CN112961785A - 重复补料分批培养方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了培养微生物的方法。所述方法包括提供包含一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积。培养微生物和培养基直至所述培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给所述培养物，并且其中当达到所述阈值指标时，所述培养物处于阈值体积。所述方法还包括收获阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积，并向所述容器中加入使所述培养物的体积返回到所述起始体积的量的新鲜培养基。

Description

重复补料分批培养方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年10月16日提交的美国临时申请No.62/064,694的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
包括破囊壶菌(Thraustochytrid)种(species)在内的微生物的异养发酵是产生高价值油和生物质产物的有效方式。在某些培养条件下，微生物合成细胞内油，所述细胞内油可以被提取并用于生产生物燃料(生物柴油、生物喷射燃料等)和营养脂质(多不饱和脂肪酸，例如DHA、EPA、DPA)。微生物(例如，破囊壶菌种)的生物质因高PUFA和蛋白质含量而具有很高的营养价值，并且可以用作动物饲料的营养补充剂。
微生物发酵工艺主要以分批工艺或补料分批工艺进行。分批工艺通常涉及封闭系统培养，其中在特定条件(例如，特定水平的营养物、温度、压力等)下使细胞在固定体积的营养物培养基中生长至发酵罐中的特定密度，收获，并按批处理。在典型的补料分批工艺中，将一种或更多种营养物供给或供应至发酵罐，它们在发酵罐中保留直至培养过程结束。当控制一种营养物(或多种营养物)的浓度影响所需产物的产量或活性时，补料分批培养工艺可优于分批培养工艺。产油发酵工艺通常包括两个培养阶段：细胞增殖阶段，在此期间所有必需的营养物均可用于无限的培养物生长，随后是油积累阶段，在此期间关键的生长营养物(通常为氮)被有目的地限制在培养基中，同时提供过量的碳营养物并导入油合成。当达到目标细胞浓度和油含量时，停止发酵过程并收获富含油的生物质。然后必须对发酵罐容纳物(vessel)进行清洁、灭菌和用新鲜培养基重新分批，并且种子培养物(seed train)需要准备好用于再次接种生产容纳物(例如，分批/补料分批发酵之间的“周转”操作)。这样的周转操作通常耗时间和能量并且限制用于建成的生产工艺的生产容纳物的总可用操作时间。或者，可以采用连续方法培养微生物，其中将新鲜培养基连续加入发酵罐中，同时连续除去培养液以保持培养体积恒定。连续培养工艺可用于将微生物维持在特定的生长速率或生理稳态，但是可能难以在没有破坏的情况下维持并且通常用于研究目的，因为补料分批或分批培养倾向于提供更好的结果(例如，更高的产油率)，并且更易于用于大规模生产目的。
发明概述
本文提供了培养微生物的方法。所述方法包括提供含有一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积，在培养基中培养微生物直到培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给培养物，并且其中当达到所述阈值指标时，所述培养物处于阈值体积，收获所述阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积，以及向所述容器中加入使培养物的体积返回到起始体积的量的新鲜培养基。
附图简述
图1是显示在30L发酵罐中的重复补料分批发酵期间，容器内生物质浓度和油浓度随时间的进展的图。
图2是显示在30L发酵罐中贯穿重复补料分批发酵的生物质产率和油产率提高以及补料分批发酵的恒定生物质产率和油产率的图。图例中的RFB表示重复补料分批。
图3是显示在7L发酵罐中重复补料分批发酵期间，容器内生物质浓度和油浓度随时间的进展的图。
图4是显示在7L发酵罐中贯穿重复补料分批发酵的生物质产率和油产率提高以及补料分批发酵的恒定生物质产率和油产率的图。图例中的RFB表示重复补料分批。
图5是显示改变剩余种子体积(20％、30％和40％)对总平均生物质和油产率的影响的图。轴中的RFB表示重复补料分批。
发明详述
本文提供了通过重复补料分批工艺培养微生物的方法和产生油的方法。与典型的分批或补料分批工艺相比，所提供的方法导致生物质和油两者更高的总体积产率。简而言之，该工艺涉及以补料分批方法培养微生物，其中在完成通过达到特定体积和/或通过满足体积生物质和油产量而定义的发酵后，容纳物以维持其无菌性的方式排出，留下某一预定体积的培养物(例如，初始培养基体积的10％)。然后将新鲜的无菌培养基加入容纳物中，其中将先前发酵所留下的培养物用作种子。这个过程可以无限重复。留下用作种子的培养物的量可以变化；然而，应当考虑留下未收获的生物质与在随后发酵的滞后期中花费的减少的时间之间的权衡。在使用重复补料分批工艺中，发酵罐周转时间显著减少，这又导致生物质和油的更高的总体积产率；远远超过常规分批和补料分批工艺。此外，重复补料分批工艺使对清洁和灭菌的需求最小化，从而降低了操作成本。此外，对种子培养物的依赖性较小，这减少了劳动力和能量成本两者。
