BR112017003558B1 - Método de repetição de batelada alimentada de cultivo de um microorganismo - Google Patents

Método de repetição de batelada alimentada de cultivo de um microorganismo Download PDF

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Abstract

método de cultivo de um micro-organismo. são fornecidos neste documento métodos de cultivo de um micro-organismo. o método inclui o fornecimento de um recipiente compreendendo um ou mais micro-organismos e um meio, em que os micro-organismos e o meio formam um volume inicial. os micro-organismos e o meio são cultivados até que a cultura atinja um indicador de limite, em que o cultivo compreende a introdução de uma ou mais fontes de carbono à cultura e em que a cultura está em um volume limite quando o indicador de limite é atingido. o método também inclui a colheita de uma porção do volume limite para deixar um volume residual que seja 40% ou menos do volume inicial e adição de meio fresco ao recipiente numa quantidade para retornar o volume da cultura ao volume inicial.

Description

REFERENCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisorio U.S. n° 62/064.694, depositado em 16 de outubro de 2014, que esta integralmente incorporado neste documento por referenda.
FUNDAMENTOS DA INVENCAO
[002] As fermenta5oes heterotroficas dos micro-organismos, incluindo da especie Thraustochytrid, sao formas eficientes de gera?ao de produtos de oleo e de biomassa de alto valor. Em certas condi?oes de cultura, os micro-organismos sintetizam oleo intracelular, que pode ser extraido e usado para produzir biocombustivel (biodiesel, bio-jetfuel e similares) e lipidios nutricionais (acidos graxos poli-insaturados, por exemplo, DHA, EPA, DPA). A biomassa de micro-organismos, como a especie Thraustochytrid, tern tambem um grande valor nutricional devido ao teor elevado de PUFA e proteina e pode ser usada como suplemento nutricional para alimenta?ao animal.
[003] Os processos de fermenta?ao por micro-organismo sao realizados principalmente em processos descontinuos ou de batelada alimentada. Os processos descontinuos normalmente envolvem uma cultura em sistema fechado, em que as celulas sao cultivadas em um volume fixo de meio de cultura nutriente em condi?oes especificas (por exemplo, niveis especificos de nutrientes, temperatura, pressao e similares) a uma certa densidade em um fermentador, colhida e processada como um lote. Em processos de batelada alimentada tipicos, um ou mais nutrientes sao introduzidos ou colocados em um fermentador, em que eles permanecem ate ao final do processo de cultura. Os processos de cultura de batelada alimentada podem ser superiores aos processos de cultura descontinuos quando o controle das concentrates de um nutriente (ou nutrientes) afeta o rendimento ou a atividade de um produto desejado. Os processos de fermenta?ao produtores de oleo sao compostos normalmente por duas fases de cultivo, uma fase de prolifera?ao celular, durante a qual todos os nutrientes necessarios estao disponiveis para o crescimento ilimitado da cultura, seguido por uma fase de acumulo de oleo, durante a qual um nutriente de crescimento chave (normalmente, nitrogenio) e propositadamente limitada no meio enquanto o nutriente de carbono excedente e fomecido e canalizado para a sintese de oleo. Quando a concentra?ao celular alvo e o teor de oleo sao alcansados, o processo de fermenta?ao e interrompido e a biomassa rica em oleo e colhida. O recipiente do fermentador deve ser limpo, esterilizado e redividido com meio fresco, e uma serie de sementes precisa estar pronta para inocular o recipiente de produ?ao novamente (por exemplo, uma opera?ao de "reorganiza?ao" (turnaround) entre fermentasoes continuas/batelada alimentada). Tal opera?ao de reorganiza?ao e muitas vezes demorada e consome muita energia e limita as horas de opera?ao totais disponiveis do recipiente de produ?ao para um processo de produ?ao estabelecido. Altemativamente, os micro-organismos podem ser cultivados usando metodos continuos onde o meio fresco e continuamente adicionado ao fermentador, enquanto o liquido da cultura e continuamente removido para manter o volume da cultura constante. Os processos de cultura continuos podem ser usados para manter o micro-organismo a uma taxa de crescimento especifica ou estado estacionario fisiologico, mas pode ser dificil manter sem interrup?ao e sao normalmente usados para fins de pesquisa, uma vez que as culturas de batelada alimentada ou descontinuas tendem a fomecer melhores resultados (por exemplo, maior rendimento de oleo) e sao mais faceis de usar para fins de produ?ao em grande escala.
BREVE SUMARIO DA INVENCAO
[004] Sao fomecidos neste documento metodos de cultivo de um micro-organismo. Os metodos incluem o fomecimento de um recipiente compreendendo um ou mais micro-organismos e um meio, em que os micro- organismos e o meio formam um volume inicial, o cultivo dos micro- organismos no meio ate que a cultura atinja um indicador de limite, em que o cultivo compreende a introdu?ao de uma ou mais fontes de carbono a cultura e em que a cultura esta em um volume limite quando o indicador de limite e atingido, a colheita de uma porsao do volume limite para deixar um volume residual que seja 40% ou menos que o volume inicial, e adi?ao de um meio fresco ao recipiente numa quantidade para retomar o volume da cultura ao volume inicial.
BREVE DESCRICAO DAS FIGURAS
[005] A Figura 1 e um grafico que mostra a progressao de uma concentra?ao de biomassa em um sistema fechado e concentra?ao de oleo ao longo do tempo durante uma fermenta?ao de repeti?ao de batelada alimentada em fermentador de 30L.
[006] A Figura 2 e um grafico que mostra a produtividade de biomassa e a melhoria da produtividade de oleo ao longo de uma fermenta?ao de repeti?ao de batelada alimentada em um fermentador de 30L, bem como a produtividade de biomassa constante e a produtividade de oleo das fermenta5oes de batelada alimentada. RFB na legenda representa processo de repeti?ao de batelada alimentada.
[007] A Figura 3 e um grafico que mostra a progressao de uma concentra?ao de biomassa em um sistema fechado e concentra?ao de oleo ao longo do tempo durante uma fermenta?ao de repeti?ao de batelada alimentada em fermentador de 7L.
