL
1mol/L Tris-HCl: 25μL
25%에탄올: 10μL
순수: 20μL
테트라컬러원(생화학공업사 제): 10μL
알코올디히드로게나아제: 10μL
(제조예 6) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제, NADH 디히드로게나아제 동시 발현 벡터의 구축
에스케리치아ㆍ콜라이의 NADH 디히드로게나아제의 유전자(이하, ndh로 약칭하는 경우가 있다)의 염기서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number V00306).
ndh를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿 으로 이용하고, 서열번호 17(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGACTACGGCATTGAAAAAGATTGTG) 및 서열번호 18(GGTCTAGACGATTAATGCAACTTCAAACG)로 나타내는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하는 것에 의해 약 1.3kbp의 ndh 프래그먼트를 얻었다. 얻어진 ndh 프래그먼트를 T4 DNA 폴리뉴클레오티드키나아제 처리했다. 이 DNA 프래그먼트와, 제조예 4에서 작성한 pGAPfucO-aldA 플라스미드를 HindIII로 소화하여 평활 말단처리, 탈인산화 처리를 실시한 프래그먼트를 혼합하고, 리가아제를 사용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이DH5α주(토요방적사 제)로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지에서, 37℃에서 하룻밤 배양하여, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하고, 얻어진 플라스미드를 pGAPfucO-aldA-ndh라고 명명했다.
(실시예 3) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제, NADH 디히드로게나아제 동시 발현 벡터에 의한 △nadR△glcDEF주 형질 전환체의 구축
제조예 6에서 얻어진 플라스미드 pGAPfucO-aldA-ndh를 제조예 3에서 얻어진 △nadR△glcDEF주로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주를 얻었다.
(실시예 4) △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 의한 글리콜산 생산
실시예 3에서 얻어진 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 대해 실시예 2와 동일하게 배양 및 글리콜산 생산을 실시했다. 또한, 이 균주에 대해서, 실시예 2에서 배양한 결과와 비교하여 ndh를 강화하는 것에 의한 생육의 지연은 관찰되지 않았다. △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주의 건조균체 1g 당 글리콜산 생산량을, 비교예 1 및 실시예 2의 결과와 함께 표 1에 나타냈다.
비교예 1과 실시예 2의 비교에서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력의 강화에 의해, 글리콜산의 생산성은 1.3배로 향상했다.
또한, 비교예 1과 실시예 4의 비교에서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력의 강화 및 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력의 강화에 의해 글리콜산의 생산성은 3.6배로 향상했다.
[표 1]
Figure 112008083293108-pct00001
(제조예 7) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제, 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제 동시 발현 벡터의 구축
에스케리치아ㆍ콜라이의 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자(pncB)의 염기서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number J05568).
pncB를 취득하기 위해서, 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하고, 서열번호 19(CGTGCAATTGCCGGAGAAAGTCTTATGACACAATTCGCTTCTC) 및 서열번호 20(CGCTCTAGATTAACTGGCTTTTTTAATATGCG)로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하는 것에 의해 약 1.2kbp의 pncB 프래그먼트를 얻었다. 또한 얻어진 pncB 프래그먼트를 T4 DNA 폴리뉴클레오티드키나아제 처리했다. 이 DNA 프래그먼트와, 제조예 4에서 작성한 pGAPfucO-aldA 플라스미드를 HindIII로 소화 하여, 평활 말단처리, 탈인산화 처리를 실시한 프래그먼트를 혼합하고, 리가아제를 사용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이DH5α주(토요방적사 제)로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지에, 37℃에서 하룻밤 배양하여, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하여, 상기 플라스미드를 pGAPfucO-aldA-pncB라고 명명했다.
(실시예 5) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제, 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제 동시 발현 벡터에 의한 △glcDEF 형질 전환체의 구축
제조예 7에서 얻어진 플라스미드 pGAPfucO-aldA-pncB를 제조예 2에서 얻어진 △glcDEF주로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주를 얻었다.