微生物
本文所述的方法包括从微生物群体中提取脂质。本文所述的微生物群体可以是藻类(例如微藻)、真菌(包括酵母)、细菌或原生生物。任选地，所述微生物包括破囊壶菌目(order Thraustochytriales)的破囊壶菌，更具体地，破囊壶菌属(Thraustochytrium)的破囊壶菌(Thraustochytriales)。任选地，所述微生物群体包括如美国专利No.5,340,594和5,340,742中所述的破囊壶菌，这两篇专利通过引用整体并入本文。所述微生物可以是破囊壶菌属种，例如如美国专利No.8,163,515中所述作为ATCC登录号PTA-6245(即，ONC-T18)保藏的破囊壶菌属种，其通过引用整体并入本文。因此，所述微生物可以具有与SEQ ID NO：1至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多(例如，包括100％)同一的18s rRNA序列。
用于本文所述方法的微生物可产生多种脂质化合物。本文所用术语脂质包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸酯、三酰基甘油、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如，氧代类胡萝卜素)、烃和本领域普通技术人员已知的其它脂质。任选地，脂质化合物包括不饱和脂质。不饱和脂质可以包括多不饱和脂质(即，含有至少2个不饱和碳-碳键(例如，双键)的脂质)或高度不饱和脂质(即，含有4个或更多个不饱和碳-碳键的脂质)。不饱和脂质的实例包括ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(即，DHA)、二十碳五烯酸(即，EPA)和其它天然存在的不饱和、多不饱和和高度不饱和化合物。
工艺
本文提供了培养微生物的方法。该方法包括提供包含一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积；在培养基中培养微生物直到培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给培养物，并且其中当达到阈值指标时，所述培养物处于阈值体积；收获所述阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积；以及向所述容器中加入使培养物的体积返回到起始体积的量的新鲜培养基。
该方法适用于大规模发酵以及小规模发酵和其间的任意发酵规模。本文所使用的大规模发酵是指发酵罐中的发酵，其体积容量(即，工作体积)为至少约1,000L，为顶部空间留下足够的空间。小规模发酵通常指发酵罐中的发酵，其体积容量通常不超过约100L，例如5L、10L、50L或100L。本发明的补料分批发酵工艺的显著优点是其可以用于以5至10L发酵罐规模生产油，并且可扩展至任何体积，例如100L、150L、250L、500L、1000L或更多，而不限于此。
如在下文的实施例中更详细描述的，重复补料分批工艺减少(如果不是消除的话)生产容纳物的周转时间，其最终目标是提高容积产率。图1中说明了体积产率如何增加超过典型的补料分批发酵的实例。假设生产容纳物的24小时周转时间包括在总工艺时间中，则在任意给定时间的总生物质(X)产率可以计算为：X(克)/容纳物工作体积(L)/时间*24(小时/天)，最终单位为g/L-天。油产率可以以类似的方式计算：油(g)/容纳物工作体积(L)/时间*24(小时/天)。如图1所见，补料分批工艺的生物质和油产率将随时间保持恒定。相反，在重复补料分批工艺的第一个循环之后，平均产率提高，远远超过补料分批工艺，因为不需要周转时间，并且由于种子密度增加，循环时间减少，在该数据集中，采用20％种子。
在所提供的方法中，剩余体积可以是起始体积的1％至40％，例如1％至5％、1％至10％、1％至20％、1％至30％、5％至10％、5％至20％、5％至30％、10％至20％、10％至30％、20％至40％或1％至40％之间的任意体积，包括起始体积。任选地，剩余体积为起始体积的至少约10％。
所提供的方法包括培养微生物直到培养物达到参数的阈值指标。本文所用术语参数是指培养条件中的变量，其可以被监测和控制以调节微生物培养物的进程。阈值指标是给定参数的预选水平或浓度。这样的参数包括但不限于培养物体积、光密度(OD)、细胞浓度、二氧化碳产生速率、pH、溶解氧(DO)、时间、培养基中营养物的浓度、代谢副产物的积累、温度、生物质产率和油产率。如本领域普通技术人员将理解的并且基于本文提供的指导，预期使用任何合适的参数或参数的组合。任选地，阈值指标是培养基中营养物的预选水平或浓度。可以在培养基中测量的合适的营养物包括但不限于碳和氮。
