CN109136308B - 一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液 - Google Patents

一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液 Download PDF

Info

Publication number
CN109136308B
CN109136308B CN201811125667.9A CN201811125667A CN109136308B CN 109136308 B CN109136308 B CN 109136308B CN 201811125667 A CN201811125667 A CN 201811125667A CN 109136308 B CN109136308 B CN 109136308B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
liquid
polysialic acid
culture medium
improving
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811125667.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109136308A (zh
Inventor
吴金勇
陈祥松
李翔宇
刘洋
姚建铭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co ltd filed Critical Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co ltd
Priority to CN201811125667.9A priority Critical patent/CN109136308B/zh
Publication of CN109136308A publication Critical patent/CN109136308A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109136308B publication Critical patent/CN109136308B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液，涉及发酵工程技术领域。本发明实施例的提高发酵产聚唾液酸的方法是在液体发酵培养基中接种产聚唾液酸菌种的种子培养液进行发酵，液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25‑35:1，发酵过程维持pH 6‑7，并在液体发酵培养基中的碳源耗完后，以2‑3g/(L·h)的速率补充碳源；每隔48‑60h排出85％‑95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基，该方法工序简单，生产效率高。本发明实施例的发酵液是采用上述的提高发酵产聚唾液酸的方法得到，其中聚唾液酸累计含量高。

Description

一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，且特别涉及一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液。
背景技术
2017年5月31日，国家卫计委审核并批准了包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)在内的10种新食品原料的使用。Neu5Ac是细胞信息传递的第一接触位点，且其分子结构具有多样性，因此Neu5Ac参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程。此外，Neu5Ac能调节IgG的抗炎活性，增强婴儿免疫力，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，促进婴儿大脑发育的功能，所以N-乙酰神经氨酸及其生产引起了较多的关注和研究。
目前N-乙酰神经氨酸的生产方法包括：天然产物提取、化学合成、生物酶催转化、基因工程菌直接发酵及聚唾液酸发酵水解法。绝大多数天然产物中Neu5Ac含量低，而且组分非常复杂，从中提取Neu5Ac伴随着复杂的过程，回收率低，因此天然产物提取很难满足大规模生产的要求。化学合成法由于繁琐的基团保护、去保护等操作，以及手性异构副产物的存在，该方法亦无法应用于工业生产。生物酶催转化及基因工程菌直接发酵涉及转基因问题，亦难以通过食品相关法律批准，更无法应用于婴幼儿健康领域。
聚唾液酸发酵水解法是采用聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)为原料发酵水解制备N-乙酰神经氨酸，其属于天然产物，消费者比较容易认可，且已经通过中国官方认可，具有较高的产业化价值。因此制备N-乙酰神经氨酸，先要制得聚唾液酸。聚唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)以α-2，8和(或)α-2，9键连接的同聚物，是少数细菌的荚膜多糖的主要组分。1957年，Barry和Goebel首先在E.coli K235中发现聚唾液酸，后来人们相继在其它菌株中发现聚唾液酸。目前聚唾液酸的发酵效率一直是困扰N-乙酰神经氨酸产业化的关键问题。
发酵可分为连续发酵、分批发酵和补料分批发酵。连续发酵可以大幅提高生产强度，但是容易染菌、菌株退化、设备投资大和产物浓度低等确定。分批发酵的人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期较长，生产效率较低。补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但是由于有害代谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏。