(실시예 6)△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주에 의한 글리콜산 생산
실시예 5에서 얻어진 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주에 대해 실시예 2와 동일하게 배양 및 글리콜산 생산을 실시했다. △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주에 있어서의 건조균체 1g 당 글리콜산 생산량은 26.7g이었다. 비교예 1의 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 있어서의 건조균체 1g 당 글리콜산 양(20.2g)과 비교하여, pncB의 강화에 의해, 생산성이 1.3배로 향상하였다.
(참고예 2) △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주에 있어서의 세포내 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 함량의 측정
실시예 5에서 얻어진 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주 및 대조되는 △glcDEF/pGAPfucO-aldA에 대해서, 참고예 1과 동일하게 배양 및 세포내 NAD양, NADH양의 측정을 실시했다. 그 결과, △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주 에 있어서, NAD양, NADH양은, 각각 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 2.6배, 2.1배였다. 이것에 의해 pncB를 강화한 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB주에서는, NAD 및 NADH, 즉 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 생산능력이 강화되고 있는 것이 확인되었다.
(참고예 3) △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주, △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 있어서의 세포내 NAD 및 NADH 함량 측정
△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주, 및 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 대해서, 실시예 2와 동일하게 배양 및 글리콜산 생산을 실시했다. 글리콜산 생산시의 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주, 및 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 대해 일정시간에 있어서 샘플링을 실시하고, 참고예 1과 동일하게 세포내 NAD양, NADH양을 측정했다. 도 1은, 이 때의 NADH/NAD비(NADH 함량/NAD 함량)를 나타낸다. 횡축은 반응 시간(hr), 종축은 NADH/NAD비(NADH 함량/NAD 함량)를 나타내고 있다.
△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 있어서 항상 NADH/NAD비의 값이 적고, NADH로부터 NAD를 재생하고 있는 것이 나타났다.
(제조예 8) NADH 디히드로게나아제 발현 벡터의 구축
에스케리치아ㆍ콜라이의 NADH 디히드로게나아제의 유전자(이하, ndh로 약칭 하는 경우가 있다)의 염기서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number V00306). ndh를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하여 서열번호 17과 서열번호 21(AAAATAAGCTTCGATTAATGCAACTTCAAACG)로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 소화하는 것에 의해 약 1.3kbp의 ndh 프래그먼트를 얻었다.
상기의 DNA 프래그먼트와, 플라스미드 pUC18(토요방적사 제)를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 소화하는 것에 의해 얻어지는 프래그먼트를, 리가아제를 사용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이DH5α주(토요방적사 제)로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지로, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하고, ndh의 DNA 프래그먼트가 바르게 삽입되어 있는 것을 확인한 후, 제한효소 EcoRI로 처리하고, 또한 탈인산화 처리했다.
또한, GAPDH 프로모터를 취득하기 위해 에스케리치아ㆍ콜라이MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하고, 서열번호 15와 서열번호 16으로 나타나는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 EcoRI로 소화하는 것에 의해 약 100bp의 GAPDH 프로모터를 코드하는 DNA 프래그먼트를 얻었다. 이 DNA 프래그먼트를 상기의 EcoRI 처리, 탈인산화 처리한 플라스미드와, 리가아제를 사용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이DH5α주(토요방적사 제)로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지로, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하고, GAPDH 프로모터의 프래그먼트가 바르게 삽입되어 있는 것을 확인하고, 이 플라스미드를 pGAPndh라고 명명했다.
(실시예 7) NADH 디히드로게나아제 발현 벡터에 의한 △nadR주 형질 전환체 및 △nadR△glcDEF주 형질 전환체의 구축
제조예 1에서 얻어진 △nadR주 및 제조예 3에서 얻어진 △nadR△glcDEF를 제조예 8에서 얻어진 플라스미드 pGAPndh로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △nadR/pGAPndh주 및 △nadR△glcDEF/pGAPndh주를 얻었다.
(제조예 9) NADH 디히드로게나아제 발현 벡터에 의한 MG1655주 형질 전환체의 구축
제조예 8에서 얻어진 플라스미드 pGAPndh에 의해 대장균 야생주 MG1655주를 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해MG1655/pGAPndh주를 얻었다.
