CN116064441A - L-泛解酸内酯脱氢酶突变体及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种L‑泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备D‑泛解酸内酯中的应用，所述突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第第28位进行饱和突变获得。本发明构建的RopLPLDH突变体工程菌RopLPLDH^A28S及其分子伴侣共表达工程菌RopLPLDH^A28S/pGro7的比酶活较对照组RopLPLDH分别提高了0.45倍和0.50倍。RopLPLDH突变体与分子伴侣共表达策略显著提高目的蛋白可溶性表达。其中共表达菌株RopLPLDH^A28S/pGro7基本能够完全催化500mM和750mM L‑泛解酸内酯。三酶共表达工程菌pA‑CglCPR/EsGDH‑pET‑RopLPLDH催化200mM底物时，产物L‑泛解酸内酯浓度随时间的推移而逐渐升高，24h时底物转化率达到95.6％。

Description

L-泛解酸内酯脱氢酶突变体及其编码基因与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备D-泛解酸内酯中的应用。

(二)背景技术

D-泛酸钙又称维生素B5，是辅酶A的组成部分，已经广泛应用于食品、饲料、医药、化工和化妆品等行业。D-(-)-泛解酸内酯，也称为(R)-泛解酸内酯，化学结构为D-(-)-泛解酸的γ-内酯，是合成D-(+)-泛酸的关键手性中间体。目前工业化合成D-泛解酸内酯采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线，从异丁醛和甲醛为起始原料出发，化学法合成DL-泛解酸内酯；其中的D-泛解酸内酯可以被D-泛解酸内酯水解酶立体选择性水解生成D-泛解酸，再经内酯化生成D-泛解酸内酯，留下的L-泛解酸内酯经化学消旋化为DL-泛解酸内酯重新循环拆分。

DL-泛解酸内酯的拆分是合成D-泛解酸内酯中的关键步骤。水解酶的手性拆分制备工艺需要L-泛解酸内酯的消旋，D-泛解酸和L-泛解酸内酯的分离以及D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯。水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，仍然存在过程复杂、能耗物耗较高、需要消耗较多的酸碱等问题。

鉴于此，开发更为直接、高效、环保的D-泛解酸内酯不对称合成方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。D-泛解酸内酯可通过氧化还原法不对称合成，该方法可通过两条不同途径实现，第一条途径先以L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸还原酶的作用下生成D-泛解酸，接着D-泛解酸在酸的作用下闭环形成D-泛解酸内酯；更为简捷的第二条途径是以混旋的DL-泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D-酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D-泛解酸内酯。

与现有的水解酶催化通路相比，第二条途径工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；因此，第二条途径的氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。该途径中L-泛解酸内酯的脱氢是其关键步骤之一，由L-泛解酸内酯脱氢酶催化。目前已知的L-泛解酸内酯脱氢酶数量不多，催化性能优异的L-泛解酸内酯脱氢酶的缺乏限制了氧化还原酶法在不对称合成D-泛解酸内酯中的应用。研究较多的L-泛解酸内酯脱氢酶包括源自红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶和源自星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶。源自红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌系统中可溶性表达较差，这一特性加大了多酶组合催化的难度。以红串红球菌L-泛解酸内酯脱氢酶基因在相同的红串红球菌中增强表达的基因工程菌AKU2103为生物催化剂，催化0.768M的L-泛解酸内酯脱氢反应144h，反应的转化率为91.9％。考虑到L-泛解酸内酯脱氢产物为酮基泛解酸内酯，酮基泛解酸内酯容易自发水解为酮基泛解酸。在上述反应144h后，需进一步添加表达了酮基泛解酸还原酶的重组大肠杆菌为生物催化剂，将产生的酮基泛解酸在还原反应24h后全部转化为D-泛解酸。最终，D-泛解酸再经酸化处理生成D-泛解酸内酯(SiD,Urano N,Nozaki S,et al.L-Pantoyllactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis:genetic analyses andapplication to the stereospecific oxidation of L-pantoyl lactone.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2012,95:431-440)。此外，源自星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶虽然有较详细地酶学性质研究(Kataoka M,Shimizu S,YamadaH.Purification and characterization of a novel FMN-dependent enzyme:membrane-bound L-(+)-pantoyl lactone dehydrogenase from Nocardia asteroides.EuropeanJournal of Biochemistry,1992,204,799-806)，而其编码基因仍不为人知，阻碍了其在生物催化中的进一步应用。