鉴于此，需要一种提高发酵产聚唾液酸的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高发酵产聚唾液酸的方法，工序简单，生产效率高。
本发明的另一目的在于提供一种发酵液，聚唾液酸累积含量高。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种提高发酵产聚唾液酸的方法，其包括以下步骤：
在液体发酵培养基中接种产聚唾液酸菌种的种子培养液进行发酵，液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1，发酵过程维持pH 6-7，并在液体发酵培养基中的碳源耗完后，以2-3g/(L·h)的速率补充碳源；每隔48-60h排出85％-95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基。
进一步地，在本发明较佳实施例中，产聚唾液酸菌种选自产聚唾液酸的大肠杆菌中的至少一种；产聚唾液酸菌种为大肠杆菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2018103。
进一步地，在本发明较佳实施例中，种子培养液的制备方法包括以下过程：
取冻存的产聚唾液酸菌种接种至固体LB培养基上，于35-40℃培养；
待长出单菌落后，挑取单菌落，接种到液体LB培养基中，于150-250rpm、35-40℃培养过夜，得到一级种子液；
将一级种子液按0.8％-1.2％的接种量接到液体LB培养基中，于150-250rpm、35-40℃培养5-7h，得到二级种子液。
进一步地，在本发明较佳实施例中，固体LB培养基含有：蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L、琼脂15-25g/L，pH7.0±0.2；液体LB培养基含有：蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L，pH7.0±0.2。
进一步地，在本发明较佳实施例中，液体发酵培养基的成分包括：山梨醇15-25g/L、玉米浆干粉2-4g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化铵4-8g/L、N-乙酰氨基葡萄糖4-8g/L、B族维生素溶液8-1.2mL/L以及微量元素溶液8-1.2mL/L。
进一步地，在本发明较佳实施例中，B族维生素溶液含有：VB10.4-0.7g/L、VB5 3-3.5g/L、VBH 0.004-0.007g/L以及VB12 0.12-0.18g/L；
微量元素溶液含有：FeSO4 1.5-2.5g/L、KIO3 0.05-0.07g/L，MnCl20.5-1g/L、CoCl2 0.15-0.25g/L、CrCl3 0.05-0.1g/L、ZnSO4 0.05-1.2g/L、Na2MoO4 0.02-0.04g/L以及H3BO3 1.5-2g/L。
进一步地，在本发明较佳实施例中，新鲜液体培养基的成分包括：玉米浆干粉2-4g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化铵4-8g/L、N-乙酰氨基葡萄糖4-8g/L、B族维生素溶液8-1.2mL/L以及微量元素溶液8-1.2mL/L。
进一步地，在本发明较佳实施例中，发酵条件为：接种前，控制初始通气量为0.8-1.2vvm，初始转速为150-250rpm；接种后，通过调整转速及通气量维持溶解氧高于30％、发酵温度为35-40℃。
进一步地，在本发明较佳实施例中，在发酵开始后的第5-10h，添加CTAB至液体发酵培养基中至终浓度为150-250mg/L。
本发明还提出一种发酵液，其采用上述的提高发酵产聚唾液酸的方法得到。
本发明实施例的提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液的有益效果是：本发明实施例的提高发酵产聚唾液酸的方法是在液体发酵培养基中接种产聚唾液酸菌种的种子培养液进行发酵，液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1，发酵过程维持pH 6-7，并在液体发酵培养基中的碳源耗完后，以2-3g/(L·h)的速率补充碳源；每隔48-60h排出85％-95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基，该方法工序简单，生产效率高。本发明实施例的发酵液是采用上述的提高发酵产聚唾液酸的方法得到，其中聚唾液酸累计含量高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为对比例1中不同发酵时间的发酵产物的检测结果线形图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液进行具体说明。
本发明实施例提供一种提高发酵产聚唾液酸的方法，其包括以下步骤：
在液体发酵培养基中接种产聚唾液酸菌种的种子培养液进行发酵，液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1，发酵过程维持pH 6-7，一般是用质量浓度15％-20％的氨水调节pH，并在液体发酵培养基中的碳源耗完后，以2-3g/(L·h)的速率补充碳源；每隔48-60h排出85％-95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基，可选的，每隔60h排出90％体积的发酵液，同时补入90％体积的新鲜液体培养基。