所提供的方法任选地包括重复以下步骤：(i)在培养基中培养微生物直到培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给培养物，并且其中当达到阈值指标时，所述培养物处于阈值体积；(ii)收获所述阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积；以及(iii)向所述容器中加入使培养物的体积返回到起始体积的量的新鲜培养基。任选地，所述步骤重复两次或更多次。任选地，所述步骤重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次。当重复该过程多次时，如上所述，开始体积和剩余体积可以每次或每轮不同。任选地，开始体积和剩余体积可以每次或每轮保持相同。例如，在第一轮中，剩余体积可以是起始体积的2％，并且在连续轮次中，剩余体积可以是起始体积的10％。连续轮次中的剩余体积也可以变化，例如，其可以在一轮中为起始体积的10％，在另一轮中为起始体积的20％。所提供的方法有利地允许培养物维持更长时间段。因此，可以重复方法步骤，只要期望维持培养物并继续收获一部分用于进一步使用即可。任选地，将培养物维持数小时、数天、数周或数月的时间段。任选地，将培养物维持至少150至500小时。例如，培养物可以维持至少250小时。任选地，将培养物维持一、二、三、四或五周。
任选地，所提供的方法包括产生单个或仅一个种子或种子培养物。微生物的典型补料分批培养需要产生以称为种子培养的分步方式产生的种子培养物。种子培养用于建立培养物的体积和密度以接种到清洁无菌的生产容纳物中。种子培养需要时间、用于灭菌的能量，并且当培养物在多个容纳物之间转移时也产生更多的污染机会。重复补料分批方法需要该种子培养仅接种第一个循环。同样，生产容纳物仅需在初始循环中灭菌。因此，在周转生产容纳物(清洁和灭菌)时节省了时间，并且节省了来自对种子培养中的清洁、灭菌和操作容纳物的能量。因此，所提供的方法任选地包括单个灭菌步骤。此外，污染的风险从用于连续批次的种子培养物转移中减轻。因此，与典型的分批或补料分批工艺相比，所提供的方法导致减少的污染。
使用生产容纳物培养物(即，剩余体积)作为连续批次的种子还允许选择供使用种子的百分比的选择，而不需要购买种子培养中的更大的设备或额外的发酵罐。例如，2％种子体积(在200,000L工作体积生产容纳物中对于100,000L起始体积为2000L)可以用于初始分批发酵，而所有后续重复可以用10％种子接种。2％种子培养物消除了种子培养物对更大的容器(即，10,000L工作体积容纳物)的需要，从而减少资本成本/投资并降低污染风险，因为种子培养物的转移减少一次。通过使用2％种子，微生物生长的滞后期增加，导致生产容纳物中较低的体积产率。然而，使用重复补料分批方法的连续批次用10％种子体积接种，这个长滞后期显著缩短。
所提供的方法包括或可以与根据本领域已知的方法培养微生物的另外的步骤结合使用。例如，可以根据美国专利公开2009/0117194或2012/0244584中所述的方法培养破囊壶菌，例如，破囊壶菌属，这两篇专利通过引用整体并入本文用于其中所使用的方法或组合物的每个步骤。
微生物在生长培养基(也称为“培养基”)中生长。多种培养基中的任一种可适合用于培养本文所述的微生物。任选地，培养基为微生物提供各种营养成分，包括碳源和氮源。破囊壶菌培养物的培养基可以包括多种碳源中的任一种。碳源的实例包括脂肪酸、脂质、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇、氨基糖和任何种类的生物质或废物流。脂肪酸包括例如油酸。碳水化合物包括但不限于葡萄糖、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖(dextrose)、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、乙酸盐、m-肌醇(例如，来源于玉米浆)、半乳糖醛酸(例如，衍生自果胶)、L-岩藻糖(例如，衍生自半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸(例如，衍生自葡萄糖)、纤维二糖、糊精、α-环糊精(例如，衍生自淀粉)和蔗糖(例如，来自糖蜜)。多元醇包括但不限于麦芽糖醇、赤藓糖醇和阿东糖醇。氨基糖包括但不限于N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。任选地，碳源是葡萄糖。如上所述，在所提供的方法中，碳源以高浓度(例如，至少200g/L)提供。
任选地，本文提供的微生物在增加目标化合物(例如，油或总脂肪酸(TFA)含量)的生物质和/或产量的条件下培养。例如，破囊壶菌通常在盐水培养基中培养。任选地，破囊壶菌可在具有约0.5g/L至约50.0g/L的盐浓度的培养基中培养。任选地，在具有约0.5g/L至约35g/L(例如，约18g/L至约35g/L)的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。任选地，本文所述的破囊壶菌可以在低盐条件下生长。例如，破囊壶菌可在具有约0.5g/L至约20g/L(例如，约0.5g/L至约15g/L)的盐浓度的培养基中培养。培养基任选地包括NaCl。任选地，培养基包括天然或人造海盐和/或人造海水。
