CN107735495A - 以高产量和滴度产生鼠李糖脂的半连续工艺 - Google Patents

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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

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Abstract

提供产生鼠李糖脂的微生物的半连续发酵方法以产生鼠李糖脂。发酵可以以分批工艺运行，但发酵结束时，取出至少约70％包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基，并加入新培养基(原料)作为替代。此工艺可重复至少约1个月，而不用牺牲RL产量和滴度。相较于分批和补料分批发酵策略，这允许以更高生产力使用发酵罐而用于清洗的停机时间更少。

Description

以高产量和滴度产生鼠李糖脂的半连续工艺
技术领域
提供产生鼠李糖脂的微生物的半连续发酵方法以产生鼠李糖脂。发酵可以以分批工艺运行，但发酵结束时，取出至少约70％的包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基，并加入新培养基(原料)作为替代。
发明背景
鼠李糖脂(RL)是界面活性糖脂类生物表面活性剂，具有降低2种不同液体间表面张力的性质，被广泛用作乳化剂、洗涤剂和发泡剂[1-3]。鼠李糖脂显示能有效地从污染土壤中去除原油并促进石油泄漏的生物修复，这是因为其乳化性质，称为“提高的石油回收(EOR)”[4]。其也由于抗微生物和抗真菌性质而用于农业。鼠李糖脂目前可用于作为ZONIX销售的农业抗真菌产品和用于从储罐中清洁油的工业清洁产品RECO。
假单胞菌(Pseudomonas)和大肠杆菌(E.coli)显示能从多种碳和氮源产生鼠李糖脂(RL)[5]。尽管假单胞菌产生的RL产量和滴度(titer)高于大肠杆菌[5,6]，但RL浓度没有高到足以使发酵工艺具有商业可行性。实施了许多方法以增加RL生产能力，包括不同碳源、遗传修饰的菌株和发酵策略，其看来是最有效的实现途径。
分批和补料分批发酵是最常见的假单胞菌发酵工艺[7-11]。分批发酵是最简单的培养方法[7,8]，其中原料(碳源)在开始时与接种体一起加入发酵罐。发酵进行，直至原料完全被微生物利用，随后发酵罐关闭并开始新批次[9]。另一方面，补料分批是分批发酵，但在发酵过程中原料完全利用后，加入原料(碳源)[9-11]。迄今报道的最佳RL滴度(生产能力)是约0.58-0.72g/L/h，获自补料分批发酵的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)[10]。然而，此工艺需要在90-120小时后关闭发酵罐，然后开始新的补料分批。类似地，美国专利号5,658,973报道了167小时后产生78g/L鼠李糖脂[8]，该时间过长而无法操作。
表1:铜绿假单胞菌的多种鼠李糖脂(RL)发酵工艺小结
发明内容
本文提供产生包含一种或多种鼠李糖脂的多个发酵产物(fermentation)的半连续发酵方法，所述所述方法包括
(a)在培养基中培养产生鼠李糖脂的微生物，所述培养基包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种磷源、至少一种镁源、至少一种钾源、至少一种硫源、至少一种氯源和至少一种钠源，所述培养进行约2-约5天之间以获得包含一种或多种鼠李糖脂的第一发酵培养基；
(b)移出至少约70％且更特别是约70％-约80％或者约70％-约90％的(a)中所获得的包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基；
(c)用具有步骤(a)中所示的组成的培养基取代(b)中所移出的包含一种或多种鼠李糖脂的所述发酵培养基；
(d)重复步骤(a)-(c)至少一次以获得包含鼠李糖脂的后续发酵产物，
其中所述步骤(a)-(c)能重复至少约30天。
在特定实施方案中，所述产生鼠李糖脂的微生物可在约25-40C温度且更特别是约30-37C的温度和/或约5.5-约9的pH且更特别是约pH 6-8.6培养。在一个实施方案中，步骤(c)中的新培养基被取代后发酵开始时的pH可以是约6-7，优选6.2-6.5。发酵过程中不需要控制发酵的pH。