目前尚未见源自Rhodococcus opacus的L-泛解酸内酯脱氢酶的研究，也未见源自Rhodococcus opacus的L-泛解酸内酯脱氢酶用于多酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯的报道。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH对L-泛解酸内酯催化活性不高、催化剂(菌体)用量大问题，提供一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备D-泛解酸内酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第第28位进行饱和突变获得。

优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示(突变体A28S)(编码基因如SEQ ID NO.6所示)。

本发明还涉及编码所述的L-泛解酸内酯脱氢酶突变体的基因，以及含有所述的编码基因的重组载体和基因工程菌。

本发明还涉及所述L-泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化L-泛解酸内酯制备酮基泛解酸内酯中的应用。

具体的，所述应用的方法为：将含L-泛解酸内酯脱氢酶(RopLPLDH)突变体载体和分子伴侣质粒pGro7共表达的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，以pH 7.5、50mM的PB缓冲液(0.05M Na₂HPO₄，0.05M NaH₂PO₄)为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm(优选35℃、800rpm)条件下进行反应，以1M NaOH溶液调节反应液控制pH维持7.0～8.0，进行反应制得酮基泛解酸内酯，定期取样检测底物和产物的浓度。

所述转化体系中，底物加入终浓度500～1000mM(优选50～750mM)，催化剂用量以菌体湿重计为100～200g WCW/L(WCW细胞湿重)。

所述湿菌体按如下方法制备：将含RopLPLDH突变体载体和分子伴侣pGro7共表达的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，同时添加0.5g/L L-阿拉伯糖用于诱导分子伴侣蛋白，37℃、180rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，培养液中加入终浓度为0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，20℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含RopLPLDH突变体蛋白和分子伴侣蛋白的湿菌体。

本发明还涉及所述L-泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化制备D-泛解酸内酯中的应用。

具体的，所述应用为：构建L-泛解酸内酯脱氢酶突变体、共轭聚酮还原酶、葡萄糖脱氢酶共表达工程菌，以共表达获得的湿菌体为催化剂，以L-泛解酸内酯为反应底物，以葡萄糖为辅底物，以PB缓冲液为反应介质构成转化体系，进行反应制得D-泛解酸内酯。

针对L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH可溶性表达差的问题，本发明提供了多种提高可溶性表达的策略，利用L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH，醛酮还原酶CglCPR，葡萄糖脱氢酶EsGDH构建了三酶共表达体系，用于催化L-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，进一步制备D-泛解酸内酯。其中L-泛解酸内酯脱氢酶突变体RopLPLDH^A28S比细胞酶活提高了0.43倍。L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH与分子伴侣pGro7或pG-KJE8共表达策略显著降低了包涵体表达，增强了可溶性表达。重组菌RopLPLDH/pG-KJE8、RopLPLDH/pGro7的体积酶活达到了46.26U/L和39.38U/L。重组菌RopLPLDH^A28S/pGro7催化750mM L-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，转化率达到95％。L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH，醛酮还原酶CglCPR，葡萄糖脱氢酶GDH三酶共表达重组菌pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH催化200mM L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯，24小时转化率为95.6％。

具体的，所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述共轭聚酮还原酶编码基因(GenBank NO.CAG61069.1)来自光滑念珠菌Candida glabrata，序列如SEQ ID NO.3所示，所述葡萄糖脱氢酶编码基因(GenBank NO.KM817194.1)来自Exiguobacterium sibirium DSM 17290，序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述转化体系中，底物加入终浓度为50～500mM，葡萄糖加入终浓度为75～750mM，催化剂用量以菌体湿重计为1～100g WCW/L。

所述湿菌体按如下方法制备：将以RopLPLDH基因和CglCPR基因以及GDH基因构建的共表达工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，培养液中加入终浓度为0.3mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，获得RopLPLDH、CglCPR和GDH三酶共表达的湿菌体。

本发明RopLPLDH及突变体碱基序列全长均为1206bp，从第一个碱基起至第1206个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