[008] A Figura 4 e um grafico que mostra a produtividade de biomassa e a melhoria da produtividade de oleo ao longo de uma fermenta?ao de repeti?ao de batelada alimentada em um fermentador de 7L, bem como a produtividade de biomassa constante e a produtividade de oleo das fermenta5oes de batelada alimentada. RFB na legenda representa processo de repeti?ao de batelada alimentada.
[009] A Figura 5 e urn grafico que mostra o impacto da altera?ao do volume de semente residual (20%, 30% e 40%) sobre as produtividades de biomassa e de oleo medias gerais. RFB no eixo representa processo de repeti?ao de batelada alimentada.
DESCRICAO DETALHADA DA INVENCAO
[0010] Sao fomecidos neste documento metodos de cultivo de micro- organismos e metodos de produ?ao de oleo por um processo de repeti?ao de batelada alimentada. Os metodos fomecidos resultam em maior produtividade volumetrica geral da biomassa e do oleo em rela?ao a um processo descontinuo ou de batelada alimentada tipico. Resumidamente, o processo envolve o cultivo de micro-organismos em um metodo de batelada alimentada onde, apos a conclusao da fermenta?ao conforme definido ao se atingir um volume especifico e/ou ao atender os rendimentos de biomassa volumetrica e de oleo, o recipiente e drenado de uma forma que mantenha sua esterilidade e deixe um certo volume de cultura predeterminado (por exemplo, 10% do volume inicial do meio). Meios frescos e estereis sao entao adicionados ao recipiente onde a cultura restante da fermenta?ao anterior e usada como uma semente. Este processo pode ser repetido indefinidamente. A quantidade de cultura restante para uso como uma semente pode variar; no entanto, devem- se considerar as implicasoes entre a biomassa deixada nao colhida e o tempo gasto reduzido na fase de latencia da fermenta?ao subsequente. Na utiliza?ao de um processo de repeti?ao de batelada alimentada, o tempo de reorganiza?ao do fermentador e significativamente reduzido, o que, por sua vez, leva a uma maior produtividade volumetrica geral de biomassa e de oleo; excedendo em muito a de processos descontinuos e de batelada alimentada convencionais. Alem disso, o processo de repeti?ao de batelada alimentada minimiza a necessidade de limpeza e esteriliza?ao, diminuindo, desse modo, os custos operacionais. Alem disso, ha menos dependencia de uma serie de sementes, o que reduz o trabalho e os custos de energia.
Micro-organismos
[0011] Os metodos descritos neste documento incluem extra?ao de lipldios a partir de uma popula?ao de micro-organismos. A popula?ao de micro-organismos descrita neste documento pode ser de algas (por exemplo, microalgas), de fungos (incluindo levedura), de bacterias, ou de protistas. Opcionalmente, o micro-organismo inclui Thraustochytrids da ordem Thraustochytriales, e, mais especificamente, Thraustochytriales do genera Thraustochytrium. Opcionalmente, a popula?ao de micro-organismos inclui Thraustochytriales, como descrito na Patente U.S. n° 5.340.594 e 5.340.742, que estao incorporadas integralmente neste documento por referencia. O micro-organismo pode ser uma especie Thraustochytrium, tal como a especie Thraustochytrium depositada como n° de acesso ATCC PTA-6245 (isto e, ONC-T18) como descrito na Patente U.S. n° 8.163.515, que esta incorporado integralmente neste documento por referencia. Assim, o micro-organismo pode ter uma sequencia de rPvNA 18s que seja pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou mais (por exemplo, incluindo 100%) identica a SEQ ID NO: 1.
[0012] Os micro-organismos para utiliza?ao nos metodos descritos neste documento podem produzir uma variedade de compostos lipidicos. Tal como utilizado neste documento, o termo lipidio inclui fosfolipidios, acidos graxos livres, esteres de acidos graxos, triacilglicerais, esterais e esteres de esterais, carotenoides, xantofilas (por exemplo, oxicarotenoides), hidrocarbonetos, e outros lipidios conhecidos a uma pessoa ordinariamente versada na tecnica. Opcionalmente, os compostos de lipidios incluem lipidios insaturados. Os lipidios insaturados podem incluir lipidios poli-insaturados (isto e, lipidios contendo, pelo menos, 2 liga?oes insaturadas de carbono- carbono, por exemplo, liga?oes duplas) ou lipidios altamente insaturados (isto e, lipidios contendo 4 ou mais liga?oes insaturadas de carbono-carbono). Exemplos de lipidios insaturados incluem acidos graxos poli-insaturados omega 3 e/ou omega 6, como acido docosahexaenoico (isto e, DHA), acido eicosapentaenoico (isto e, EPA) e outros compostos insaturados, poli- insaturados e altamente insaturados de ocorrencia natural.
Processos
[0013] E fomecido neste documento um metodo de cultivo de um micro-organismo. O metodo inclui o fomecimento de um recipiente compreendendo um ou mais micro-organismos e um meio, em que os micro- organismos e o meio formam um volume inicial; o cultivo dos micro- organismos no meio ate que a cultura atinja um indicador de limite, em que o cultivo compreende a introdu?ao de uma ou mais fontes de carbono a cultura e em que a cultura esta em um volume limite quando o indicador de limite e atingido; a colheita de uma porsao do volume limite para deixar um volume residual que seja 40% ou menos que o volume inicial; e adi?ao de um meio fresco ao recipiente numa quantidade para retomar o volume da cultura ao volume inicial.
[0014] Os metodos sao aplicaveis a fermenta?ao em grande escala, bem como a fermenta?ao em pequena escala e a qualquer escala de fermenta?ao entre estas. A fermenta?ao em grande escala, conforme usada neste documento, se refere a fermenta?ao em um fermentador que tern pelo menos cerca de 1.000 L de capacidade volumetrica (isto e, volume util), deixando espa?o adequado para o espa?o livre ("headspace"). A fermenta?ao em pequena escala se refere, geralmente, a fermenta?ao em um fermentador que tern geralmente, no maximo, aproximadamente 100 L de capacidade volumetrica, como 5 L, 10 L, 50 L ou 100 L. Uma vantagem demonstrada do processo de fermenta?ao de batelada alimentada presente e que ele pode ser utilizado para a produ?ao de oleo na escala do fermentador de 5-10 L e e escalavel para qualquer volume, por exemplo, 100 L, 150 L, 250 L, 500 L, 1000 L ou mais, sem limita?ao.