本实施例采用反复分批补料发酵，是指在补料分批发酵的基础上，周期性地放出部分含有目标产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜液体培养基的发酵方法。反复分批发酵可以省去批次间种子培养、接种、清洗、灭菌和发酵初始的延迟期等时间，较分批发酵和补料分批发酵相比生产强度大大提高，发酵过程中通过放掉部分发酵液再补入新鲜液体培养基，不仅可以补充养分和前体，而且代谢有害物会被稀释，从而有利于产物的继续合成。反复分批发酵工艺的应用可以起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用，改善了菌体的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定。
本实施例中，液体发酵培养基和新鲜液体培养基的成分大致相同，区别在于新鲜液体培养基不含碳源，而是另外以一定的速率持续补充碳源；碳源可选为山梨醇。
本实施例中，发酵条件为：接种前，控制初始通气量为0.8-1.2vvm，初始转速为150-250rpm；接种后，通过调整转速及通气量维持溶解氧DO高于30％、发酵温度为35-40℃。
在发酵开始后的第5-10h(接种时记为第0h)，添加CTAB至液体发酵培养基中至终浓度为150-250mg/L。
本实施例中，产聚唾液酸菌种选自产聚唾液酸的大肠杆菌中的至少一种，比如产聚唾液酸菌种为大肠杆菌CCTCC M 2018103，该大肠杆菌已于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏编号为CCTCCNO：M 2018103；分类学命名：Escherichia coli CASOV-8。
本实施例中，种子培养液的制备方法包括以下过程：
(1)菌种活化：取冻存的产聚唾液酸菌种接种至固体LB培养基上，于35-40℃培养。其中，固体LB培养基含有：蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L、琼脂15-25g/L，pH7.0±0.2。
(2)一级种子的培养：待长出单菌落后，挑取单菌落，接种到液体LB培养基中，于150-250rpm、35-40℃培养过夜，得到一级种子液。其中，液体LB培养基含有：蛋白胨8-12g/L、酵母浸膏粉4-6g/L、氯化钠8-12g/L，pH7.0±0.2。
(3)二级种子的培养：将一级种子液按0.8％-1.2％的接种量接到液体LB培养基中，于150-250rpm、35-40℃培养5-7h，得到二级种子液，即为种子培养液。
本实施例中，液体发酵培养基的成分包括：山梨醇15-25g/L、玉米浆干粉2-4g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化铵4-8g/L、N-乙酰氨基葡萄糖4-8g/L、B族维生素溶液8-1.2mL/L以及微量元素溶液8-1.2mL/L；液体发酵培养基中还可以包括0.8-1.2mL/L的泡敌消泡剂。
新鲜液体培养基的成分包括：玉米浆干粉2-4g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化铵4-8g/L、N-乙酰氨基葡萄糖4-8g/L、B族维生素溶液8-1.2mL/L以及微量元素溶液8-1.2mL/L；新鲜液体培养基中还包括0.8-1.2mL/L的泡敌消泡剂。
其中，B族维生素溶液含有：VB1 0.4-0.7g/L、VB5 3-3.5g/L、VBH 0.004-0.007g/L以及VB12 0.12-0.18g/L；微量元素溶液含有：FeSO4 1.5-2.5g/L、KIO3 0.05-0.07g/L，MnCl20.5-1g/L、CoCl20.15-0.25g/L、CrCl3 0.05-0.1g/L、ZnSO4 0.05-1.2g/L、Na2MoO40.02-0.04g/L以及H3BO3 1.5-2g/L。
本发明实施例还提供一种发酵液，其采用上述的提高发酵产聚唾液酸的方法得到。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种发酵液，其按照以下的制备方法制得：
1、菌种活化：取冻存的产聚唾液酸的大肠杆菌(保藏编号CCTCC NO：M 2018103)菌种划线接种至固体LB培养基上，37℃培养。其中，固体LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
2、一级种子的培养：待长出单菌落后，挑取单菌落，接种到含50mL液体LB培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养过夜，得到一级种子液。其中，液体LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0。
3、二级种子的培养：将一级种子液按1％的接种量接到含50mL液体种子培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养6h，得到二级种子液。
4发酵罐发酵：在5L规格的发酵罐中装入液体发酵培养基3L，将二级种子液100mL接种至发酵罐中培养。其中，液体发酵培养基的成分包括如下：山梨醇20g/L、玉米浆干粉3g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化铵6g/L、N-乙酰氨基葡萄糖6g/L、B族维生素溶液1mL/L以及微量元素溶液1mL/L、泡敌1mL/L；B族维生素溶液含有：VB1 0.5g/L、VB5 3.2g/L、VBH 0.006g/L以及VB12 0.15g/L；微量元素溶液含有：FeSO4的浓度为2g/L、KIO3的浓度为0.06g/L，MnCl2的浓度为0.8g/L、CoCl2的浓度为0.2g/L、CrCl3的浓度为0.08g/L、ZnSO4的浓度为0.09g/L、Na2MoO4的浓度为0.03g/L以及H3BO3的浓度为1.75g/L。