本发明所述RopLPLDH突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对RopLPLDH的基因(SEQ ID NO.2)进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用重悬菌液催化L-泛解酸内酯，具体方法如下：第一步将对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RopLPLDH活化并提取质粒pET28b(+)-RopLPLDH，并保存于-20℃。第二步通过SWISS-MODEL进行同源建模，获得RopLPLDH的三维结构；然后再通过HOTSPOT WIZARD预测RopLPLDH的活性中心和相关的氨基酸。获得影响底物与RopLPLDH结合的关键氨基酸位点Ala 28。以pET28b(+)-RopLPLDH为模板质粒，通过对Ala 28进行定点饱和突变，获得突变质粒并转化，获得突变体文库。用氧化还原指示剂2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)在脱氢酶的催化反应中获得H⁺，由氧化态的蓝色变为还原态的无色，氧化态在600nm波长下具有特征吸收峰的原理建立高通量筛选方法，利用高通量方法对RopLPLDH定点饱和突变文库进行优势突变菌株的筛选，得到优势体，再利用气相复筛获得优势突变A28S，获得RopLPLDH突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RopLPLDH^A28S(记为RopLPLDH^A28S)。突变体菌株RopLPLDH^A28S相较于出发菌株的比细胞活力提高了0.43倍。

本发明所述RopLPLDH^A28S突变体与分子伴侣pGro7共表达的工程菌是将RopLPLDH^A28S突变体基因的重组质粒导入分子伴侣菌E.coli BL21(DE3)-pGro7制备的感受态细胞中，在卡那霉素和氯霉素的双抗性固体培养基中筛选获得。RopLPLDH^A28S突变体与分子伴侣pGro7共表达工程菌经接种、转接、诱导和菌体回收后，湿菌体用于测试比细胞活力。发现共表达菌株RopLPLDH^A28S/pGro7相较于出发菌株RopLPLDH/pGro7的比细胞活力提高了36.8％。

本发明RopLPLDH突变体、共轭聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素进行优化。

本发明有益效果主要体现在：本发明构建的RopLPLDH突变体工程菌RopLPLDH^A28S及其分子伴侣共表达工程菌RopLPLDH^A28S/pGro7的比酶活较对照组RopLPLDH分别提高了0.45倍和0.50倍。RopLPLDH突变体与分子伴侣共表达策略显著提高目的蛋白可溶性表达。其中共表达菌株RopLPLDH^A28S/pGro7基本能够完全催化500mM和750mM L-泛解酸内酯。三酶共表达工程菌pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH催化200mM底物时，产物L-泛解酸内酯浓度随时间的推移而逐渐升高，24h时底物转化率达到95.6％。

(四)说明书附图

图1为L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH、共轭聚酮还原酶CglCPR和葡萄糖脱氢酶EsGDH三酶偶联催化L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯的反应示意图。

图2为分子伴侣和可溶标签促进L-泛解酸内酯脱氢酶表达图。

图3为分子伴侣和可溶标签构建L-泛解酸内酯脱氢酶重组菌的体积酶活及转化率。

图4为重组菌RopLPLDH ^A28S/pGro7催化L-泛解酸内酯脱氢酶反应进程。

图5为三酶共表达重组菌的蛋白表达；

1为重组菌pA-EsGDH/CglCPR-pET-RopLPLDH表达上清液；

2为重组菌pA-EsGDH/CglCPR-pET-RopLPLDH表达沉淀；

3为重组菌pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH表达上清液；

4为重组菌pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH表达沉淀。

图6为重组菌pA-EsGDH/CglCPR-pET-RopLPLDH催化100mM L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯反应进程。

图7为三酶共表达重组菌催化200mM L-泛解酸内酯构型反转制备D-泛解酸内酯反应进程；1为重组菌pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH；2为重组菌pA-EsGDH/CglCPR-pET-RopLPLDH。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：

实施例1：L-泛解酸内酯脱氢酶突变体文库的构建及筛选

1、出发菌株：

以实验室保藏工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RopLPLDH为原始菌株，活化并提取质粒pET28b(+)-RopLPLDH，其中L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示。