(실시예 8) △nadR/pGAPndh주, △nadR△glcDEF/pGAPndh주에 의한 글리콜산 생산
LB Broth, Miller 배양액(Difco244620)에 최종농도 0.2%가 되도록 글루코오스를 첨가한 배지 5mL를 넣은 시험관에 실시예 7에서 얻어진 △nadR/pGAPndh주, △ nadR△glcDEF/pGAPndh주 및 대조로서 △nadR주, MG1655/pGAPndh, 야생주 MG1655주를 각각 식균하고, 하룻밤, 배양 온도 37℃, 200rpm에서 교반 배양을 실시했다. 배양액 전량을 원심분리하여, 얻어진 습균체의 중량를 측정한 후, 이하에 나타내는 반응액 1ml를 작성하고, 시험관을 이용하여 30℃, 200rpm으로 교반하여, 48시간 글리콜산 생산을 실시했다.
<반응액 조성>
1mol/L 인산칼륨 완충액(pH8.0): 250μL
에틸렌글리콜: 50μL
균체: 배양액에서 회수한 전체 균체
순수로 1ml로 조정
균주 각각의 습균체 1g 당 글리콜산 생산량을 표 2에 나타냈다.
△nadR/pGAPndh주, △nadR△glcDEF/pGAPndh주에 있어서 현저하게 글리콜산의 생산성이 향상하고 있는 것이 나타났다.
[표 2]
Figure 112008083293108-pct00002
(실시예 9) △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 의한 글리콜산 생산 반응의 온도조건 검토
실시예 3에서 얻어진 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 대해 실시예 2와 동일하게 배양을 실시했다. 단, 배지 중 폴리펩톤의 농도를 1g/L로 했다. 얻어진 균체에 대해서, 실시예 2와 동일하게 글리콜산 생산 반응을 실시했다. 단 반응에 가하는 습균체량을 7g, 교반 속도를 750rpm, 반응 시간을 24시간으로 하고, 반응 온도는 30℃, 35℃, 37℃, 및 40℃의 각각의 조건으로 실시했다. 도 2는 이 때의 글리콜산 축적량을 나타낸다. 횡축은 반응 시간(hr), 종축은 글리콜산 축적량(g/L)을 나타내고 있다.
△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 의해 상기 조건에 있어서도 충분한 양의 글리콜산을 생산할 수 있음이 나타났다.
(실시예 10) △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 의한 글리콜산 생산 반응의 pH 조건검토
실시예 3에서 얻어진 △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 대해 실시예 2와 동일하게 배양을 실시했다. 단, 배지 중 폴리펩톤의 농도를 1g/L로 했다. 얻어진 균체에 대해서, 실시예 2와 동일하게 글리콜산 제조 반응을 실시했다. 단, 반응액의 pH를 pH7.7, pH7.2, pH6.5, pH6.0, pH4.3의 각각의 조건으로 제어하여 실시했다. 도 3은 이 때의 글리콜산 축적량을 나타낸다. 횡축은 반응 시간(hr), 종축은 글리콜산 축적 농도(g/L)를 나타내고 있다. △nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 의한 글리콜산 생산은 pH6.0 이상에서 가능한 것으로 나타났다.
본 발명의 히드록시카르복실산의 생산방법 및 미생물은, 폴리머 원료나 의약 중간체로서 유용한 글리콜산 등의 히드록시카르복실산류의 제조에 사용할 수 있다.
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Claims (40)

  1. 미생물을 이용하여 에틸렌글리콜로부터 글리콜산을 생산하는 방법에 있어서, 하기 (1) 및 (2)의 적어도 하나의 유전자 조작을 행하는 것에 의해 에세리히아ㆍ콜라이(Escherichia coli)의 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드 생산능을 강화한 에세리히아ㆍ콜라이를 이용하는 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
    (1) 에세리히아ㆍ콜라이 내의 nadR 유전자를 결실 또는 치환하여, 에세리히아ㆍ콜라이의 nadR 유전자가 코드하는 단백질을 결실시키는 것.
    (2) 에세리히아ㆍ콜라이 유래의 니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자를 플라스미드의 형태로 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것.