[0015] Como descrito em mais detalhes nos exemplos abaixo, o processo de repeti?ao de batelada alimentada alivia, se nao eliminar, o tempo de reorganiza?ao do recipiente de produ?ao, com o objetivo final de aumentar a produtividade volumetrica. Um exemplo de como a produtividade volumetrica aumenta ao longo dessa fermenta?ao de batelada alimentada tipica esta ilustrado na Figura 1. Assumindo um tempo de reorganiza?ao de 24 horas para o recipiente de produ?ao ser incluido no tempo total do processo, a produtividade de biomassa geral (X) em qualquer momento determinado pode ser calculada como: X (gramas)/Volume util do recipiente (L)/Tempo * 24 (horas/dia) com a unidade final sendo g/L-dia. A produtividade de oleo pode ser calculada de uma forma semelhante como: 6leo (g)/Volume util do recipiente (L)/Tempo * 24 (horas/dia). Como visto na Figura 1, as produtividades de biomassa e de oleo de um processo de batelada alimentada permanecerao constantes ao longo do tempo. Por outro lado, apos o primeiro ciclo da produtividade media do processo de repeti?ao de batelada alimentada aumentar, excedendo a do processo de batelada alimentada uma vez que o tempo de reorganiza?ao nao e exigido, o tempo do ciclo diminuira devido a maior densidade da semente, neste conjunto de dados, uma semente de 20% foi usada.
[0016] Nos metodos fomecidos, o volume residual pode ser de 1% a 40% do volume inicial, por exemplo, de 1% a 5%, 1% a 10%, 1% a 20%, 1% a 30%, 5% a 10%, 5% a 20%, 5% a 30%, 10% a 20%, 10% a 30%, 20% a 40%, ou qualquer volume entre 1% e 40% inclusive do volume inicial. Opcionalmente, o volume residual e de pelo menos cerca de 10% do volume inicial.
[0017] Os metodos fomecidos incluem o cultivo de micro-organismos ate que a cultura atinja um indicador de limite para um parametro. Tal como utilizado neste documento, o termo parametro refere-se a uma variavel nas condi?oes de cultura que podem ser monitoradas e controladas para ajustar o progresso de uma cultura de micro-organismos. Um indicador de limite e um nivel ou concentra?ao pre-selecionada para um determinado parametro. Esses parametros incluem, mas nao estao limitados a volume da cultura, densidade optica (OD), concentra?ao celular, taxa de produ?ao de dioxido de carbono, pH, oxigenio dissolvido (DO), tempo, concentra?ao de nutrientes no meio de cultura, acumulo de subprodutos metabolicos, temperatura, produtividade de biomassa e produtividade de oleo. Qualquer parametro ou combina?ao de parametros adequados sao contemplados para uso como seria entendido pelos versados na tecnica e com base na orienta?ao aqui apresentada. Opcionalmente, o indicador de limite e um nivel ou concentra?ao pre- selecionada de nutriente(s) no meio de cultura. Os nutrientes adequados que podem ser medidos no meio de cultura incluem, mas nao estao limitados a carbono e nitrogenio.
[0018] Os metodos fomecidos opcionalmente incluem a repeti?ao das etapas de (i) cultivo dos micro-organismos no meio ate que a cultura atinja um indicador de limite, em que o cultivo compreende a introdu?ao de uma ou mais fontes de carbono a cultura e em que a cultura esta em um volume limite quando o indicador de limite e atingido; (ii) colheita de uma porsao do volume limite para deixar um volume residual que seja 40% ou menos que o volume inicial; e (iii) adi?ao de meio fresco ao recipiente numa quantidade para retomar o volume da cultura ao volume inicial. Opcionalmente, as etapas sao repetidas duas vezes ou mais. Opcionalmente, as etapas sao repetidas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Quando o processo e repetido varias vezes, como discutido acima, o volume inicial e o volume residual podem variar de cada vez ou a cada rodada. Opcionalmente, os volumes inicial e residual podem permanecer iguais a cada vez ou a cada rodada. A titulo de exemplo, numa primeira fase, o volume residual pode ser 2% do volume inicial e em rodadas sucessivas, o volume residual pode ser 10% do volume inicial. O volume residual nas sucessivas rodadas tambem pode variar, por exemplo, pode ser de 10% do volume inicial na primeira rodada e 20% do volume inicial em outra rodada. Os metodos fomecidos permitem, vantajosamente, que o cultivo seja mantido ao longo de um longo periodo de tempo. Como tal, as etapas do metodo podem ser repetidas desde que se deseje manter a cultura e se continue a colher uma porsao para uso posterior. Opcionalmente, a cultura e mantida por um periodo de horas, dias, semanas ou meses. Opcionalmente, a cultura e mantida por pelo menos 150 a 500 horas. Por exemplo, a cultura pode ser mantida por pelo menos 250 horas. Opcionalmente, a cultura e mantida por uma, duas, tres, quatro ou cinco semanas.
[0019] Opcionalmente, os metodos fomecidos incluem a produ?ao de uma unica semente ou serie de sementes. O cultivo de batelada alimentada tipico de micro-organismos requer a produ?ao de uma cultura de semente produzida de uma forma em etapas chamada de serie de sementes. A serie de sementes serve para constmir o volume e a densidade de uma cultura para inocular em um recipiente de produ?ao limpo e esteril. Uma serie de sementes requer tempo, energia para esteriliza?ao e tambem cria mais oportunidades de contaminasao uma vez que a cultura e transferida entre varios recipientes. O metodo de repeti?ao de batelada alimentada requer esta serie de sementes apenas para inocular no primeiro ciclo. Da mesma forma, o recipiente de produ?ao precisa apenas ser esterilizado para o ciclo inicial. Portanto, e economizado tempo em tomo do recipiente de produ?ao (limpeza e esteriliza?ao) e e economizada energia da limpeza, esteriliza?ao e opera?ao dos recipientes na serie de sementes. Assim, os metodos fomecidos incluem, opcionalmente, uma unica etapa de esteriliza?ao. Alem disso, o risco de contaminasao e diminuido pelas transferences de cultura na serie de sementes para lotes sequenciais. Assim, os metodos fomecidos resultam em contaminasao reduzida em compara?ao aos processos descontinuo ou de batelada alimentada tipicos.