发酵条件：接种前，控制初始通气量1vvm，初始转速200rpm；接种后，根据调整转速及通气量维持DO高于30％、发酵温度37℃。发酵过程用10％的氨水维持pH6.4，当液体发酵培养基中山梨醇耗完后，以2.5g/(L*h)的速率进行补充山梨醇。
此外，在发酵过程第8h小时(接种时记为第0h)中在添加CTAB至液体发酵培养基中，终浓度为200mg/L。
5、反复分批补料发酵：发酵开始后，每隔48h排出90％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基，即将90％发酵液替换为新鲜液体培养基。其中，新鲜液体培养基的成分包括：玉米浆干粉3g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化铵6g/L、N-乙酰氨基葡萄糖6g/L、B族维生素溶液1mL/L以及微量元素溶液1mL/L、泡敌1mL/L。
取每批排出的发酵液，检测其OD600和聚唾液酸PSA含量，聚唾液酸的检测方法如下：
将发酵液离心去除菌体得到清液，将清液稀释一定倍数，各取2mL稀释后的清液及0.1M稀盐酸混合，密闭混匀于85℃水浴3h，反应结束后冷却，采用高效液相色谱(HPLC)检测法检测：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic Analysis Column(300×7.8mm)；柱温60℃；流动相5mmol硫酸，流速0.6ml/min；检测波长210nm。
实施例2
本实施例提供一种发酵液，该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同，不同之处在于：
每隔60h，排出90％体积的发酵液，并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液，检测其OD600和聚唾液酸含量。
实施例3
本实施例提供一种发酵液，该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同，不同之处在于：
每隔72h，排出90％体积的发酵液，并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液，检测其OD600和聚唾液酸含量。
实施例4
本实施例提供一种发酵液，该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同，不同之处在于：
每隔60h，排出95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液，检测其OD600和聚唾液酸含量。
实施例5
本实施例提供一种发酵液，该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同，不同之处在于：
每隔60h，排出85％体积的发酵液，并补入相同体积、不含甘油的新鲜液体培养基。
取每批排出的发酵液，检测其OD600和聚唾液酸含量。
统计实施例1-5的检测结果：
实施例1-3分别在发酵48h、60h、72h后，将90％发酵液替换为新鲜液体培养基(不含山梨醇)，然后继续分批补料发酵，每个实施例得到2批发酵液；实施例2、4、5分别是在发酵60h后，分别将发酵液的90％、95％、85％替换为新鲜液体培养基(不含山梨醇)，每个实施例得到2批发酵液。实施例1-5排出的发酵液检测结果如下：
Figure BDA0001812322610000101
由上表可知，每隔48-60h排出85％-95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基可以显著提高PSA的合成效率，尤其是每隔60h排出90％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基，发酵液PSA累计净增长最高，且PSA合成速率很高。
实施例6
本实施例提供一种发酵液，该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同，不同之处在于：
分别在发酵60h、120h、180h(每隔60h)后，将发酵液的90％替换为新鲜液体培养基(不含山梨醇)，然后继续分批补料发酵。
取每批排出的发酵液，检测其OD600和聚唾液酸PSA含量，发酵240h(共4批发酵液)，PSA累计产量59.2g/L,合成速率2.96g/L*12h。
对比例1
本对比例提供一种发酵液，该发酵液的制备方法与实施例1中的制备方法大致相同，不同之处在于：
发酵过程中，未进行反复分批补料发酵，持续发酵培养72h放罐。培养期间，于不同时间点(发酵第12h、24h、36h、48h、60h、72h)，取发酵产物，检测其OD600和聚唾液酸含量，结果如图1所示。
根据图1可知，发酵72h，PSA产量15.3g/L，合成速率2.55g/L*12h。
通过实施例1-6和对比例1的发酵液PSA含量，每隔48-60h排出85％-95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基可以显著提高PSA的合成效率，且对比例1的PSA合成速率随着发酵时间延长会呈下降的趋势。
综上所述，本发明实施例的提高发酵产聚唾液酸的方法的工序简单，生产效率高；本发明实施例的发酵液的聚唾液酸累计含量高。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种提高发酵产聚唾液酸的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
在液体发酵培养基中接种产聚唾液酸菌种的种子培养液进行发酵，所述液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35:1，发酵过程维持pH 6-7，并在所述液体发酵培养基中的碳源耗完后，以2-3 g/（L·h）的速率补充碳源，所述碳源为山梨醇；每隔48-60 h排出85%-95%体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基；在发酵开始后的第5-10h，添加CTAB至液体发酵培养基中至终浓度为150-250 mg/L；