2、定点突变：

(1)突变文库的构建

RopLPLDH突变体文库的制备通过定点突变来实现，以原始菌株中载体pET28b(+)-RopLPLDH为模板，引物为A28-F:GTTTATGCCNNSCTGATTGCAGGTAGCGAACG和A28-R:TGCAATCAGSNNGGCATAAACGCTTTTCGGC，进行聚合酶链式反应(PCR)。

PCR反应体系(25μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，12.5μL 2×Phanta缓冲液，0.5μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，0.5μL DNA聚合酶Phanta(诺唯赞，中国)和8.5μL超纯水。

根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸4min)，72℃终延伸10min，16℃保温。

将PCR扩增所得的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在卡那霉素抗性的LB平板培养基中，在37℃培养12～16h。

(2)初筛

随机挑选平板上的阳性克隆子及原始菌株，接种于96孔板中，加入1000μL LB培养基(含50μg/mL的卡那霉素)，在37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。各转接50μL种子液于另一块新的96孔板(加有950μL含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基)中，37℃，180rpm振荡培养4h后，加入IPTG(终浓度0.1mM)，转至28℃培养12h。所得的细胞通过96孔板离心机，4000rpm，4℃下离心10min，得到突变体的湿菌体。

将含湿菌体的96孔板每个孔中加入300μL磷酸钠缓冲溶液(50mM pH 7.0)重悬细胞，再取100μL菌悬液加至96孔酶标板的对应位置，分别加入终浓度为100μM的2,6-二氯酚靛酚(DCPIP),再分别加入终浓度为200μM L-泛解酸内酯起始反应，在酶标仪Kinetics(MDSpectraMax M5，USA)模式下，在温度30℃间隔30s测定5min内OD₆₀₀吸光值的变化。相应地，突变体酶活越高，OD₆₀₀的下降越多，从而筛选出突变文库内活力相对较高的突变体，用于进一步的复筛并进行测序验证。

(3)GC复筛

对步骤(2)获得的突变体进行优势突变体的筛选，将优势突变体经摇瓶发酵获得湿菌体，湿菌体用于复筛反应，复筛条件如下：将获得的突变体湿菌体以湿重10g/L的量加入pH 7.0的PB(50mM)中重悬，再加入终浓度10mM L-泛解酸内酯，在恒温震荡仪中30℃、1200rpm条件下进行反应30min，取反应液200μL加入50μL 6M盐酸(酸化)，加入200μL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相。采用GC检测L-泛解酸内酯和酮泛解酸内酯的浓度和转化率。以产物酮泛解酸内酯的转化率为指标，筛选获得优势菌株。

转化率＝酮泛解酸内酯物质的量/(酮泛解酸内酯物质的量+L-泛解酸内酯物质的量)。

将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存在-80℃冰箱。最终筛选得到优势突变体为RopLPLDH^A28S。

气相检测条件：色谱柱Agilent CycloSil-B(0.25mm×0.25μm×30m)，载气：氦气，流速：1mL/min，进样口、检测器温度：250℃；进样量：1μL；分流比：30:1；程序：起始温度100℃，以10℃/min速率升温至140℃，保持5min，然后2min内降温至起始温度。在此检测条件下，酮泛解酸内酯，D-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯的保留时间分别为：6.6min，8.8min和9.0min。

4、催化活性

将突变株和对照菌株分别作为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，比较突变体比细胞活力。反应体系选择为1mL，催化剂用量菌体湿重10g/L，底物终浓度10mM，pH 7.0、50mMPB缓冲液为反应介质，30℃、1200rpm涡旋振荡反应30min，取反应液200μL加入50μL 6M盐酸(酸化)，加入200μL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相。乙酸乙酯样品，采用实施例1所述GC检测L-泛解酸内酯、酮泛解酸内酯的浓度。

细胞酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，每分钟生成1μmol酮基泛解酸内酯所需的酶量定义为一个酶活单位U。比细胞酶活定义为每克菌体所具有的活力单位数，U/g。