培养基可以包括不含氯化物的钠盐作为钠源。适合用于本发明方法的非氯化物钠盐的实例包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠及其混合物。参见，例如，美国专利No.5,340,742和6,607,900，其各自的全部内容通过引用并入本文。例如，总钠的很大一部分可以由非氯化物盐提供，使得培养基中总钠的小于约100％、75％、50％或25％由氯化钠提供。
任选地，培养基具有小于约3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/L的氯化物浓度。例如，用于所提供的方法的培养基可以具有介于约60mg/L和120mg/L之间且包括约60mg/L和120mg/L的氯化物浓度。
破囊壶菌培养物的培养基可以包括多种氮源中的任一种。示例性氮源包括铵溶液(例如，H2O中的NH4)、铵盐或胺盐(例如(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4OOCH2CH3(NH4Ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。合适的培养基中氮源的浓度通常介于约1g/L至约25g/L之间，包括约1g/L和约25g/L。
培养基任选地包括磷酸盐，例如磷酸钾或磷酸钠。培养基中的无机盐和痕量营养物可以包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰氯化钙和EDTA。可以包括维生素例如盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12。
可使用酸或碱，在适当时，和/或使用氮源，将培养基的pH调节至3.0至10.0之间并且包括3.0和10.0。任选地，培养基可以是无菌的。
通常，用于培养微生物的培养基是液体培养基。然而，用于培养微生物的培养基可以是固体培养基。除了如本文所讨论的碳和氮源之外，固体培养基还可以含有提供结构支持和/或使得培养基为固体形式的一种或更多种组分(例如，琼脂或琼脂糖)。
可以培养细胞一段时间。任选地，将细胞培养1天至60天之间的任何时间。任选地，将培养物维持数小时、数天、数周或数月的时间段。任选地，将培养物维持至少150至500小时。任选地，将培养物维持至少250小时。任选地，将培养物维持一、二、三、四或五周。培养任选在约4℃至约30℃、例如约18℃至约28℃的温度下进行。培养可以包括通气振荡培养、振荡培养、静止培养、分批培养、半连续培养、连续培养、辊式分批培养、波培养等。培养可以使用常规的搅拌-发酵罐、鼓泡塔发酵罐(分批或连续培养)、气升式发酵罐、波式发酵罐等进行。
培养物可以通过多种方法中的一种或更多种进行通气，包括振荡。任选地，振荡范围为约100rpm至约1000rpm，例如约350rpm至约600rpm或约100至约450rpm。任选地，在产生物质阶段期间和在产脂质阶段期间使用不同的振荡速度对培养物通气。替选地或另外地，振荡速度可根据培养容纳物的类型(例如，烧瓶的形状或大小)而变化。
可以根据涉及一种或更多种培养条件转换的方法通过培养细胞以获得更大量的所需化合物来增加所需脂质的产量。任选地，首先在使生物质最大化的条件下培养细胞，随后将一种或更多种培养条件转换为有利于脂质产率的条件。转换的条件可以包括氧浓度、C：N比、温度及其组合。任选地，进行两阶段培养，其中第一阶段有利于生物质生产(例如，使用高氧(例如，通常或相对于第二阶段)、低C：N比和环境温度)的条件，随后有利于脂质产生的第二阶段(例如，与第一阶段相比，其中氧减少、C:N比增加且温度降低)。与先前描述的方法相反，所提供的方法允许在高水平的油或脂质产生条件下维持培养长时间。
巴氏灭菌
任选地，将所得生物质巴氏灭菌以灭活存在于生物质中的非期望的物质。例如，可以将生物质巴氏灭菌以使化合物降解物质失活。生物质可以存在于发酵培养基中或从用于巴氏灭菌步骤的发酵培养基中分离。巴氏灭菌步骤可以通过将生物质和/或发酵培养基加热至高温来进行。例如，可以将生物质和/或发酵培养基加热至约50℃至约95℃(例如，约55℃至约90℃或约65℃至约80℃)的温度。任选地，可以将生物质和/或发酵培养基加热约30分钟至约120分钟(例如，约45分钟至约90分钟，或约55分钟至约75分钟)。巴氏灭菌可以使用合适的加热装置进行，例如通过直接蒸汽注射。
任选地，不进行巴氏灭菌步骤。换句话说，本文教导的方法任选地缺少巴氏灭菌步骤。
收获和洗涤
任选地，可以根据多种方法收获生物质，包括本领域技术人员目前已知的那些方法。例如，可以使用例如离心(例如，利用固体弹射离心机)或过滤(例如，交叉流过滤)从发酵培养基收集生物质。任选地，收获步骤包括使用沉淀剂来加速收集细胞生物质(例如，磷酸钠或氯化钙)。
任选地，用水洗涤生物质。任选地，生物质可以浓缩至高达约20％的固体。例如，生物质可以浓缩至约5％至约20％固体、约7.5％至约15％固体、或约固体至约20％固体或所述范围内的任意百分比。任选地，生物质可以浓缩至约20％固体或更少、约19％固体或更少、约18％固体或更少、约17％固体或更少、约16％固体或更少、约15％固体或更少、约14％固体或更少、约13％固体或更少、约12％固体或更少、约11％固体或更少、约10％固体或更少、约9％固体或更少、约8％固体或更少、约7％固体或更少、约6％固体或更少、约5％固体或更少、约4％固体或更少、约3％固体或更少、约2％固体或更少、或者约1％固体或更少。