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  25. 제 1항에 있어서, 상기 에세리히아ㆍ콜라이는, 에세리히아ㆍ콜라이 내의 nadR 유전자를 결실 또는 치환하여, 에세리히아ㆍ콜라이의 nadR 유전자가 코드하는 단백질을 결실시키는 것에 의해 에세리히아ㆍ콜라이의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능을 강화한 것이고, 더욱이 NADH 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 플라스미드 형태로 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능력을 강화한 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 에세리히아ㆍ콜라이는, 에세리히아ㆍ콜라이내의 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자를 결실 또는 치환하여, 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화한 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
  27. 제 1항 또는 제 25항에 있어서, 상기 에세리히아ㆍ콜라이는, 에세리히아ㆍ콜라이내의 nadR 유전자를 결실 또는 치환하여, 에세리히아ㆍ콜라이의 nadR유전자가 코드하는 단백질을 결실시키는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능을 강화한 것이고, 락토알데히드리덕타제를 코드하는 유전자 및 락토알데히드디히드로게나제 코드하는 유전자를 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타제 및 락토알데히드디히드로게나제의 활성을 강화하고, 또한, 에세리히아ㆍ콜라이내의 글리콜산옥시다제를 코드하는 유전자를 결실 또는 치환하여, 글리콜산 옥시다제 활성을 불활성화한 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
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  30. 제 1항에 있어서, 상기 에세리히아ㆍ콜라이는, 에세리히아ㆍ콜라이 유래의 니코틴산 포스포리보실 트랜스퍼라제의 유전자를 플라스미드의 형태로 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해 에세리히아ㆍ콜라이의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능을 강화한 것이고, 또한, 에세리히아ㆍ콜라이내의 글리콜산 옥시다제를 코드하는 유전자를 결실 또는 치환하여, 에세리히아ㆍ콜라이의 글리콜산 옥시다제 활성을 불활성화하고, 더욱이, 락토알데히드 리덕타제를 코드하는 유전자 및 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 활성을 강화한 것을 특징으로 하는 생산방법.
  31. 제 27항에 있어서, 상기 에세리히아ㆍ콜라이에 있어서, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량의 합계가, 상기 에세리히아ㆍ콜라이의 야생주의 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량의 합계의 1.2배 내지 10배인 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
  32. 삭제
  33. 에세리히아ㆍ콜라이내의 nadR 유전자를 결실 또는 치환하여, 에세리히아ㆍ콜라이의 nadR 유전자가 코드하는 단백질을 결실시키는 것에 의해, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력이 강화된 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  34. 제 33항에 있어서, NADH 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, NADH 디히드로게나아제의 활성이 강화된 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  35. 제 34항에 있어서, 에세리히아ㆍ콜라이의 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자를 결실 또는 치환하여, 글리콜산옥시다아제 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  36. 제 35항에 있어서, 락토알데히드 리덕타아제를 코드하는 유전자 및 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 활성이 강화된 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  37. 제 33항에 있어서, 락토알데히드 리덕타아제를 코드하는 유전자 및 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 활성이 강화되고,
    에세리히아ㆍ콜라이내의 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자를 결실 또는 치환하여, 글리콜산옥시다아제 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  38. 락토알데히드 리덕타아제를 코드하는 유전자 및 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 활성이 강화되고,
    니코틴산포스포리보실 트랜스퍼라아제의 유전자가 플라스미드 형태로 에세리히아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 생산능력이 강화되고, 또한,
    에세리히아ㆍ콜라이내의 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자의 결실 또는 치환에 의해, 에세리히아ㆍ콜라이의 글리콜산옥시다아제 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  39. 제 36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량의 합계가, 에세리히아ㆍ콜라이의 야생주의 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량의 합계의 1.2배 내지 10배인 것을 특징으로 하는 에세리히아ㆍ콜라이.
  40. 제 30항에 있어서, 상기 에세리히아ㆍ콜라이에 있어서, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량의 합계가, 상기 에세리히아ㆍ콜라이의 야생주의 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 함량의 합계의 1.2배 내지 10배인 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
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