[0020] O uso da cultura em recipiente de produ?ao (isto e, o volume residual) como a semente para lotes sucessivos tambem permite a escolha de sele?ao da porcentagem de sementes a usar sem a necessidade de compra de um grande equipamento ou de fermentadores adicionais na serie de sementes. Por exemplo, um volume de semente de 2% (2000L para um volume inicial de 100.000L em um recipiente de produ?ao com 200.000L de volume util) poderia ser usado para a fermenta?ao descontinua inicial, enquanto todas as seguintes iterates poderiam ser inoculadas com uma semente de 10%. Uma cultura de sementes de 2% elimina a necessidade de um recipiente grande na serie de sementes (isto e, um recipiente com 10.000L de volume util), aliviando os custos/investimento e risco de diminui?ao de contaminasao ja que ha menos uma transference da cultura de sementes. Ao utilizar uma semente de 2%, a fase de latencia de crescimento do micro-organismo e aumentada, levando a menores produtividades volumetricas nos recipientes de produ?ao. No entanto, com lotes sucessivos, a utiliza?ao do metodo de repeti?ao de batelada alimentada sendo inoculado com um volume de semente de 10%, esta fase de latencia e diminuida dramaticamente.
[0021] Os metodos fomecidos incluem ou podem ser usados em conjunto com etapas adicionais para o cultivo de micro-organismos de acordo com metodos conhecidos na tecnica. Por exemplo, um Thraustochytrid, por exemplo, um Thraustochytrium sp., pode ser cultivado de acordo com os metodos descritos nas Publicasoes de Patente U.S. 2009/0117194 ou 2012/0244584, que estao incorporadas integralmente neste documento por referenda para cada etapa dos metodos ou composi?ao usada neles.
[0022] Os micro-organismos sao cultivados em um meio de crescimento (tambem conhecido como "meio de cultura"). Qualquer um de uma variedade de meios pode ser adequado para uso no cultivo dos micro- organismos descritos neste documento. Opcionalmente, o meio fomece varios componentes nutricionais, incluindo uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogenio, para o micro-organismo. O meio para cultura de Thraustochytrid pode incluir qualquer uma de uma variedade de fontes de carbono. Exemplos de fontes de carbono incluem acidos graxos, lipldios, glicerois, triacilglicerois, carboidratos, poliois, a?ucares aminados, e qualquer tipo de biomassa ou fluxo de reslduos. Os acidos graxos incluem, por exemplo, o acido oleico. Os carboidratos incluem, mas nao estao limitados a, glicose, celulose, hemicelulose, frutose, dextrose, xilose, lactulose, galactose, maltotriose, maltose, lactose, glicogenio, gelatina, amido (de milho ou trigo), acetato, m-inositol (por exemplo, derivado de licor de milho), acido galacturonico (por exemplo, derivado de pectina), L-fucose (por exemplo, derivado da galactose), gentiobiose, glucosamina, alfa-D-glicose-l-fosfato (por exemplo, derivados da glicose), celobiose, dextrina, alfa-ciclodextrina (por exemplo, derivado do amido), e a sacarose (por exemplo, de mela?o). Os poliois incluem, mas nao estao limitados a maltitol, eritritol e adonitol. Asucares aminados incluem, mas nao estao limitados a N-acetil-D- galactosamina, N-acetil-D-glucosamina e N-acetil-beta-D-manosamina. Opcionalmente, a fonte de carbono e a glicose. Como mencionado acima, nos metodos fomecidos, a fonte de carbono e fomecida numa alta concentra?ao, por exemplo, pelo menos 200 g/L.
[0023] Opcionalmente, os micro-organismos fomecidos neste documento sao cultivados sob condi?oes que aumentam a biomassa e/ou a produ?ao de um composto de interesse (por exemplo, teor de oleo ou de acido graxo total (TFA)). Thraustochytrids, por exemplo, sao normalmente cultivados em meio salino. Opcionalmente, Thraustochytrids podem ser cultivados em meio com uma concentra?ao de sal de cerca de 0,5 g/L a cerca de 50,0 g /L. Opcionalmente, Thraustochytrids sao cultivados em um meio com uma concentra?ao de sal de cerca de 0,5 g/L a cerca de 35 g/L (por exemplo, de cerca de 18 g/L a cerca de 35 g/L). Opcionalmente, os Thraustochytrids descritos neste documento podem ser cultivados em condi?oes de pouco sal. Por exemplo, os Thraustochytrids podem ser cultivados num meio que tem uma concentra?ao de sal de cerca de 0,5 g/L a cerca de 20 g/L (por exemplo, de cerca de 0,5 g/L a cerca de 15 g/L). O meio de cultura inclui, opcionalmente, NaCl. Opcionalmente, o meio inclui sal marinho natural ou artificial e/ou agua do mar artificial.
[0024] O meio de cultura pode incluir sais de sodio que nao contem cloreto como uma fonte de sodio. Exemplos de sais de sodio sem cloreto adequados para uso de acordo com os presentes metodos incluem, mas nao estao limitados a soda em po (uma mistura de carbonato de sodio e oxido de sodio), carbonato de sodio, bicarbonate de sodio, sulfato de sodio e misturas dos mesmos. Ver, por exemplo, a Patente U.S. n° 5.340.742 e 6.607.900, cujos conteudos estao incorporados neste documento por referenda. Uma por5ao significativa do sodio total pode ser fomecida, por exemplo, por sais que nao contem cloreto, de tal modo que menos de cerca de 100%, 75%, 50% ou 25% do sodio total no meio de cultura seja fomecido pelo cloreto de sodio.
[0025] Opcionalmente, o meio de cultura tem concentra?oes de cloreto inferiores a cerca de 3 g/L, 500 mg/L, 250 mg/L ou 120 mg/L. Por exemplo, o meio de cultura para uso nos metodos fomecidos pode ter concentra?oes de cloreto entre e incluindo cerca de 60 mg/L e 120 mg/L.