所述液体发酵培养基的成分包括：山梨醇15-25 g/L、玉米浆干粉2-4 g/L、磷酸氢二钾4-6 g/L、硫酸镁0.4-0.6 g/L、氯化铵4-8 g/L、N-乙酰氨基葡萄糖4-8 g/L、B族维生素溶液8-1.2mL/L以及微量元素溶液8-1.2 mL/L；
所述新鲜液体培养基的成分包括：玉米浆干粉2-4 g/L、磷酸氢二钾4-6 g/L、硫酸镁0.4-0.6 g/L、氯化铵4-8 g/L、N-乙酰氨基葡萄糖4-8 g/L、B族维生素溶液 8-1.2mL/L以及微量元素溶液8-1.2 mL/L；
所述产聚唾液酸菌种为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的提高发酵产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述种子培养液的制备方法包括以下过程：
取冻存的产聚唾液酸菌种接种至固体LB培养基上，于35-40 ℃培养；
待长出单菌落后，挑取单菌落，接种到液体LB培养基中，于150-250 rpm、35-40 ℃培养过夜，得到一级种子液；
将一级种子液按0.8%-1.2%的接种量接到液体LB培养基中，于150-250 rpm、35-40 ℃培养5-7 h，得到二级种子液。
3.根据权利要求2所述的提高发酵产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述固体LB培养基含有：蛋白胨8-12 g/L、酵母浸膏粉4-6 g/L、氯化钠8-12 g/L、琼脂15-25 g/L，pH7.0±0.2；所述液体LB培养基含有：蛋白胨8-12 g/L、酵母浸膏粉4-6 g/L、氯化钠8-12 g/L，pH7.0±0.2。
4.根据权利要求1所述的提高发酵产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述B族维生素溶液含有：VB1 0.4-0.7 g/L、VB5 3-3.5 g/L、VBH 0.004-0.007 g/L以及VB12 0.12-0.18 g/L；
所述微量元素溶液含有：FeSO4 1.5-2.5 g/L、KIO3 0.05-0.07 g/L，MnCl2 0.5-1 g/L、CoCl2 0.15-0.25 g/L、CrCl3 0.05-0.1 g/L、ZnSO4 0.05-1.2 g/L、Na2MoO4 0.02-0.04 g/L以及H3BO3 1.5-2 g/L。
5.根据权利要求1所述的提高发酵产聚唾液酸的方法，其特征在于，发酵条件为：接种前，控制初始通气量为0.8-1.2 vvm，初始转速为150-250 rpm；接种后，通过调整转速及通气量维持溶解氧高于30%、发酵温度为35-40 ℃。
6.一种发酵液，其特征在于，其采用如权利要求1至5中任一项所述的提高发酵产聚唾液酸的方法制得。
CN201811125667.9A 2018-09-26 2018-09-26 一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液 Active CN109136308B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811125667.9A CN109136308B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811125667.9A CN109136308B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109136308A CN109136308A (zh) 2019-01-04
CN109136308B true CN109136308B (zh) 2021-01-26

Family

ID=64812740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811125667.9A Active CN109136308B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109136308B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008052630A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Dsm Ip Assets B.V. Semi-continuous fermentation process for pantothenate production
CN101348806A (zh) * 2008-09-04 2009-01-21 江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司 2-酮基-d-葡萄糖酸半连续发酵工艺
CN106604998A (zh) * 2014-10-16 2017-04-26 玛拉可再生能源公司 重复补料分批培养方法
CN106687605A (zh) * 2014-10-16 2017-05-17 玛拉可再生能源公司 半连续培养方法
CN107735495A (zh) * 2015-05-05 2018-02-23 罗格斯技术有限责任公司 以高产量和滴度产生鼠李糖脂的半连续工艺

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008052630A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Dsm Ip Assets B.V. Semi-continuous fermentation process for pantothenate production