分离和提取
所提供的方法任选地包括从生物质或微生物中分离多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸的分离可以使用多种方法中的一种或更多种进行，包括本领域技术人员目前已知的那些。例如，分离多不饱和脂肪酸的方法描述于美国专利No.8,163,515中，其全部内容通过引用并入本文。任选地，在分离多不饱和脂肪酸之前不对培养基灭菌。任选地，灭菌包括温度升高。任选地，由微生物产生并由所提供的方法分离的多不饱和脂肪酸是中链脂肪酸。任选地，一种或更多种多不饱和脂肪酸选自α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。
产物
包括多不饱和脂肪酸(PUFA)的油和根据本文所述的方法产生的其它脂质可以用于利用其生物学、营养或化学性质的多种应用中的任一种。因此，所提供的方法任选地包括从阈值体积的收获部分分离油。任选地，油用于产生燃料，例如生物燃料。任选地，油可以用于药物、食品补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等。根据本文所述方法产生的脂质也可用作生产其它化合物的中间体。
举例来说，由使用所提供的方法培养的微生物产生的油可以包含脂肪酸。任选地，脂肪酸选自α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。任选地，油包含甘油三酯。任选地，油包含选自棕榈酸(C16:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈油酸(C16:1(n-7))、顺式-异油酸(C18:1(n-7))、二十二碳五烯酸(C22:5(n-6))、二十二碳六烯酸(C22:6(n-3))及其组合的脂肪酸。
任选地，根据本文所述方法产生的脂质可以掺入到最终产品(例如，食品或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物、燃料等)中。脂质可以掺入其中的合适的食品或饲料补充剂包括饮料如牛奶、水、运动饮品、能量饮品、茶和果汁；糖果例如糖果、果冻和饼干；含脂肪的食品和饮料例如乳制品；加工食品例如软米(或粥)；婴儿配方奶粉；早餐谷物等。任选地，一种或更多种产生的脂质可以掺入到膳食补充剂中，例如维生素或多种维生素。任选地，根据本文所述方法产生的脂质可以包括在膳食补充剂中，并且任选地可以直接掺入食品或饲料(例如，食品补充剂)的组分中。
可以掺入通过本文所述的方法产生的脂质的饲料的实例包括宠物食品，例如猫食、狗食等；水族鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；养殖动物(包括在水产养殖中养殖的家畜和鱼类或甲壳类动物)的饲料。可以掺入根据本文所述方法产生的脂质的食品或饲料材料优选对于生物体(为预期接受者)是可口的。这种食品或饲料材料可以具有目前已知的用于食品材料(例如，固体、液体、软质物(soft))的任何物理性质。
任选地，可以将一种或更多种所产生的化合物(例如，PUFA)掺入营养品或药物中。这样的营养品或药物的实例包括各种类型的片剂、胶囊、可饮用试剂等。任选地，营养品或药物适于局部应用。剂型可包括例如胶囊、油、颗粒剂、浓缩颗粒剂(granula subtilae)、散剂(pulveres)、片剂、丸剂、锭剂等。
根据本文所述方法产生的油或脂质可以与任何各种其它试剂组合掺入本文所述的产品中。例如，这样的化合物可以与一种或更多种粘合剂或填料、螯合剂、颜料、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、香料、防腐剂等或其任意组合相组合。
公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，尽管可能没有明确公开这些化合物的各种单独和集合组合和排列的具体引用，但是其分别在本文中特别涵盖和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括该方法的多种分子数目进行的多种修饰，除非相反地特别指出，否则该方法的各个组合和排列以及可能的修饰均被特别涵盖。同样，也特别涵盖和公开了这些的任何子集或组合。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多种另外的步骤，则应当理解，这些额外的步骤中的每一个均可以利用所公开的方法的任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集是特别涵盖的并且应当被认为是公开的。
如通篇所用，范围(例如1-10)和对约给定值(例如约1或约10)的引用包括所述一个或多个值(例如1和/或10)。
本申请还涉及以下实施方案：
实施方案1.一种培养微生物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供包含一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积；
(b)在所述培养基中培养所述微生物直至所述培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给所述培养物，并且其中当达到所述阈值指标时，所述培养物处于阈值体积；