[0026] O meio para cultura de Thraustochytrid pode incluir qualquer variedade de fontes de nitrogenio. Fontes de nitrogenio exemplares incluem solu?oes de amonio (por exemplo, NH4 em H20), sais de amonio ou de amina (por exemplo, (NH4)2S04, (NH4)3P04, NH4N03, NH4OOCH2CH3 (NlUAc)), peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamate de sodio, extrato de soja, casaminoacidos e graos de destilador. As concentra?oes das fontes de nitrogenio em um meio adequado variam normalmente entre e incluindo cerca de 1 g/L e cerca de 25 g/L.
[0027] O meio inclui opcionalmente um fosfato, tal como fosfato de potassio ou fosfato de sodio. Os sais inorganicos e micronutrientes no meio podem incluir sulfato de amonio, bicarbonate de sodio, ortovanadato de sodio, cromato de potassio, molibdato de sodio, acido selenoso, sulfato de niquel, sulfato de cobre, sulfato de zinco, cloreto de cobalto, cloreto de ferro, cloreto de manganes, cloreto de calcio, e EDTA. Vitaminas, tais como cloridrato de piridoxina, cloridrato de tiamina, pantotenato de calcio, acido p- aminobenzoico, riboflavina, acido nicotinico, biotina, acido folico e vitamina B12 podem ser incluidas.
[0028] O pH do meio pode ser ajustado para estar entre e incluir 3,0 e 10,0 com o uso de acido ou base, se necessario, e/ou uso da fonte de nitrogenio. Opcionalmente, o meio pode ser esterilizado.
[0029] Geralmente um meio utilizado para a cultura de um micro- organismo e um meio liquido. No entanto, o meio utilizado para a cultura de um micro-organismo pode ser um meio solido. Alem das fontes de carbono e de nitrogenio, tal como discutido neste documento, um meio solido pode conter um ou mais componentes (por exemplo, agar ou agarose) que proporcionam suporte estrutural e/ou permitem que o meio esteja na forma solida.
[0030] As celulas podem ser cultivadas ao longo de um periodo de tempo. Opcionalmente, as celulas sao cultivadas para qualquer lugar a partir de 1 dia a 60 dias. Opcionalmente, a cultura e mantida por um periodo de horas, dias, semanas ou meses. Opcionalmente, a cultura e mantida por pelo menos 150 a 500 horas. Opcionalmente, a cultura e mantida por pelo menos 250 horas. Opcionalmente, a cultura e mantida por uma, duas, tres, quatro ou cinco semanas. O cultivo e opcionalmente realizado em temperaturas desde cerca de 4 °C a cerca de 30 °C, por exemplo, desde cerca de 18 °C a cerca de 28 °C. O cultivo pode incluir a cultura de aera?ao por agita?ao, cultura de agita?ao, cultura estacionaria, cultura descontinua, cultura semicontinua, cultura continua, cultura descontinua em rolamento, cultura em movimentos ondulares, ou semelhantes. O cultivo pode ser realizado utilizando um fermentador por agita?ao convencional, um fermentador de coluna de bolhas (em culturas descontmuas ou continuas), um fermentador com transporte de ar ("airlift") um fermentador em ondas, e similares.
[0031] As culturas podem ser areadas por um ou mais de uma variedade de metodos, incluindo a agita?ao. Opcionalmente, a agita?ao varia de cerca de 100 rpm a cerca de 1000 rpm, por exemplo, desde cerca de 350 rpm a cerca de 600 rpm ou desde cerca de 100 a cerca de 450 rpm. Opcionalmente, as culturas sao areadas usando diferentes velocidades de agita?ao durante as fases de produ?ao de biomassa e durante as fases de produ?ao de lipidios. Altemativa ou adicionalmente, as velocidades de agita?ao podem variar em fun?ao do tipo de recipiente de cultura (por exemplo, formato ou tamanho do frasco).
[0032] A produ?ao de lipidios desejaveis pode ser aumentada pelo cultivo de celulas de acordo com metodos que envolvem uma mudansa de uma ou mais condi?oes da cultura a fim de obter quantidades maiores dos compostos desejaveis. Opcionalmente, as celulas sao cultivadas em primeiro lugar sob condi?oes que maximizam a biomassa, seguido por uma troca de uma ou mais condi?oes de cultura para condi?oes que favore?am a produtividade de lipidios. Condi?oes que sao alteradas podem incluir concentra?ao de oxigenio, razao de C:N, temperatura, e suas combinasoes. Opcionalmente, uma cultura de dois estagios e realizada, na qual um primeiro estagio favorece a produ?ao de biomassa (por exemplo, utilizando condi?oes de oxigenio elevado (por exemplo, em geral, ou em rela?ao ao segundo estagio), baixa razao de C:N, e temperatura ambiente), seguida por um segundo estagio que favorece a produ?ao de lipidios (por exemplo, em que o oxigenio e diminuido, a razao de C:N e aumentada, e a temperatura e diminuida em compara?ao ao primeiro estagio). Em contraste com os metodos anteriormente descritos, os metodos fomecidos permite, a manuten5ao da cultura por um tempo prolongado sob condi?oes com altos niveis de oleo ou de produ?ao de lipidios. Pasteurizagao
[0033] Opcionalmente, a biomassa resultante e pasteurizada para inativar substancias indesejaveis presentes na biomassa. Por exemplo, a biomassa pode ser pasteurizada para inativar substancias que degradam compostos. A biomassa pode estar presente no meio de fermenta?ao ou isolada do meio de fermenta?ao para a etapa de pasteuriza?ao. A etapa de pasteuriza?ao pode ser realizada pelo aquecimento da biomassa e/ou do meio de fermenta?ao a uma temperatura elevada. Por exemplo, a biomassa e/ou o meio de fermenta?ao pode ser aquecido a uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de 95°C (por exemplo, de cerca de 55°C a cerca de 90°C ou de cerca de 65°C a cerca de 80°C). Opcionalmente, a biomassa e/ou o meio de fermenta?ao pode ser aquecido de cerca de 30 minutos a cerca de 120 minutos (por exemplo, de cerca de 45 minutos a cerca de 90 minutos, ou de cerca de 55 minutos a cerca de 75 minutos). A pasteuriza?ao pode ser realizada usando meios de aquecimento adequados, tais como, por exemplo, por inje?ao direta de vapor.
