CN109504629A - 一种分段调控的连续培养菌种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分段调控的连续培养菌种的方法。本发明通过向发酵液中连续补加营养物质以维持菌体代谢，同时连续导出发酵液，进入串联发酵罐进一步发酵；为提高菌体代谢速率，在不同阶段分别调控溶氧、pH、补料组成等参数。本发明减少了菌种培养和设备清洗次数，有利于简化生产工艺并降低发酵成本。此外，通过分段调控连续发酵工艺，本发明提高了鼠李糖脂产量和发酵生产效率，产品批次稳定性得到提高，易应用于工业化生产。

Description

一种分段调控的连续培养菌种的方法
技术领域
本发明涉及一种分段调控的连续培养菌种的方法，具体涉及铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的分段调控的连续培养方法，及其在鼠李糖脂发酵生产中的应用。
背景技术
全球范围内表面活性剂用量巨大，被广泛用于石油、环境、农业、日化、食品和医药等多个领域。但市面上的表面活性剂多是以石油基化学品为原料合成的，受限于石油类资源的储量和不可再生特性。因此，近年来生物表面活性剂的开发广受关注。
除优良的表面活性外，生物表面活性剂还具有绿色、环保、可持续等特点，可被应用于石油、环境、农业、日化、食品和医药等众多领域。鼠李糖脂属于一种新型生物表面活性剂，是由微生物代谢产生的一类具有界面活性的糖脂类产物。鼠李糖脂不是单一结构体，而是由多种同族结构组成的混合物，因而具有优异的界面活性，如增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等。此外，鼠李糖脂还具有无毒、易于生物降解、生物相容性好等特性，因此具备应用于多个领域的潜力。
在石油领域，常规的一次、二次采油一般仅能采收地下原油的30-40％左右，三次采油的应用可以大大提高石油的总采收率。鼠李糖脂与地层中的残油混合后会产生增溶、乳化及互溶效果,进而把残油驱替出来。已有研究表明，使用鼠李糖脂复配其它驱油剂，采收率可提高20％以上，表面活性剂成本也可显著降低。在环境领域，原油泄漏后将在水体表面形成一层油膜，严重威胁海洋或近海地域的生态环境。鼠李糖脂能够减小油膜与水之间的界面张力，使其分散在水中形成乳液。同时，作为鼠李糖脂产生菌，铜绿假单胞菌具有烃类代谢能力，可进一步分解分散在水中的油膜。鼠李糖脂可100％生物降解，不会对环境带来二次污染。此外，鼠李糖脂还被发现具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用，可被开发成新型生物医药或生物农药，为生物表面活性剂的应用提供了新的市场和动力。
鼠李糖脂的生产大多是通过微生物发酵实现的，常见的发酵菌株为铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。专利CN1891831的鼠李糖脂发酵产量为23g/L。专利CN101845468以废弃油脂为碳源，鼠李糖脂发酵产量为35-50g/L。专利CN106987545以粗甘油和地沟油为碳源，发酵产量为50g/L。专利CN105420137以棕榈油为碳源进行发酵，鼠李糖脂产量达60g/L以上。上述专利尝试了不同的培养基配方，但发酵产量相对较低。专利CN107735495采用半连续工艺进行发酵，但大比例地加入新鲜培养基会引起发酵液组分的较大波动，进而导致菌体活性发生改变。
综上所述，目前鼠李糖脂的生产一般采用分批发酵方法，生产效率偏低，导致其成本较高，严重限制了其在下游领域的应用。因此，优化发酵工艺以提升鼠李糖脂发酵产量，进而降低生产成本，是推广鼠李糖脂下游应用的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种分段调控的连续培养菌种，尤其是铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的方法，可延迟菌体衰退，将其应用于鼠李糖脂发酵，可显著提高生产效率。
为实现以上发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种分段调控的连续培养菌种，尤其铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的方法，可在发酵开始后连续补加营养物质以维持菌体代谢，同时连续导出发酵液，维持发酵罐内液体总体积基本不变；为提高菌体代谢速率，还需要在不同阶段分别调控溶氧、pH、补料组成等参数；具体包括如下步骤：
(1)配置发酵培养基并灭菌，发酵培养基至少含有一种碳源、一种氮源、一种磷源、一种镁源、一种钾源、一种钠源；将菌种经过活化、种子培养后加入装有发酵培养基的串联的1#、2#、3#发酵罐中，控制发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，发酵液通气量(空气)为1.0-2.0vvm，优选1.2-1.8vvm，搅拌转速在300-600rpm，优选400-500rpm之间，进行I阶段发酵；