在另一个特定实施方案中，所述方法还包括加入含一种或多种微量营养素的组合物。在特定实施方案中，所述微量营养素以不超过约20mg/L存在。在特定实施方案中，所述微量营养素以约1mg/L-约14mg/L存在。所述组合物可每日加入或以0.1％v/v总发酵体积/天连续加入。
上述方法还包括加入止泡剂。所述止泡剂可以是碳或硅基止泡剂。
上述工艺允许发酵作为分批工艺运行，但在发酵结束时，取出至少约70％含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基，并加入新培养基(原料)作为替代。此过程(步骤(d))能重复至少约1个月且在另一个实施方案中，多至约180天，而不用牺牲RL产量和滴度。相较于分批和补料分批发酵策略，这允许发酵罐以更高生产力(capacity)使用而用于清洗的停机时间更少。如上所示，所述工艺步骤(d)重复至少一次。在特定实施方案中，所述工艺步骤(d)重复至少5次。
在一个特定实施方案中，所述方法产生至少约45g/L且更特别是约60-80g/L的鼠李糖脂浓度，鼠李糖脂生产能力(滴度)高至约1.6g/L/h。在碳源是油的特定实施方案中，仅有步骤(b)中测得不超过约0.8％w/v的剩余油组合物。
定义
当提供一定范围的值，应理解，除非上下文另有明确说明，本发明涵盖该范围的上限和下限之间的各居中值(到下限单位的十分之一)，以及所阐明的范围中的任何其它阐明的值或居中值。这些较小范围的上限和下限可独立纳入较小范围且也涵盖在本发明内，接受所阐明的范围的任何特定排除的界限。所阐明的范围包括界限之一或两者时，排除这些中任一或两者的范围也纳入本发明。
除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的任何方法及材料也能用于实施或测试本发明，现在描述优选的方法和材料。
本公开引用的所有出版物和专利通过引用全文纳入。本文的任何内容不应解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这些公开。对于通过引用纳入的材料与本说明书矛盾或不一致的范围，本说明书将取代任何这类材料。
应注意，如本文和所附权利要求所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。
除非另有说明，一系列要素前的术语“至少”应理解为涉及该系列中的每个要素。本领域技术人员会意识到或能够确定只使用常规实验时，许多等同于本文所述发明的特定实施方案。这类等同物意在为本发明涵盖。在本说明书和之后的权利要求中，除非上下文另有要求，单词“包含(comprise)”和变型如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为指纳入所阐明的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。因此，术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等应进行扩张或开放且没有限制地理解。本文使用时，术语“包含”能被术语“含有”取代，或有时在本文使用时，被术语“具有”取代。
本文所定义的“鼠李糖脂”指糖脂，其具有包括一种或多种(通常是线性的)饱和或不饱和β-羟基-羧酸部分的脂质部分和一个或多个鼠李糖单位的糖部分。
糖部分和脂质部分经β-糖苷键连接，该β-糖苷键是在糖部分鼠李糖部分的1-OH基团与脂质部分β-羟基-羧酸的3-OH基团之间。因此，一个羧酸部分的羧基定义鼠李糖脂末端。当多于一个鼠李糖部分被纳入鼠李糖脂，不连接脂质部分的各鼠李糖部分经1,4β-糖苷键连接另一鼠李糖部分。在2个或更多β-羟基-羧酸存在于鼠李糖脂的实施方案中，β-羟基-羧酸部分彼此独立选择。在一些实施方案中，各分别的多个β-羟基羧酸部分的β-羟基羧酸部分可相同。在一些实施方案中，它们彼此不同。
本文所定义的“微量营养素组合物”是所包含的微量营养素存在的量不超过约20mg/L的组合物。
术语“培养基”、“发酵培养基”同义且可互换使用。
附图简要说明
图1是描述产生鼠李糖脂的半连续发酵方法的示意图。