[0034] Opcionalmente, nenhuma etapa de pasteuriza?ao e realizada. Dito de outra forma, o metodo ensinado neste documento opcionalmente carece de uma etapa de pasteuriza?ao. Colheita e Lavagem
[0035] Opcionalmente, a biomassa pode ser colhida de acordo com uma variedade de metodos, incluindo aqueles atualmente conhecidos pelos versados na tecnica. Por exemplo, a biomassa pode ser colhida do meio de fermenta?ao, utilizando, por exemplo, centrifuga?ao (por exemplo, com uma centrifuga de eje?ao de solido) ou filtra?ao (por exemplo, filtra?ao de fluxo cruzado). Opcionalmente, o passo de colheita inclui a utiliza?ao de um agente de precipita?ao para a coleta acelerada da biomassa celular (por exemplo, fosfato de sodio ou cloreto de calcio).
[0036] Opcionalmente, a biomassa e lavada com agua. Opcionalmente, a biomassa pode ser concentrada ate cerca de 20% de solidos. Por exemplo, a biomassa pode ser concentrada a cerca de 5% a cerca de 20% de solidos, de cerca de 7,5% a cerca de 15% de solidos, ou de cerca de solidos ate cerca de 20% de solidos, ou qualquer porcentagem dentro dos intervalos referidos. Opcionalmente, a biomassa pode ser concentrada ate cerca de 20% de solidos ou menos, cerca de 19% de solidos ou menos, cerca de 18% de solidos ou menos, cerca de 17% de solidos ou menos, cerca de 16% de solidos ou menos, cerca de 15% de solidos ou menos, cerca de 14% de solidos ou menos, cerca de 13% de solidos ou menos, cerca de 12% de solidos ou menos, cerca de 11% de solidos ou menos, cerca de 10% de solidos ou menos, cerca de 9% de solidos ou menos, cerca de 8% de solidos ou menos, cerca 7% de solidos ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% de solidos ou menos, cerca de 4% de solidos ou menos, cerca de 3% de solidos ou menos, cerca de 2% de solidos ou menos, ou cerca de 1% de solidos ou menos. Isolamento e Extragao
[0037] Os metodos fomecidos incluem, opcionalmente, o isolamento de acidos graxos poli-insaturados a partir da biomassa ou micro-organismos. O isolamento dos acidos graxos poli-insaturados pode ser realizado usando uma ou mais de uma variedade de metodos, incluindo aqueles atualmente conhecidos a um versado na tecnica. Por exemplo, os metodos de isolamento de acidos graxos poli-insaturados sao descritos na Patente U.S. n° 8.163.515, que esta incorporada integralmente neste documento por referenda. Opcionalmente, o meio nao e esterilizado antes do isolamento dos acidos graxos poli-insaturados. Opcionalmente, a esteriliza?ao compreende um aumento na temperatura. Opcionalmente, os acidos graxos poli-insaturados produzidos pelos micro-organismos e isolados dos metodos fomecidos sao os acidos graxos de cadeia media. Opcionalmente, o um ou mais acidos graxos poli-insaturados sao selecionados do gmpo que consiste em acido alfa linolenico, acido araquidonico, acido docosahexanenoico, acido docosapentaenoico, acido eicosapentaenoico, acido gama-linolenico, acido linoleico, acido linolenico, e as suas combinasoes.
Produtos
[0038] O oleo, incluindo acidos graxos poli-insaturados (PUFAs) e outros lipidios produzidos de acordo com o metodo descrito neste documento, pode ser utilizado em qualquer de uma variedade de aplica?oes explorando suas propriedades biologicas, nutricionais ou quimicas. Assim, os metodos fomecidos incluem, opcionalmente, o isolamento de oleo a partir da porsao colhida do volume limite. Opcionalmente, o oleo e usado para produzir combustivel, por exemplo, biocombustivel. Opcionalmente, o oleo pode ser usado em produtos farmaceuticos, suplementos alimentares, aditivos para alimenta?ao animal, produtos cosmeticos e similares. Os lipidios produzidos de acordo com os metodos descritos neste documento tambem podem ser usados como intermediaries na produ?ao de outros compostos.
[0039] A titulo de exemplo, o oleo produzido pelos micro-organismos cultivados utilizando os metodos fomecidos pode compreender acidos graxos. Opcionalmente, os acidos graxos sao selecionados do grupo que consiste em acido alfa linolenico, acido araquidonico, acido docosahexanenoico, acido docosapentaenoico, acido eicosapentaenoico, acido gama-linolenico, acido linoleico, acido linolenico e suas combinasoes. Opcionalmente, o oleo compreende triglicerides. Opcionalmente, o oleo compreende acidos graxos selecionados do gmpo consistindo em acido palmitico (Cl6:0), acido miristico (C14:0), acido palmitoleico (C16:l(n-7)), acido cis-vacenico (C18:l(n-7)), acido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), acido docosahexaenoico (C22:6(n-3)), e combinasoes dos mesmos.
[0040] Opcionalmente, os lipidios produzidos de acordo com os metodos descritos neste documento podem ser incorporados em um produto final (por exemplo, um alimento ou suplemento alimentar, uma formula infantil, urn produto farmaceutico, urn combustivel, etc.) Suplementos alimentares ou alimenta?ao adequados nos quais os lipidios podem ser incorporados incluem bebidas, tais como leite, agua, bebidas esportivas, bebidas energeticas, chas e sucos; confec?oes, como balas, geleias e biscoitos; alimentos e bebidas contendo gordura, tais como produtos lacteos; produtos alimenticios processados, tais como o arroz aguado (ou mingau); formulas infantis; cereais do cafe da manha; ou semelhantes. Opcionalmente, um ou mais lipidios produzidos podem ser incorporados em um suplemento dietetico, como, por exemplo, uma vitamina ou multivitaminas. Opcionalmente, um lipidio produzido de acordo com o metodo descrito neste documento pode ser incluido em um suplemento alimentar e, opcionalmente, pode ser diretamente incorporado em um componente de alimenta?ao ou alimento (por exemplo, um suplemento alimentar).
[0041] Exemplos de alimentos em que os lipidios produzidos pelos metodos descritos neste documento podem ser incorporados incluem alimentos para animais, como alimentos para gatos; alimentos para caes e similares; alimentos para peixes de aquario, peixes cultivados ou crustaceos, etc.; alimentos para animais de fazendas (incluindo gado e peixe ou crustaceos criados em aquacultura). Alimentos ou material para alimenta?ao em que os lipidios produzidos de acordo com os metodos descritos neste documento podem ser incorporados sao preferencialmente aceitaveis para o organismo que e o receptor a que se destinam. Este alimento ou material de alimenta?ao pode ter quaisquer propriedades fisicas conhecidas atualmente para um material alimentar (por exemplo, solido, liquido, macio).
[0042] Opcionalmente, um ou mais dos compostos produzidos (por exemplo, PUFAs) podem ser incorporados em um produto nutraceutico ou farmaceutico. Exemplos de tais produtos nutraceuticos e farmaceuticos incluem varios tipos de comprimidos, capsulas, bebidas, etc. Opcionalmente, o produto nutraceutico ou farmaceutico e adequado para aplica?ao topica. As formas de dosagem podem incluir, por exemplo, capsulas, oleos, granulos, granulados, pos, comprimidos, pilulas, pastilhas ou similares.
[0043] Os lipidios ou oleos produzidos de acordo com os metodos descritos neste documento podem ser incorporados em produtos, tal como descrito neste documento, em combina?ao com qualquer um de uma variedade de outros agentes. Por exemplo, tais compostos podem ser combinados com um ou mais aglutinantes ou agentes de preenchimento, agentes quelantes, pigmentos, sais, surfactantes, hidratantes, modificadores de viscosidade, espessantes, emolientes, fragrancias, conservantes, etc. ou qualquer combina?ao dos mesmos.
[0044] Sao divulgados materials, composisoes e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em prepara?ao para ou sao produtos dos metodos e composi?oes divulgados. Esses e outros materials sao divulgados neste documento, e compreende-se que quando combinasoes, subconjuntos, interasoes, grupos, etc. destes materials sao divulgados que, embora referenda especifica das varias combinasoes individuals e coletivas e permutasoes desses compostos nao possam ser explicitamente divulgadas, cada uma e especificamente contemplada e descrita neste documento. Por exemplo, se um metodo e divulgado e discutido e um certo numero de modificasoes que podem ser feitas a uma serie de moleculas, incluindo o metodo sao discutidos, cada uma e todas as combinasoes e permutasoes do metodo, e as modificasoes que sao possiveis sao especificamente contempladas, a menos especificamente indicado em contrario. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combina?ao destes tambem e especificamente contemplado e divulgado. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta divulga?ao, incluindo, mas nao se limitando a, etapas nos metodos usando as composi?oes divulgadas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas, compreende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com qualquer metodo especifico ou combina?ao de etapas de metodo dos metodos divulgados, e que cada tal combina?ao ou subconjunto de combinasoes e especiflcamente contemplada e deve ser considerada divulgada.
[0045] Como utilizado ao longo deste documento, os intervalos (por exemplo, 1-10) e as references a cerca de um determinado valor (por exemplo, cerca de 1 ou cerca de 10) incluem o valor ou valores citados (por exemplo, 1 e/ou 10).
[0046] As publica?oes citadas neste documento e os materials citados sao especiflcamente incorporados em suas totalidades por referenda.
[0047] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar ainda certos aspectos dos metodos e composi?oes aqui descritos e nao se destinam a limitar o escopo das reivindica?oes.
EXEMPLOS Exemplo 1. Fermenta^ao de Repeti^ao de Batelada Alimentada para Produ^ao de Biomassa e Oleo
[0048] No campo da produ?ao de oleo microbiano, a fermenta?ao heterotrofica (escura) e geralmente considerada superior ao cultivo microbiano autotrofico em termos de eflciencia do processo e rendimento do produto. No entanto, e muitas vezes impedida pelo maior custo de capital fixo (o custo da constru?ao de uma instala?ao de fermenta?ao baseada em recipientes e geralmente muito maior do que o custo flnanceiro de sistemas de cultivo dos tipos tanque aberto e condutor). Ao se usar um processo de produ?ao de repeti?ao de batelada alimentada, pode-se obter maiores produtividades volumetricas gerais enquanto diminui-se os custos operacionais. Isto e conseguido minimizando o tempo de reorganiza?ao do recipiente de produ?ao e minimizando o uso de energia associado a uma serie de semente e a esteriliza?ao do recipiente de produ?ao. Isso significa uma melhor utiliza?ao dos investimentos de capital flxo (fermentadores e equipamentos associados) e maior capacidade de produ?ao anual. Ha tambem um investimento de capital reduzido uma vez que apenas uma serie de sementes e usada.
[0049] A Figura 1 mostra a progressao de uma concentra?ao de biomassa em um sistema fechado e concentra?ao de oleo ao longo do tempo durante uma fermenta?ao de repeti?ao de batelada alimentada em fermentador de 30L. Para este experimento, 10% de volume residual foi empregado usando glicose como a fonte de carbono. Na Figura 2, um tempo de reorganiza?ao de lote-a-lote de 12 horas foi usado para calcular as produtividades de cada opera?ao de batelada alimentada independente, e o mesmo tempo de reorganiza?ao de 12 horas foi usado para calcular o primeiro lote da opera?ao de repeti?ao de batelada alimentada. Como pode ser visto na Figura 2, as produtividades de biomassa e de oleo de um processo de batelada de alimentada tipico permanecerao constantes ao longo do tempo porque cada processo de batelada alimentada subsequente e independentemente operado a partir do lote anterior com um tempo de reorganiza?ao fixo embutido entre cada processo de batelada alimentada. Por outro lado, apos o primeiro ciclo da produtividade media do processo de repeti?ao de batelada alimentada aumentar, excedera a do processo de batelada alimentada uma vez que o tempo de reorganiza?ao nao e exigido, e o tempo do ciclo diminuira devido a maior densidade da semente.