(2)I阶段发酵一定时间，当发酵液中菌体生长达到稳定期后，I阶段结束，开始连续向1#发酵罐中补加新鲜的补料培养基，并连续导出发酵液，进入2#发酵罐，同时导出2#发酵罐的发酵液进入3#发酵罐；控制各发酵罐补加和导出发酵液的速率，使罐内液体总体积基本不变；
(3)在上述连续向1#发酵罐补加新鲜的补料培养基开始后的10-30h，优选15-25h内作为II阶段发酵，提高1#发酵罐发酵液通气量至2.0-3.0vvm，优选2.2-2.8vvm，搅拌转速提高至500-700rpm，优选550-650rpm，补料培养基中碳源浓度提高至原来的1.2-1.8倍，优选1.4-1.6倍；在随后的20-50h，优选25-40h内作为III阶段发酵，发酵液通气量和搅拌转速分别降低至0.5-1.5vvm和300-500rpm，优选0.8-1.2vvm和350-450rpm，补料培养基中碳源浓度降至原来的0.4-0.7倍，优选0.5-0.6倍；随后重复上述过程，进行连续发酵；
(4)从1#发酵罐连续导出发酵液2#发酵罐后，2#发酵罐进行IV阶段的中段发酵过程，控制2#发酵罐发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选30-35℃，通气量2.0-3.0vvm，优选2.2-2.8vvm，搅拌转速在300-600rpm，优选400-500rpm，此过程不补加新鲜培养基；
(5)导出2#发酵罐的发酵液进入3#发酵罐后，3#发酵罐进行V阶段的后段发酵过程，控制3#发酵罐发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选30-35℃，通气量1.0-2.0vvm，优选1.2-1.8vvm，搅拌转速在300-600rpm，优选400-500rpm，发酵过程中持续导出发酵液。该发酵液进入产品暂存罐或直接进入后续的分离工序进行下步操作。
本发明中，步骤(1)中所用菌种为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，发酵产物为鼠李糖脂。其中菌种的活化、种子培养按本领域常规的方法进行，这对于本领域技术人员来说是已知的。
本发明中，步骤(1)中所述发酵培养基至少含有一种碳源，选自水溶性碳源和/或油溶性碳源，水溶性碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘油中的一种或多种，油溶性碳源包括菜籽油、棕榈油、棉籽油、玉米油、大豆油、椰子油、橄榄油、花生油中的一种或多种；发酵培养基中碳源优选为至少一种水溶性碳源和至少一种油溶性碳源，搭配作为混合碳源使用；碳源总用量在20-150g/L之间，优选40-80g/L。
本发明中，步骤(1)中所述发酵培养基至少含有一种氮源，选自有机氮源和/或无机氮源，有机氮源包括酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母浸粉中的一种或多种，无机氮源包括硝酸盐、铵盐中的一种或多种；发酵培养基中氮源优选为至少一种有机氮源和至少一种无机氮源，搭配作为混合氮源使用；氮源总用量在2-50g/L之间，优选5-15g/L。
本发明中，步骤(1)中所述发酵培养基至少一种磷源可以选自磷酸氢二钠，其用量为0.5-1.5g/L；至少一种镁源可以选自硫酸镁，其用量为0.05-0.2g/L；至少一种钾源可以选自硫酸二氢钾，其用量可以为0.5-1.5g/L；还可包括例如氯化钠、氯化钙、硫酸亚铁，用量可以为0.05-0.3g/L。
本发明中，步骤(2)中所述I阶段发酵时间为10-80h，优选时间为20-50h。
本发明中，步骤(2)中所述补加新鲜培养基的速度为0.1-0.5V/day，优选0.2-0.4V/day，其中V为步骤(1)中发酵培养基初始体积。
本发明中，步骤(2)中所述导出发酵液的速度与补加新鲜培养基的速度应保持一致。
本发明中，步骤(3)中所述II阶段补料培养基中碳源浓度提高至发酵培养基的1.2-1.8倍，其它组成与步骤(1)中发酵培养基相同。
本发明中，步骤(3)中所述III阶段补料培养基中碳源浓度降至发酵培养基的0.4-0.7倍，其它组成与步骤(1)中发酵培养基相同。
本发明中，步骤(4)中所述IV阶段通气量升高为2.0-3.0vvm，以消耗营养物质，提高碳源转化率。
本发明中，上述步骤所用培养基中均含有消泡剂，选自常见的聚醚类或硅油类消泡剂中的一种或多种，添加量为0.5-5％，优选1-3％。
本发明中，所述连续发酵的周期可以达到至少一个月，例如1-3个月。
本发明的有益效果在于：
本发明所用铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌仅经过一次接种，可以重复利用进行生产，减少了菌种培养制备过程，简化了生产工艺。
本发明所述发酵过程可以连续补加培养基并连续导出发酵液，减少了生产批次间的切换，产品批次稳定性更高，利用进行工业化生产。
本发明所述发酵过程在发酵罐内连续进行，延长了发酵设备的清洗周期和灭菌周期，有助于降低发酵成本。
本发明所述分段调控工艺，即在不同阶段分别调控溶氧、pH、补料比例等参数，加快菌体代谢速度，提高了鼠李糖脂发酵产量。
本发明采用三个发酵罐串联，提高了原料利用率，有利于提升生产效率。
本发明采用水溶性碳源和油溶性碳源作为混合碳源，一方面可以促进菌体生长，另一方面有利于鼠李糖脂的合成。
附图说明
图1所示为本发明工艺流程图，其中1#发酵罐、2#发酵罐和3#发酵罐串联。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例仅用于示例的目的，不构成对本发明范围的任何限制。
实施例1
以铜绿假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于3个串联的3L发酵罐中，装液量70％。发酵培养基中含有甘油60g/L，酵母膏10g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂1％。控制发酵温度35℃，发酵液pH为7，发酵液通气量为1.0vvm，搅拌转速在300rpm，进行I阶段发酵。20h后进入II阶段，以8mL/L/h的速度向1#发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基中甘油含量提高为72g/L，其它组成不变，通气量为2.0vvm，搅拌转速500rpm，共补料发酵10h；随后进入III阶段，补料速度不变，培养基中甘油含量降至24g/L，通气量为0.5vvm，搅拌转速300rpm，共补料发酵20h；随后重复上述过程，连续进行发酵。在上述过程中，1#发酵罐中的发酵液以相同速度连续导入2#发酵罐，2#发酵罐进行IV阶段发酵，同时导出2#发酵罐中发酵液进入3#发酵罐，3#发酵罐进行V阶段发酵。2#发酵罐通气量为2.0vvm，3#发酵罐通气量为1.0vvm，其它条件不变(即与I阶段相同)。3#发酵罐发酵液导出进入暂存罐或下步工序。上述发酵共进行720h，过程鼠李糖脂产率为0.52g/L/h，碳源转化率为78％。
实施例2
以恶臭假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于3个串联的3L发酵罐中，装液量70％。发酵培养基中含有葡萄糖20g/L，菜籽油20g/L，蛋白胨7g/L，硝酸钠8g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂3％。控制发酵温度30℃，发酵液pH为8，发酵液通气量为2.0vvm，搅拌转速在600rpm，进行I阶段发酵。50h后进入II阶段，以16mL/L/h的速度向1#发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基中葡萄糖和菜籽油含量分别提高为30g/L和30g/L，其它组成不变，通气量为3.0vvm，搅拌转速700rpm，共补料发酵30h；随后进入III阶段，补料速度不变，培养基中葡萄糖和菜籽油含量分别降至12g/L和12g/L，通气量为1.5vvm，搅拌转速500rpm，共补料发酵50h；随后重复上述过程，连续进行发酵。在上述过程中，1#发酵罐中的发酵液以相同速度连续导入2#发酵罐，2#发酵罐进行IV阶段发酵，同时导出2#发酵罐中发酵液进入3#发酵罐，3#发酵罐进行V阶段发酵。2#发酵罐通气量为3.0vvm，3#发酵罐通气量为2.0vvm，其它条件不变。3#发酵罐发酵液导出进入暂存罐或下步工序。上述发酵共进行800h，过程鼠李糖脂产率为0.66g/L/h，碳源转化率为75％。
实施例3
以铜绿假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于3个串联的7L发酵罐中，装液量70％。发酵培养基中含有甘油30g/L，棉籽油50g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂2％。控制发酵温度32℃，发酵液pH为7.5，发酵液通气量为1.5vvm，搅拌转速在500rpm，进行I阶段发酵。30h后进入II阶段，以12mL/L/h的速度向1#发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基中甘油和棉籽油含量分别提高为54g/L和90g/L，其它组成不变，通气量为2.5vvm，搅拌转速600rpm，共补料发酵20h；随后进入III阶段，补料速度不变，培养基中甘油和棉籽油含量分别降至15g/L和25g/L，通气量为1.0vvm，搅拌转速400rpm，共补料发酵30h；随后重复上述过程，连续进行发酵。在上述过程中，1#发酵罐中的发酵液以相同速度连续导入2#发酵罐，2#发酵罐进行IV阶段发酵，同时导出2#发酵罐中发酵液进入3#发酵罐，3#发酵罐进行V阶段发酵。2#发酵罐通气量为2.5vvm，3#发酵罐通气量为1.5vvm，其它条件不变。3#发酵罐发酵液导出进入暂存罐或下步工序。上述发酵共进行750h，过程鼠李糖脂产率为0.83g/L/h，碳源转化率为64％。
实施例4
以恶臭假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于3个串联的20L发酵罐中，装液量70％。发酵培养基中含有果糖20g/L，大豆油50g/L，牛肉膏4g/L，硝酸铵4g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂3％。控制发酵温度31℃，发酵液pH为7，发酵液通气量为1.0vvm，搅拌转速在400rpm，进行I阶段发酵。40h后进入II阶段，以16mL/L/h的速度向1#发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基中果糖和大豆油含量分别提高为32g/L和80g/L，其它组成不变，通气量为3.0vvm，搅拌转速550rpm，共补料发酵15h；随后进入III阶段，补料速度不变，培养基中果糖和大豆油含量分别降至14g/L和35g/L，通气量为1.5vvm，搅拌转速350rpm，共补料发酵40h；随后重复上述过程，连续进行发酵。在上述过程中，1#发酵罐中的发酵液以相同速度连续导入2#发酵罐，2#发酵罐进行IV阶段发酵，同时导出2#发酵罐中发酵液进入3#发酵罐，3#发酵罐进行V阶段发酵。2#发酵罐通气量为2.0vvm，3#发酵罐通气量为1.0vvm，其它条件不变。3#发酵罐发酵液导出进入暂存罐或下步工序。上述发酵共进行820h，过程鼠李糖脂产率为0.74g/L/h，碳源转化率为71％。
实施例5
以铜绿假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于3个串联的50L发酵罐中，装液量70％。发酵培养基中含有甘油20g/L，棕榈油30g/L，酵母浸粉4g/L，硝酸镁8g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂2％。控制发酵温度33℃，发酵液pH为8，发酵液通气量为2.0vvm，搅拌转速在500rpm，进行I阶段发酵。35h后进入II阶段，以12mL/L/h的速度向1#发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基中甘油和棕榈油含量分别提高为28g/L和42g/L，其它组成不变，通气量为2.0vvm，搅拌转速650rpm，共补料发酵25h；随后进入III阶段，补料速度不变，培养基中甘油和棕榈油含量分别降至10g/L和15g/L，通气量为0.5vvm，搅拌转速450rpm，共补料发酵35h；随后重复上述过程，连续进行发酵。在上述过程中，1#发酵罐中的发酵液以相同速度连续导入2#发酵罐，2#发酵罐进行IV阶段发酵，同时导出2#发酵罐中发酵液进入3#发酵罐，3#发酵罐进行V阶段发酵。2#发酵罐通气量为3.0vvm，3#发酵罐通气量为2.0vvm，其它条件不变。3#发酵罐发酵液导出进入暂存罐或下步工序。上述发酵共进行850h，过程鼠李糖脂产率为0.69g/L/h，碳源转化率为81％。
对比例1
以恶臭假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于单个3L发酵罐，装液量70％。发酵培养基中含有葡萄糖20g/L，菜籽油20g/L，蛋白胨7g/L，硝酸钠8g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂3％。控制发酵温度30℃，发酵液pH为8，发酵液通气量为2.0vvm，搅拌转速在600rpm，进行发酵。以16mL/L/h的速度向发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基组成、通气量、搅拌转速均保持不变，罐中发酵液以相同速度连续导出进入暂存罐或下步工序，进行连续发酵。上述发酵共进行800h，过程鼠李糖脂产率为0.28g/L/h，碳源转化率为52％。
对比例2
以铜绿假单胞菌为菌种，经活化和摇瓶培养后接种于3个串联的7L发酵罐中，装液量70％。发酵培养基中含有甘油30g/L，棉籽油50g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钠1g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.1g/L，消泡剂2％。控制发酵温度32℃，发酵液pH为7.5，发酵液通气量为1.5vvm，搅拌转速在500rpm，进行发酵。以12mL/L/h的速度向1#发酵罐中连续补加新鲜的补料培养基，培养基组成、通气量、搅拌转速均保持不变，1#发酵罐中的发酵液以相同速度连续导入2#发酵罐，同时导出2#发酵罐中发酵液进入3#发酵罐，3#发酵罐发酵液导出进入暂存罐或下步工序，进行连续发酵。2#发酵罐和3#发酵罐各条件与1#发酵罐相同。上述发酵共进行750h，过程鼠李糖脂产率为0.34g/L/h，碳源转化率为48％。
可见与常规培养方法相比，本发明所述分段调控的连续培养方法，在不同阶段分别调控溶氧、pH、补料比例等参数，可加快菌体代谢，延迟衰退，鼠李糖脂产量更高，且操作简单，生产效率得到明显提升。

Claims (8)

1.一种分段调控的连续培养菌种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置发酵培养基并灭菌，发酵培养基至少含有一种碳源、一种氮源、一种磷源、一种镁源、一种钾源、一种钠源；将菌种经过活化、种子培养后加入装有发酵培养基的串联的1#、2#、3#发酵罐中，控制发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，发酵液通气量为1.0-2.0vvm，搅拌转速在300-600rpm之间，进行I阶段发酵；
(2)发酵一定时间，当发酵液中菌体生长达到稳定期后，I阶段结束，开始连续向1#发酵罐中补加新鲜的补料培养基，并连续导出发酵液，进入2#发酵罐，同时导出2#发酵罐的发酵液进入3#发酵罐；控制各发酵罐补加和导出发酵液的速率，使罐内液体总体积基本不变；
(3)在上述连续向1#发酵罐补加新鲜的补料培养基后的10-30h内作为II阶段发酵，提高1#发酵罐发酵液通气量至2.0-3.0vvm，搅拌转速提高至500-700rpm，补料培养基中碳源浓度提高至发酵培养基的1.2-1.8倍；在随后的20-50h内进行III阶段发酵，发酵液通气量和搅拌转速分别降低为0.5-1.5vvm和300-500rpm，补料培养基中碳源浓度降至发酵培养基的0.4-0.7倍；随后重复上述过程，进行连续发酵；
(4)从1#发酵罐连续导出发酵液进入2#发酵罐后，2#发酵罐进行IV阶段的中段发酵过程，控制2#发酵罐发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，通气量2.0-3.0vvm，搅拌转速在300-600rpm，此过程不补加新鲜培养基；
(5)导出2#发酵罐的发酵液进入3#发酵罐后，3#发酵罐进行V阶段的后段发酵过程，控制3#发酵罐发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，通气量1.0-2.0vvm，搅拌转速在300-600rpm，发酵过程中持续导出发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)的发酵液进入产品暂存罐或直接进入后续的分离工序进行下步操作。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌种为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，发酵产物为鼠李糖脂。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，至少一种碳源选自水溶性碳源和/或油溶性碳源，水溶性碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘油中的一种或多种，油溶性碳源包括菜籽油、棕榈油、棉籽油、玉米油、大豆油、椰子油、橄榄油、花生油中的一种或多种；发酵培养基中碳源优选为至少一种水溶性碳源和至少一种油溶性碳源，搭配作为混合碳源使用；碳源总用量在20-150g/L之间，优选40-80g/L；
至少一种氮源选自有机氮源和/或无机氮源，有机氮源包括酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母浸粉中的一种或多种，无机氮源包括硝酸盐、铵盐中的一种或多种；发酵培养基中氮源优选为至少一种有机氮源和至少一种无机氮源，搭配作为混合氮源使用；氮源总用量在2-50g/L之间，优选5-15g/L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述I阶段发酵时间为10-80h，优选时间为20-50h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述补加新鲜培养基的速度为0.1-0.5V/day，优选0.2-0.4V/day，其中V为发酵培养基初始体积。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述II阶段补料培养基中碳源浓度提高至发酵培养基的1.2-1.8倍，所述III阶段补料培养基中碳源浓度降至发酵培养基的0.4-0.7倍，其它组成与I阶段发酵培养基相同。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述连续发酵的周期为至少一个月。
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