突变体比细胞酶活示于表1。

表1：L-泛解酸内酯脱氢酶突变体及分子伴侣重组菌比细胞酶活

实施例2：多策略增强L-泛解酸内酯脱氢酶可溶性表达

1、策略一：分子伴侣共表达促进可溶表达

将重组质粒pET28b(+)-RopLPLDH和实验室保藏的来自于Rhodococcus hoagii的L-泛解酸内酯脱氢酶重组质粒pET28b(+)-RhoLPLDH分别通过热激转化至5种含有分子伴侣质粒的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，5种分子伴侣质粒分别为pG-KJE8,pGro7,pKJE7,pG-Tf2和pTf16，在含终浓度25μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素双抗性的LB固体培养基中筛选L-泛解酸内酯脱氢酶与分子伴侣共表达的重组工程菌。

2、策略二：连接可溶性标签促进可溶表达

将重组质粒pET28b(+)-RopLPLDH和pET28b(+)-RhoLPLDH通过无缝克隆技术分别与实验室保藏的6种促溶标签连接，通过热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，6种促溶标签分别为NT，MBP，PGB1，Sumo，PDI和Mistic。在含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中筛选携带促溶标签的L-泛解酸内酯脱氢酶的重组工程菌。

3、L-泛解酸内酯脱氢酶重组菌诱导表达

将步骤1构建的重组菌分别接种到含有终浓度25μg/mL氯霉素的10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度25μg/mL氯霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，同时参照TakaraChaperone Set说明书加入分子伴侣表达的诱导剂(L-阿拉伯糖或四环素)，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，置于28℃培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。

将步骤2构建的重组菌分别接种到含有终浓度50μg/mL卡纳霉素的10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡纳霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，置于28℃培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。

以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液或全细胞催化L-泛解酸内酯。

各重组菌的蛋白表达情况示于图2。可见，分子伴侣pGro7显著提高了RopLPLDH的上清表达量，pG-KJE8、pGro7和pG-KJE7降低了包涵体的表达。Sumo、PDI和Mistic融合的RopLPLDH包涵体表达减少，同时Mistic融合的RopLPLDH上清表达较高。

4、催化活性及转化率

将步骤3诱导表达的L-泛解酸内酯脱氢酶的湿细胞作为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，比较各重组菌体积酶活及相应的转化率。反应体系选择为1mL，催化剂用量为2mL发酵液离心收集的菌体，底物终浓度10mM，pH 7.0、50mM PB缓冲液为反应介质，30℃、1200rpm涡旋振荡反应30min和12h，取反应液200μL加入50μL 6M盐酸(酸化)，加入200μL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相。乙酸乙酯样品，采用实施例1所述GC检测L-泛解酸内酯、酮泛解酸内酯的浓度。

细胞酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，每分钟生成1μmol酮基泛解酸内酯所需的酶量定义为一个酶活单位U。体积酶活定义为每升发酵液所具有的活力单位数，U/L。

各重组菌体积酶活及转化率示于图3。可见，RopLPLDH与分子伴侣pG-KJE8和pGro7共表达体积酶活最高，分别达到46.26U/L、39.38U/L,而与可溶性标签连接的RopLPLDH几乎完全失去酶活。可见，伴侣pG-KJE8和pGro7不仅缓解了包涵体表达，而且保持了较高的酶活。

实施例3：L-泛解酸内酯脱氢酶底物特异性考察

将实施例1基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-RopLPLDH及其突变体经诱导表达后所获得的湿菌体，用作为生物催化剂。分别以10mM的D-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯为底物，利用全细胞催化考察源自Rhodococcus opacus的L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性。L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢的反应体系为1mL，分别含有：10g/L全细胞，10mM底物和50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。在恒温振荡反应器中，30℃，1200rpm反应0.5h，取200μL反应液加入50μL 6M盐酸(酸化)，加入200μL乙酸乙酯充分萃取。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，下层水相再次加入200μL乙酸乙酯充分萃取。再离心取上层有机相合并至第一次萃取有机相中。取二次萃取乙酸乙酯有机相转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。底物特异性结果发现，源自Rhodococcus opacus的L-泛解酸脱氢酶及其突变体不能催化D-泛解酸内酯，能催化L-泛解酸内酯。上述结果表明，源自Rhodococcus opacus的L-泛解酸脱氢酶特异性的作用于L-泛解酸内酯的脱氢反应。