图2显示在实施例4中步骤(a)-(c)重复超过30天的发酵过程中的pH变化。
图3显示实施例5中接种后或填充新培养基后，发酵过程中的pH变化。发明详述
本文提供产生包含一种或多种鼠李糖脂的多个发酵产物的半连续发酵方法。在特定实施方案中，所述鼠李糖脂可具有结构(I)。
其中m＝2、1或0尤其是1或0，n＝1或0或尤其是1时，R1和R2＝彼此独立地是相同或不同有机基，有2-24个优选5-13个碳原子，特别是任选地，分支的，任选地取代的尤其是羟基取代的，任选地不饱和的尤其是任选单、二或三不饱和的，烃基，优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基以及(CH2)o-CH3，其中o＝1-23，优选4-12。
主链以及分支都可进一步含有杂原子如N、O、S、Se或Si或者碳原子可被这些杂原子之一取代。脂肪族部分可被一个或多个官能团取代或未取代。取代基可以是任何官能团，例如但不限于氨基、酰胺基、羰基、羧基、羟基、硝基、巯基和磺酰基。
产生鼠李糖脂的微生物
如上所示，所述方法包括培养产生鼠李糖脂的微生物。产生鼠李糖脂的微生物可以是产生鼠李糖脂的宿主细胞。产生鼠李糖脂的重组宿主细胞可以是宿主细胞，如表达RhlA基因或其直系同源物和/或RhlB基因或其直系同源物和/或RhlC基因或其直系同源物和/或RhlR基因或其直系同源物和/或RhlI基因或其直系同源物和/或RhlG基因或其直系同源物等的细菌细胞。
或者，“产生鼠李糖脂的微生物”可以是任何微生物，如细菌，其具有在适当条件下合成/产生鼠李糖脂的能力，包括但不限于放线菌、厚壁菌和变形菌类的细菌。在特定实施方案中，产生鼠李糖脂的微生物是丙型变形菌(Gammaproteobacteria)纲的细菌。在另一个实施方案中，产生鼠李糖脂的微生物是假单胞菌(Pseudomonadales)目的细菌。在另一个实施方案中，产生鼠李糖脂的微生物是假单胞菌(Pseudomonadacae)科的细菌。在另一个实施方案中，产生鼠李糖脂的微生物是假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、P.clemancea,P.collierea、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、浅黄假单胞菌(P.luteola)、恶臭假单胞菌(P.putida)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)和P.teessidea。在另一个实施方案中，产生鼠李糖脂的微生物是铜绿假单胞菌。
培养基
在培养基中培养含有鼠李糖脂的微生物。所述培养基包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种磷源、至少一种硫源、至少一种钠源、至少一种镁源、至少一种钾源、至少一种硫源和至少一种氯源。
碳源可以是单糖如葡萄糖、二糖如蔗糖、糖醇如甘油、长链烷烃如正十六烷、脂肪酸如羊脂酸(也称为辛酸)、植物油(新鲜的或废弃的；例如大豆油)或其混合物、有机酸(如乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸)、醇(如乙醇)和这些的混合物。在一个特定实施方案中，碳源是选自下组的植物油：橄榄油、菜籽油、橄榄油、玉米油、葵花油、芥花油和大豆油。碳源可存在的量是约6％-约12％w/w。
氮源可以是硫酸铵、磷酸铵、尿素、酵母提取物、肉膏、蛋白胨和玉米浆。在特定实施方案中，氮源是NaNO3。在另一个实施方案中，氮可存在的量是约1-10g/L。
在特定实施方案中，磷源可以是H3PO4或K2HPO4。在另一个特定实施方案中，所述磷存在的量是约1-10g/L。
在特定实施方案中，镁离子可以是MgSO4*7H2O和/或MgCl2。在特定实施方案中，镁存在的量是约0.01-1g/L。
钾可以是KCl和/或KOH。在特定实施方案中，钾存在的量是约0.1-约2g/L。
钠可以是NaCl、NaNO3和NaOH。在特定实施方案中，所述钠离子存在的量是约1-15g/L。
氯化物可以是KCl和NaCl。在特定实施方案中，所述氯离子存在的量是约0.1-1g/L。