(c)收获所述阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积；和
(d)向所述容器中加入使所述培养物的体积返回到所述起始体积的量的新鲜培养基。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述剩余体积为所述起始体积的1％至40％。
实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中所述剩余体积为所述起始体积的1％至5％。
实施方案4.根据实施方案2所述的方法，其中所述剩余体积为所述起始体积的5％至10％。
实施方案5.根据实施方案2所述的方法，其中所述剩余体积为所述起始体积的10％至20％。
实施方案6.根据实施方案2所述的方法，其中所述剩余体积为所述起始体积的20％至40％。
实施方案7.根据实施方案2所述的方法，其中所述剩余体积为所述起始体积的至少约10％。
实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述阈值指标选自所述培养物的体积、光密度(OD)、溶解氧(DO)、细胞浓度、二氧化碳产生速率、pH、时间、培养基中营养物的浓度、生物质产率、油产率或其任意组合。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其中所述阈值指标是所述培养基中营养物的浓度，并且其中所述营养物是碳或氮。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其包括重复以下步骤：(i)在所述培养基中培养所述微生物直至所述培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给所述培养物，并且其中当达到所述阈值指标时，所述培养物处于阈值体积；(ii)收获所述阈值体积的一部分，以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积；和(iii)向所述容器中加入使所述培养物的体积返回到所述起始体积的量的新鲜培养基。
实施方案11.根据实施方案10所述的方法，其中将所述步骤重复两次或更多次。
实施方案12.根据实施方案10所述的方法，其中将所述步骤重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其还包括从所述阈值体积的所述收获部分中分离油。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述油包含选自以下的脂肪酸：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。
实施方案15.根据实施方案13所述的方法，其中所述油包含甘油三酯。
实施方案16.根据实施方案13所述的方法，其中所述油包含选自以下的脂肪酸：棕榈酸(C16:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈油酸(C16:1(n-7))、顺式-异油酸(C18:1(n-7))、二十二碳五烯酸(C22:5(n-6))、二十二碳六烯酸(C22:6(n-3))及其组合。
实施方案17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中所述微生物属于破囊壶菌科。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述微生物属于破囊壶菌属。
实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中所述微生物是ONC-T18。
本文引用的出版物和其引用的材料特别地通过引用整体并入本文。
以下实施例旨在进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，并且不旨在限制权利要求的范围。
实施例
实施例1.用于生产生物质和油的重复补料分批发酵
在微生物油生产领域中，在工艺效率和产物产率方面，异养(黑暗)发酵通常被认为优于自养微生物培养。然而，它常常受到较高的固定资本成本(构建基于容纳物的发酵设备的成本通常远高于开放池塘(open-pond)和跑道型(raceway)培养系统的资本成本)的阻碍。使用重复补料分批生产工艺可以获得更高的总体积产率，同时降低操作成本。这通过最小化生产容纳物的周转时间并最小化与种子培养物和生产容纳物的灭菌相关的能量使用来实现。这意味着更好地利用固定资本投资(发酵罐和相关设备)和更高的年生产能力。因为只使用初始种子培养物，所以还有减少的资本投资。
图1示出在30L发酵罐中重复补料分批发酵期间，容纳内生物质浓度和油浓度随时间的进展。对于该实验，使用葡萄糖作为碳源来利用10％剩余体积。在图2中，使用12小时的批次周转时间来计算每个独立补料分批操作的产率，并且使用相同的12小时周转时间来计算重复补料分批操作的第一批次。如图2所见，典型补料分批工艺的生物质和油产率将随时间保持恒定，因为每个后续补料分批工艺与前一批次独立操作，在各补料分批工艺之间建立有固定的周转时间。相反，在重复补料分批工艺的第一个循环之后，平均产率增加，远远超过补料分批工艺的产率，这是因为不需要周转时间，并且由于种子密度增加，循环时间减少。