实施例4：L-泛解酸内酯脱氢酶与分子伴侣共表达菌催化L-泛解酸内酯脱氢酶

以实施例2方法制备的RopLPLDH^A28S与分子伴侣pGro7共表达重组菌湿菌体催化L-泛解酸内酯。在5mL反应体系中，底物L-泛解酸内酯的投料量为500mM、750mM和1000mM，对应的全细胞用量分别为0.5g、0.75g和1g。以pH 7.0、50mM的PB缓冲液为反应介质构成转化体系，在35℃、800rpm条件下反应，1M NaOH调节反应pH，维持pH 7.0～8.0。采用实施例1方法检测，反应过程转化率见于图4。结果显示，RopLPLDH ^A28S/pGro7能催化500mM和750mM L-泛解酸内酯，底物转化率达到95％。RopLPLDH ^A28S/pGro7催化1000mM L-泛解酸内酯，底物转化率达到74％。

实施例5：构建RopLPLDH、CglCPR和EsGDH三酶共表达体系

1、出发菌株：

以实验室保藏工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RopLPLDH、E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-CglCPR和E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-EsGDH为原始菌株，活化并提取质粒pET28b(+)-RopLPLDH、pACYCDuet1-CglCPR和pET28b(+)-EsGDH，其中L-泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示。共轭聚酮还原酶CglCPR编码基因序列为SEQ ID NO.3所示。葡萄糖脱氢酶EsGDH编码基因序列为SEQ ID NO.4所示。

2、CglCPR和EsGDH共表达质粒的构建：

(1)片段和载体的扩增

将CglCPR和EsGDH分别插入双表达载体pACYCDuet1的二个多克隆位点(mcs1和mcs2)，构建pACYCDuet1-mcs1-CglCPR-mcs2-EsGDH和pACYCDuet1-mcs1-EsGDH-mcs2-CglCPR双酶共表达质粒。目的基因片段的扩增以质粒pACYCDuet1-CglCPR或pET28b(+)-EsGDH为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)。

PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，1μL DNA聚合酶Phanta(诺唯赞，中国)和20μL超纯水。

根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min)，72℃终延伸10min，16℃保温。

载体的扩增以质粒pACYCDuet1为模板，引物见表所示，进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应体系(50μL)同上。

PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸3min)，72℃终延伸10min，16℃保温。

(2)PCR产物的清洁Cleanup

在PCR反应液中加入3个体积的Buffer PCR-A液,混匀后，转移到DNA制备管中，将DNA制备管置于2mL离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管中，加700μL Buffer W2,12,000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管中，加400μLBuffer W2,12,000×g离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜中央加30μL无菌水，室温静置1min，12,000g离心1min，洗脱DNA。

(3)一步克隆连接片段和载体

通过Nanodrop测定PCR清洁产物的核酸浓度ng/μL。根据CloneExpress Ultra OneStep Cloning Kit C115(诺唯赞，中国)使用说明书，建立如下一步克隆的重组反应体系(10μL)：5μL 2×CloneExpress Mix，XμL线性化载体，YμL线性化片段，加无菌水至10μL。50℃反应10min，4℃保温。克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng。插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng。再根据测定的载体和片段的核酸浓度，计算X和Y的体积。

将重组产物转化到E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-RopLPLDH感受态细胞中，涂布在卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板培养基中，在37℃培养12-16h。

(4)菌落PCR筛选阳性克隆

随机挑选3个阳性克隆子，置于菌落PCR体系中，通过PCR扩增验证目的片段是否成功插入到载体中。

菌落PCR反应体系(10μL)：0.25μL正向验证引物(100μM)，0.25μL反向验证引物(100μM)，5μL 2×Phanta缓冲液，0.25μL dNTP混合物(各10mM)，挑取阳性单菌落作为模板，0.25μL DNA聚合酶Phanta(诺唯赞，中国)和4μL超纯水。

PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min)，72℃终延伸10min，16℃保温。

PCR产物通过DNA电泳验证是否有目的片段。

挑取DNA电泳阳性的单菌落，送杭州擎科生物技术有限公司测序验证。

(5)SDS-PAGE和催化验证

将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-mcs1-CglCPR-mcs2-EsGDH/pET28b(+)-RopLPLDH(记为pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH)和E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-mcs1-EsGDH-mcs2-CglCPR/pET28b(+)-RopLPLDH(记为pA-EsGDH/CglCPR-pET-RopLPLDH)双质粒共表达三酶重组工程菌分别接种到含有终浓度25μg/mL氯霉素和50μg/mL卡纳霉素的10mLLB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度25μg/mL氯霉素和50μg/mL卡纳霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8之间，再向培养液中加入终浓度0.1mMIPTG，置于28℃培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。

将获得的湿菌体以湿重10g/L的量加入pH 7.0的PB(50mM)中重悬，加入4×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸10min，120V电泳60min，分析蛋白表达情况。

SDS-PAGE图示于图5。葡萄糖脱氢酶GDH、醛酮还原酶CglCPR和RopLPLDH蛋白分子量分别为28、36和43kDa。在共表达体系中，仍然存在RopLPLDH包涵体高问题，同时造成GDH、CglCPR表达量低。但根据实施例6可知，该共表达体系仍然具有较好的催化能力。

实施例6：RopLPLDH、CglCPR和EsGDH三酶共表达重组菌催化L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯

以实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-mcs1-EsGDH-mcs2-CglCPR/pET28b(+)-RopLPLDH工程菌催化100mM L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯。在5mL反应体系中，先将湿细胞用pH 7.0、50mM的PB缓冲液重悬，转化体系中细胞催化剂加入量为30g/L，底物L-泛解酸内酯的投料量为100mM，葡萄糖浓度为150mM，以pH 7.0、50mM的PB缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、800rpm条件下反应，1M NaOH调节反应pH，维持pH 7.0～7.5。采用实施例1方法检测，反应过程转化率见于图6。结果显示，该重组菌催化100mM L-泛解酸内酯构象反转合成D-泛解酸内酯，12h底物转化率达到99％，并且没有中间副产物KPL的积累。

实施例7：RopLPLDH、CglCPR和EsGDH三酶共表达重组菌催化L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯

以实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-mcs1-EsGDH-mcs2-CglCPR/pET28b(+)-RopLPLDH和E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-mcs1-CglCPR-mcs2-EsGDH/pET28b(+)-RopLPLDH工程菌催化200mM L-泛解酸内酯构型翻转制备D-泛解酸内酯。在5mL反应体系中，先将湿细胞用pH 7.0、50mM的PB缓冲液重悬，转化体系中细胞催化剂加入量为50g/L，底物L-泛解酸内酯的投料量为200mM，葡萄糖浓度为300mM，以pH 7.0、50mM的PB缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、800rpm条件下反应，1M NaOH调节反应pH，维持pH 7.0～7.5。采用实施例1方法检测，反应过程转化率见于图7。结果显示，重组菌pA-CglCPR/EsGDH-pET-RopLPLDH和重组菌pA-EsGDH/CglCPR-pET-RopLPLDH催化200mM L-泛解酸内酯构象反转合成D-泛解酸内酯，24h底物转化率分别达到95％和87％，检测到中间副产物KPL的积累分别为4.6％和12.8％。

Claims (10)

1.一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第28位进行饱和突变获得。

2.如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.编码权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶突变体的基因。

4.含有权利要求3所述的基因的重组载体。

5.含有权利要求3所述的基因的基因工程菌。

6.权利要求1所述L-泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化L-泛解酸内酯制备酮基泛解酸内酯中的应用。

7.权利要求1所述L-泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化制备D-泛解酸内酯中的应用。

8.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为：构建L-泛解酸内酯脱氢酶突变体、共轭聚酮还原酶、葡萄糖脱氢酶共表达工程菌，以共表达获得的湿菌体为催化剂，以L-泛解酸内酯为反应底物，以葡萄糖为辅底物，以PB缓冲液为反应介质构成转化体系，进行反应制得D-泛解酸内酯。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述L-泛解酸内酯脱氢酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述共轭聚酮还原酶编码基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述葡萄糖脱氢酶编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物加入终浓度为50～500mM，葡萄糖加入终浓度为75～750mM，催化剂用量以菌体湿重计为1～100g WCW/L。

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