硫可以是H2SO4。在特定实施方案中，所述硫离子存在的量是约0.1-1g/L。
硫、氯和氮源可源自水性层，或也称为酸处理和陈化的微生物的水性液相或水性相，其含有用申请系列号14/992,995中描述的方法可获得的发酵培养基。在特定实施方案中，可通过在约0-30C温育至少约1天和约24-72小时，使包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基或培养基陈化。在特定实施方案中，可用酸处理陈化的水性培养基，这样培养基调至约pH 1.5-2.5，优选约2.05-约2.15。酸可以是有机酸如乙酸或无机酸。在优选实施方案中，酸是无机酸，如HCl、H2SO4、HNO3或H3ClO4。由此，产生水性液相、油相和固相。用本领域已知方法移出水性液相，在特定实施方案中，使用上示方法(如过滤、离心或沉淀联合倾析)。
培养基还可包括乳化剂。在特定实施方案中，乳化剂选自阿拉伯胶、瓜尔豆胶和鼠李糖脂。在另一个特定实施方案中，所述培养基中的乳化剂与碳源之比是约0.1％-约20％w/w。在另一个特定实施方案中，所述乳化剂存在的量可以是约5-10％重量。
在特定实施方案中，培养基或发酵培养基用本领域已知方法灭菌。这些方法可基于过滤、基于热、基于化学或基于紫外光。在特定实施方案中，基于热的处理可通过湿热灭菌进行，尤其是高压灭菌。
在一个实施方案中，水性培养基(如发酵培养基)可通过上述方法之一灭菌。在另一个实施方案中，发酵培养基可通过多于一种上示方法灭菌且这些灭菌能采用任何顺序。其可在第一个发酵循环期间的发酵中灭菌，但后续循环中应在另一容器内灭菌。
微量营养素组合物
如上所示，所述方法还可包括加入微量营养素溶液或组合物。所述微量营养素可以是痕量的Fe、Mn、Zn、Cu、Na。在特定实施方案中，所述微量营养素是Fe、Mn、Zn、Na或Cu盐。在更特定的实施方案中，所述微量营养素组合物包括Fe、Mn、Zn、Na和Cu盐。组合物可经过滤灭菌。
在特定实施方案中，所述Cu盐是CuCl2*2H2O和CuSO4*5H2O中的至少一种，且可以约0.5-3g/L微量营养素溶液的量存在；所述Mn盐是MnSO4*H2O和MnCl2·4H2O中的至少一种，可以约0.1-1.5g/L微量营养素溶液的量存在；所述Zn盐是ZnSO4*7H2O或ZnCl2，可以约0.5-3g/L微量营养素溶液的量存在；所述Fe盐是FeCl3*6H2O或FeSO4中的至少一种，可以约0.1-1g/L微量营养素溶液的量存在；所述钠盐是Na3C6H5O7*2H2O，可以约1-5g/L微量营养素溶液的量存在。
实施例
实施例1：培养基制备
下表2中显示培养基中的8％大豆油的组合物，用于产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌发酵的。阿拉伯胶以10％w/w大豆油使用。
表2:培养基组成
为制备培养基，首先将阿拉伯胶溶于去离子水，以150-250rpm在40-45C在单独容器中搅拌，以获得5％w/w阿拉伯胶溶液。此步骤花费至少30分钟以允许所有阿拉伯胶溶于水。第二，用混料器如厨房搅拌机混合大豆油与5％阿拉伯胶去离子水溶液。确认其混合充分以获得乳液(即溶液变成白色牛奶状)。获得大豆油乳液后，在搅拌下将H3PO4加入乳液，在H3PO4充分溶解后加入下一化学物NaOH。后续化学物是MgSO4，随后是KCl，接着是NaNO3，最后是H2SO4，在搅拌下加入乳液。加入下一化学物前，确认其充分溶于乳液。然后，培养基可进行蒸气灭菌(高压灭菌)。
实施例2：微量营养素组合物制备
微量营养素的组成如表3所示。请注意，各盐的浓度采用g/L微量营养素溶液。
表3:微量营养素的组成
所有化学物是ACS级(可获得的最高纯度)。首先将Na3C6H5O7*2H2O加入去离子水，使用搅拌。全部溶解后，可以加入下一化学物FeCl3*6H2O。重复此步骤，直至表内列出的所有化学物以FeCl3*6H2O然后ZnSO4*7H2O随后CuCl2*2H2O接着CuSO4*5H2O和最后MnSO4*H2O的顺序加入溶液。微量营养素可以用0.2微米无菌过滤来消毒。不要对微量营养素进行蒸气高压灭菌。
实施例3：铜绿假单胞菌(Schroeter)Migula(R4菌株)的种子培养