[0050] A Figura 3 mostra a progressao de uma concentra?ao de biomassa em um sistema fechado e concentra?ao de oleo ao longo do tempo durante uma fermenta?ao de repeti?ao de batelada alimentada em fermentador de 7L. Para este experimento, 20% de volume residual foi empregado usando glicose como a fonte de carbono. Na Figura 4, um tempo de reorganiza?ao de lote-a-lote de 12 horas foi usado para calcular as produtividades de cada opera?ao de batelada alimentada independente, e o mesmo tempo de reorganiza?ao de 12 horas foi usado para calcular o primeiro lote da opera?ao de repeti?ao de batelada alimentada. Como pode ser visto na Figura 4, as produtividades de biomassa e de oleo de um processo de batelada alimentada tipico permanecerao constantes ao longo do tempo porque cada processo de batelada alimentada subsequente e independentemente operado a partir do lote anterior com um tempo de reorganiza?ao fixo embutido entre eles. Por outro lado, apos o primeiro ciclo da produtividade media do processo de repeti?ao de batelada alimentada aumentar, excedera a do processo de batelada alimentada uma vez que o tempo de reorganiza?ao nao e exigido, e o tempo do ciclo diminuira devido a maior densidade da semente.
[0051] As fermenta5oes de repeti?ao de batelada alimentada com diferentes volumes de semente residual, isto e, 20%, 30% e 40%, foram realizadas ao longo de um periodo de 320 horas, cada uma atingindo um total de seis operates repetidas. Como pode ser visto na Figura 5, todas as fermenta5oes de repeti?ao de batelada alimentada geraram produtividades gerais de biomassa e oleo mais altas em compara?ao aquelas da opera?ao de batelada alimentada unica. O aumento do volume residual de sementes de 20% para 30% resultou no aumento significativo nas produtividade medias; enquanto que um aumento adicional no volume residual de sementes de 30% para 40% nao trouxe nenhuma melhoria adicional da produtividade. Isso mostrou as implica?oes entre a biomassa nao colhida (isto e, usada como volume residual para as sementes) e o tempo gasto na fase de latencia da fermenta?ao subsequente. Sob estas condi?oes, o ponto de compensa?ao ideal e de aproximadamente 30% do volume residual de sementes.

Claims (15)

1. Metodo de repeti?ao de batelada alimentada de cultivo de um micro-organismo produtor de oleo Thraustochytriaceae, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fomecimento de um recipiente compreendendo um ou mais micro-organismos produtores de oleo Thraustochytriaceae e um meio, em que os micro-organismos e o meio formam um volume inicial; (b) cultivo dos micro-organismos no meio no recipiente por: (i) cultivo dos micro-organismos produtores de oleo Thraustochytriaceae sob condi?oes que favorecem produ?ao de biomassa; e (ii) cultivo de micro-organimos produtores de oleo Thraustochytriaceae da etapa (i) sob condi?oes que favorecem produ?ao de lipideos ate a cultura completar a fermenta?ao e alcazar um volume indicador de limite quando a fermenta?ao for completada, em que o cultivo compreende a introdu?ao de uma ou mais fontes de carbono a cultura; (c) colheita de uma porsao do volume limite do recipiente para deixar um volume residual no recipiente que seja entre 20% e 40% do volume inicial; (d) adi?ao de meio fresco ao recipiente em uma quantidade para retomar o volume da cultura ao volume inicial; e repeti?ao das etapas (b), (c) e (d).
2. Metodo de acordo com a reivindica?ao 1, caracterizado pelo fato de que o volume residual e de 20% a 30% do volume inicial.
3. Metodo de acordo com a reivindica?ao 1, caracterizado pelo fato de que o volume residual e de 30% a 40% do volume inicial.
4. Metodo de acordo com a reivindica?ao 1, caracterizado pelo fato de que o volume residual e de pelo menos 30% do volume inicial.
5. Metodo de acordo com qualquer uma das reivindica?oes 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente durante a etapa (b) (ii) a detec?ao do volume da cultura, densidade optica (OD), oxigenio dissolvido (DO), concentra?ao celular, taxa de produ?ao de dioxido de carbono, pH, tempo, concentra?ao de nutriente no meio de cultura, produtividade de biomassa, produtividade de oleo, ou qualquer combina?ao dos mesmos.
6. Metodo de acordo com a reivindica?ao 5, caracterizado pelo fato de que a concentra?ao de nutriente no meio de cultura e detectada, e em que o nutriente e carbono ou nitrogenio.
7. Metodo de acordo com qualquer uma das reivindica?oes 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a repeti?ao das etapas (b), (c) e (d) duas ou mais vezes.
8. Metodo de acordo com a reivindica?ao 7, caracterizado pelo fato de que as etapas sao repetidas 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes.
9. Metodo de acordo com qualquer uma das reivindicasoes 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o isolamento de oleo a partir da porsao colhida do volume limite.
10. Metodo de acordo com a reivindica?ao 9, caracterizado pelo fato de que o oleo compreende acidos graxos selecionados do grupo consistindo em acido alfa-linolenico, acido araquidonico, acido docosahexaenoico, acido docosapentaenoico, acido eicosapentaenoico, acido gama-linolenico, acido linoleico, acido linolenico, e combina5oes dos mesmos.
11. Metodo de acordo com a reivindica?ao 9, caracterizado pelo fato de que o oleo compreende triglicerides.
12. Metodo de acordo com a reivindica?ao 9, caracterizado pelo fato de que o oleo compreende acidos graxos selecionados do grupo consistindo em acido palmitico (C16:0), acido miristico (C14:0), acido palmitoleico (C16:l(n-7)), acido cis-vacenico (C18:l(n-7)), acido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), acido docosahexaenoico (C22:6(n-3)), e combina5oes dos mesmos.
13. Metodo de acordo com qualquer uma das reivindicasoes 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo e da familia Thraustochytriaceae.
14. Metodo de acordo com a reivindica?ao 13, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo e do genero Thraustochytrium.
15. Metodo de acordo com a reivindica?ao 14, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo tern n° de acesso ATCC PTA-6245.
BR112017003558-8A 2014-10-16 2015-10-12 Método de repetição de batelada alimentada de cultivo de um microorganismo BR112017003558B1 (pt)

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