图3示出在7L发酵罐中重复补料分批发酵期间，容纳物内生物质浓度和油浓度随时间的进展。对于该实验，使用葡萄糖作为碳源利用20％剩余体积。在图4中，使用12小时的批次周转时间来计算每个独立补料分批操作的产率，并且使用相同的12小时周转时间来计算重复补料分批操作的第一批次。如图4所见，典型补料分批工艺的生物质和油产率将随时间保持恒定，因为每个后续补料分批工艺与先前的批次独立操作，其间建立有固定的周转时间。相反，在重复补料分批工艺的第一个循环之后，平均产率增加，远远超过补料分批工艺，因为不需要周转时间，并且由于种子密度增加，循环时间减少。
在320小时的时间段进行具有不同剩余种子体积，即20％、30％和40％的重复补料分批发酵，每个达到总共6次重复操作。如图5所见，当与单一补料分批操作的那些相比时，所有重复补料分批发酵产生更高的总平均生物质和油产率。将剩余种子体积从20％增加到30％导致平均产率显著增加；而剩余种子体积从30％进一步增加至40％不会进一步提高产率。这表明在未收获的生物质(即，用作种子的剩余体积)和减少的在随后发酵的滞后期中花费的时间之间的权衡。在这些条件下，最佳权衡点为约30％的剩余种子体积。
序列表
<110> 玛拉可再生能源公司(MARA RENEWABLES CORPORATION)
<120> 重复补料分批培养方法
<130> 095523-0960120 (012WO1)
<150> 62/064,694
<151> 2014-10-16
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成构建体
<400> 1
gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60
gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120
atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180
gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240
gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300
actacggtga ctataacggg tgacggggag ttagggctcg actccggaga gggagcctga 360
gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgtaa attacccaat gtggactcca 420
cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480
caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 540
aattccagct ccagaagcgt atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 600
tctggggcgg gagccccggt ctttgcgcga ctgcgctctg tttgccgagc ggctcctctg 660
ccatcctcgc ctcttttttt agtggcgtcg ttcactgtaa ttaaagcaga gtgttccaag 720
caggtcgtat gacctggatg tttattatgg gatgatcaga tagggctcgg gtgctatttt 780
gttggtttgc acatctgagt aatgatgaat aggaacagtt gggggtattc gtatttagga 840
gctagaggtg aaattcttgg atttccgaaa gacgaactac agcgaaggca tttaccaagc 900
atgttttcat taatcaagaa cgaaagtctg gggatcgaag atgattagat accatcgtag 960
tctagaccgt aaacgatgcc gacttgcgat tgcggggtgt ttgtattgga ccctcgcagc 1020
agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1080
taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1140
acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcttg 1200
attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1260
ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagcggtgg gtatggcgac atacttgcgt 1320
acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380
gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440
catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500
cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560
agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620
cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680
tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723

Claims (22)

1.培养微生物的重复补料分批方法，其包括以下步骤：
a.步骤的循环，其包括
(1)提供包含一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积；
(2)通过补料分批方法在所述容器的培养基中培养所述微生物，其包括：
(a)在有利于生物质产生的条件下培养所述微生物；以及
(b)在有利于脂质产生的条件下培养步骤(2)(a)的微生物直至所述培养物完成发酵，并且当发酵完成时达到阈值体积，其中所述阈值体积大于所述起始体积并且其中所述培养包括将一种或更多种碳源供给所述培养物；
(3)收获所述容器的培养物的阈值体积的一部分以在所述容器中留下所述起始体积的20％至40％的剩余体积；
(4)向所述容器中加入使所述培养物的体积返回到所述起始体积的量的新鲜培养基；以及
b.重复所述步骤的循环一次或多次。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(2)(b)的过程中检测所述培养物的体积、光密度(OD)、溶解氧(DO)、细胞浓度、二氧化碳产生速率、pH、时间、培养基中营养物的浓度、生物质产率、油产率或其任意组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中检测所述培养基中营养物的浓度，并且其中所述营养物是碳或氮。
4.根据权利要求1所述的方法，其还包括重复(2)、(3)和(4)的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中将所述步骤的循环重复2次或更多次。
6.根据权利要求5所述的方法，其中将所述步骤的循环重复2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质包括含有选自以下的脂肪酸的甘油三酯：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质包含甘油三酯。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质包括含有选自以下的脂肪酸的甘油三酯：棕榈酸(C16:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈油酸(C16:1(n-7))、顺式-异油酸(C18:1(n-7))、二十二碳五烯酸(C22:5(n-6))、二十二碳六烯酸(C22:6(n-3))及其组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是破囊壶菌(Thraustochytrid)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述破囊壶菌微生物属于破囊壶菌科。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述破囊壶菌科微生物属于破囊壶菌属。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述破囊壶菌科微生物是在ATCC登录号PTA-6245下保藏的微生物。
14.根据权利要求2所述的方法，其中检测所述培养物的体积。
15.根据权利要求2所述的方法，其中检测细胞浓度。
16.根据权利要求2所述的方法，其中确定油产率。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述剩余体积包括富含油的细胞。
18.从产油微生物的培养物生产油的方法，其包括：
a.根据权利要求1所述的方法培养所述微生物，以及
b.从所述阈值体积的收获部分分离油。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法产生40至50g/L/d的油产率。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法产生50至70g/L/d的生物质产率。
21.根据权利要求18所述的方法，其中在每个循环之后油产率增加。
22.根据权利要求18所述的方法，其中在每个循环之后生物质产率增加。
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