获自ATCC#55734的R4菌株首先接种于含40g/L Tryptic Soy Agar的琼脂板，32C，18-24小时。R4菌落形成后，单菌落随后于37C在摇管的5ml 20g/L LB Broth(Lennox)中培养20-24小时。最终OD600是约3-5，摇管中的LB Broth(Lennox)溶液从黄变绿。然后，获自摇管的R4培养物以接种于含20g/L LB Broth(Lennox)的摇瓶，1％接种，并在37C，20-24小时。必要时重复此过程以产生发酵所需的足够的R4接种体。LB Broth(Lennox)获自SigmaAldrich#3022，其含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L NaCl。
实施例4：鼠李糖脂的半连续发酵，用去离子水和10％w/w阿拉伯胶(作为乳化剂)与大豆油
获自ATCC#55734(R4)的铜绿假单胞菌(Schroeter)Migula发酵在10L生物反应器中进行并如图1所示意。其开始于在发酵罐10中制备8L培养基，该培养基含有8％大豆油且阿拉伯胶比大豆油为10％w/w。用于实施例1中培养基的化学物是ACS级(可获得的最高纯度)。培养基灭菌后，温度用水加热套冷却至37C且搅拌开始(250rpm)。一旦温度在37C稳定，以1.5L/min经曝气线(#4)向发酵罐供应0.2微米过滤的空气，发酵罐经线#1接种2.5％(200ml)获自实施例3的R4接种体。实施例2中制备的经过滤灭菌8ml微量营养素随之经线#2每日一次加入发酵罐。在微量营养素不能每日加入的情况中，8ml微量营养素稀释于32ml去离子水(每天)从而使用蠕动泵以40ml/天连续加入发酵罐。经线#3自动加入硅基止泡剂(Sigma Aldrich#85390)以在发酵期间减少泡沫。
发酵在37C的温度运行，培养基初始pH是6.2，在发酵过程中没有pH控制。搅拌速率必要时自动增加以保持％溶解氧(％DO)于15％-20％。空气流速在接种后40-48小时从1.5增加到3.5L/min后，然后搅拌速率上升500rpm以符合生长率中的微生物需氧量。接种后60小时后，pH在小幅下降(或保持稳定)后增加。另外，当搅拌和空气流速处于最低值(分别为250rpm和1.5L/min)时，％DO增加，表明发酵在72小时时完成。这能通过发酵培养基中的剩余大豆油小于0.8％来确认，所述培养基包括一种或多种鼠李糖脂。
随后开启蠕动泵以经线#5移出6L(总量的75％)含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基。一旦移出6L液体培养基即所谓的“取出#1”，将无菌槽20中最近灭菌的6L 8％大豆油培养基通过重力自动加料注入发酵罐10。初始发酵pH是6.5。使用上面章节中所述的发酵参数。此情况中，48小时后，完成发酵且随时能取出75％的含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基(取出#2)。随后，下一批经灭菌大豆油培养基从无菌槽20中注入。该过程重复6周，没有鼠李糖脂产量和滴度损失的迹象，然后关闭发酵罐以清洗。取出之间的发酵过程中和各取出物的pH变化如图2所示。鼠李糖脂(RL)浓度和滴度如下表4所示。所有12次取出的鼠李糖脂(RL)浓度是至少62g/L，多至79g/L。RL生产能力(滴度)是0.92-1.61g/L/h。
表4:用大豆油的半连续发酵期间的鼠李糖脂浓度和滴度
实施例5：鼠李糖脂的半连续发酵，用去离子水、5％w/w阿拉伯胶比大豆油，连续加入微量营养素
所用培养基的组成如表5所示。如实施例1所示制备7.3L 8％大豆油，阿拉伯胶比大豆油5％w/w。用于此实施例的所有化学物是含杂质的工业级。
表5:培养基w/5％阿拉伯胶、8％大豆油和5％R4接种体的组成
发酵如同实施例4运行，除了5％(360ml)R4接种体用于接种发酵罐并取出77％的含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基(5.6L)，新培养基包含5％w/w阿拉伯胶比大豆油。微量营养素如实施例2所述制备。在32.7ml去离子水中稀释7.3ml微量营养素(每天)，用蠕动泵以40ml/天的流速连续加入。自动加入硅基止泡剂(DOW AFE-1510)以在发酵期间减少泡沫。搅拌速率必要时自动增加以保持％溶解氧(％DO)于15％-20％，空气流速为1.5L/min。纯氧以0.005–0.1L/min额外加入发酵罐，从而使搅拌下降并因而发泡问题更少。接种后或填充有新培养基后，发酵过程中的典型pH变化如图3所示。鼠李糖脂(RL)浓度和滴度如下表6所示。
表6:用5％R4接种体的半连续方法的鼠李糖脂浓度和滴度
实施例6：鼠李糖脂的半连续发酵，用去离子水、5％w/w阿拉伯胶比大豆油，连续加入2x微量营养素
此实施例中，培养基和发酵参数与实施例5所示相同，除了所用微量营养素加倍。在26.4ml去离子水中稀释14.6ml微量营养素(每天)，用蠕动泵以40ml/天的流速连续加入。搅拌速率必要时自动增加以保持％溶解氧(％DO)于15％-20％，空气流速为1.5L/min。纯氧以10-30％空气流量额外加入发酵罐，从而保持总体流速恒定于1.5L/min而使搅拌下降并因而发泡问题更少。鼠李糖脂(RL)浓度和滴度如下表7所示。
表7:用2X微量营养素的半连续发酵期间的RL浓度和滴度
实施例7：鼠李糖脂的半连续发酵，用8％大豆油和85％冷自来水/15％来自包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基的水性顶层废物流
用于此实施例的培养基组成如表8所示。
表8:有水性层的培养基
水性顶层废物流可用2016年1月11日提交的美国申请系列号14992995所述的过程获得(参见所述申请的实施例3)。简言之，水性顶层废物流获自澄清的发酵液。澄清的发酵液如下制备：使含铜绿假单胞菌的最终pH 6.0-6.5的发酵培养基在环境条件下陈化约2天。生物质沉淀到用于陈化过程的容器底部，澄清上清在移出后是澄清发酵液。该过程的下一步是加入酸如浓硫酸，直至约pH 2.1。鼠李糖脂从溶液中析出并在用于此步骤的容器底部形成固相和油性液相。可以通过离心加速分离固相和油性液相。固相和油性液相与水性顶相或层分离，其能废弃或再循环。上面提到的水性层是H2SO4和微量营养素的来源，其15％w/w与冷自来水平衡中用于有8％大豆油的培养基。在使用前，废物流水性顶层首先以1微米过滤去除大颗粒。
含8％大豆油的7.3L培养基(有15％废物流水性顶层和冷自来水)优选如下制备：首先用厨房搅拌机混合大豆油、水性顶层和冷自来水。其充分混合后，以H3PO4、NaOH、MgSO4、KCl和NaNO3的顺序在搅拌下将其加入溶液。培养基随后可以蒸气灭菌(高压灭菌)。用于此实施例的所有化学物是含杂质的工业级。
发酵采用与实施例5相同的参数完成。连续加入微量营养素组合物。纯氧以10-30％空气流量额外加入发酵罐，从而保持总体流速恒定于1.5L/min而使搅拌下降并因而发泡问题更少。鼠李糖脂(RL)浓度和滴度如下表9所示。
表9:半连续发酵期间的RL浓度和滴度(水层)
实施例9：100L规模的鼠李糖脂半连续发酵
100L培养基(如实施例5中的组成)如实施例1所述制备并在120L生物反应器中灭菌。其组成如表10所示。R4菌株的种菌培养根据实施例2制备。100L发酵罐用2.9L R4菌株接种，所述菌株在摇瓶中以20g/L LB Broth Lennox于37C温育24小时。
发酵在37C的温度运行，培养基初始pH是6.2，在发酵过程中没有pH控制。用50％去离子水稀释硅基止泡剂(DOW AFE-1510)，然后在使用前高压灭菌。自动加入止泡剂以在发酵期间减少泡沫。搅拌在150rpm，17L/min空气下进行。搅拌速率必要时自动增加以保持％溶解氧(％DO)于15％-20％。如实施例2所述制备并具有实施例2的组成的800ml微量营养素用2.2L去离子水稀释，从而以375ml/天连续注入8天。
含9％大豆油的70L培养基(下表10中的组成)如实施例1制备并在取出前1天于不同的100L生物反应器中灭菌。接种后105小时，pH在其保持恒定约7后开始增加。发酵在115小时时完成，pH为7.3。
表10:9％大豆油培养基的组成(70L)
接种后115小时，随之开启蠕动泵以移出70L(总体的70％)含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基。一旦移出70L发酵液即所谓的“取出#1”，将最近灭菌的70L 9％大豆油培养基用蠕动泵注入发酵罐。初始发酵pH是6.5。使用上面章节中所述的发酵参数。此情况中，70小时后，完成发酵，pH为7.14。鼠李糖脂(RL)浓度和滴度如下表11所示。
表11:RL浓度和滴度(100L规模)
实施例9：没有微量营养素的摇瓶实验
50ml培养基(组成如下)如实施例1在250ml摇瓶中制备。其组成如表12所示。高压灭菌和冷却到室温后，摇瓶用5％R4株冷冻储液接种。将OD600为3-4的70％R4管培养物与30％甘油混合而获得冷冻储液，并在-80C保存。在摇瓶中37C实施温育92小时，未加入微量营养素。接种后92小时，就5个摇瓶而言，鼠李糖脂浓度平均是47±3g/L。
表12:用于没有微量营养素的发酵的培养基浓度
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Claims (9)

1.用于产生包含一种或多种鼠李糖脂的多个发酵产物的半连续方法，所述方法包括：
(a)在培养基中培养产生鼠李糖脂的微生物，所述培养基包括至少一种碳源如葡萄糖、脂肪醇、脂肪酸或植物油如橄榄油、菜籽油、橄榄油、玉米油、葵花油、芥花油和大豆油；至少一种氮源如NaNO3、尿素和NH4Cl；至少一种磷源如H3PO4和K2HPO4；至少一种镁源如MgSO4*7H2O和MgCl2；至少一种钾源如KCl和KOH；至少一种硫源如H2SO4；至少一种氯源如KCl和NaCl及至少一种钠源如NaCl、NaNO3和NaOH，以及任选存在地，乳化剂如阿拉伯胶、瓜尔豆胶和鼠李糖脂，所述培养进行约2至约5天以获得包含鼠李糖脂的第一发酵培养基；
(b)移出至少约70％的(a)中所获得的包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基；
(c)用具有步骤(a)中所示的组成的培养基取代(b)中所移出的所述包含一种或多种鼠李糖脂的发酵培养基；
(d)重复步骤(a)-(c)至少一次以获得包含鼠李糖脂的后续发酵产物，
其中所述步骤(a)-(c)能够重复至少约30天，且其中所述方法还包括，任选地，向步骤(a)的所述培养基加入(1)包含一种或多种微量营养素的组合物，所述微量营养素的浓度不超过20mg/L微量营养素溶液，所述组合物以每天0.1％v/v总发酵体积加入，和/或(2)止泡剂如碳基或硅基止泡剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述产生鼠李糖脂的微生物是假单胞菌微生物，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)。
3.如权利要求1-2所述的方法，其中所述乳化剂存在的量是约0.1-20％重量，所述碳源存在的浓度是约6-12％重量，所述氮源存在的量是约1-4g/L，所述磷源存在的量是约1-3g/L，所述镁离子存在的量是约0.001-0.2g/L，所述钾离子存在的量是约0.1-约1g/L，所述钠离子存在的量是约1-10g/L，所述氯离子存在的量是约0.1-1g/L，所述硫离子存在的量是约0.1-1g/L。
4.如权利要求1-3所述的方法，其中所述微量营养素是Fe盐如FeCl3*6H2O或FeSO4，Mn盐如MnSO4*H2O和MnCl2·4H2O；Zn如ZnSO4*7H2O或ZnCl2；Na盐如Na3C6H5O7*2H2O、NaC6H7O7和Na2C6H6O7或Cu盐如CuCl2*2H2O和CuSO4*5H2O。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述Cu盐存在的量是约0.5-3g/L微量营养素溶液，所述Mn存在的量是约0.1-1.5g/L微量营养素溶液，所述Zn盐存在的量是约0.5g/L，所述Fe盐存在的量是约0.1-1g/L微量营养素溶液和/或所述钠盐存在的量是约1-5g/L微量营养素溶液。
6.如权利要求1-5所述的方法，其中连续加入所述微量营养素组合物。
7.如权利要求1-6所述的方法，其中每日加入所述微量营养素组合物。
8.如权利要求1-7所述的方法，其中所述假单胞菌在约30-37C的温度和/或约6-8.6的pH培养。
9.如权利要求1-8所述的方法，其中所述步骤(d)重复至少约30天。
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