CN101348806A (zh) * 2008-09-04 2009-01-21 江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司 2-酮基-d-葡萄糖酸半连续发酵工艺
CN106604998A (zh) * 2014-10-16 2017-04-26 玛拉可再生能源公司 重复补料分批培养方法
CN106687605A (zh) * 2014-10-16 2017-05-17 玛拉可再生能源公司 半连续培养方法
CN107735495A (zh) * 2015-05-05 2018-02-23 罗格斯技术有限责任公司 以高产量和滴度产生鼠李糖脂的半连续工艺

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A new polysialic acid production process based on dual-stage pH control and fed-batch fermentation for higher yield and resulting high molecular weight product;Zhi-Yong Zheng et al.;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20121023;第97卷;第2405-2412页 *
Enhanced production of polysialic acid by metabolic engineering of Escherichia coli;Fang Chen et al.;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20150127;第99卷;第2603-2611页 *
pH值对聚唾液酸分批发酵的影响及补料发酵;詹晓北 等;《无锡轻工大学学报》;20010531;第20卷(第3期);第223-227页 *
聚唾液酸发酵和分离纯化工艺的研究;张琦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20100515(第05期);第5、7、18页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109136308A (zh) 2019-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109182423B (zh) 促进大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法
CN103146599B (zh) 高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用
CN102703339B (zh) 高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产l-瓜氨酸的方法
CN109971663B (zh) 一株耐热亚罗解脂酵母及其应用
CN108034599B (zh) 一株源自白酒酿造体系的高效合成γ-氨基丁酸的短乳杆菌
US20240102058A1 (en) Caproate-producing bacterium with multiple substrate utilization capabilities and its applications
CN103468624B (zh) 一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌
CN106554931B (zh) 一株拜氏羧菌及其应用
CN113308387B (zh) 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用
CN106754411B (zh) 一株高产β-D-呋喃果糖苷酶的黑曲霉菌株及其液态发酵产酶方法
CN105950590B (zh) 一种ι-卡拉胶酶的制备方法
TW201928062A (zh) 生產丁酸及／或其鹽類之方法
CN103966271B (zh) 发酵生产dha的方法
CN103882072A (zh) 一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法
CN103911315A (zh) 一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用
CN108588152B (zh) 聚唾液酸发酵培养基、聚唾液酸的生产方法和聚唾液酸制品
CN104277989A (zh) 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用
CN109136308B (zh) 一种提高发酵产聚唾液酸的方法及发酵液
CN101974452B (zh) 一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法
CN109161570B (zh) 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液
CN105838652A (zh) 一株强化甘油代谢的菌株及其应用
CN103468606B (zh) 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用
CN108690853B (zh) 一种发酵生产丁醇的方法
CN109628512A (zh) 一种生产n-乙酰神经氨酸的发酵方法
CN116286513B (zh) 一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant