CN110771426B

CN110771426B - 一种桑黄菌种稳定培养方法

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Publication number: CN110771426B
Application number: CN201911000203.XA
Authority: CN
Inventors: 郭红伟; 马伟; 陈凯
Original assignee: Individual
Current assignee: Ningbo Yujun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110771426A

Abstract

本公开涉及一种桑黄菌种稳定培养方法，该方法包括：(1)将母种接种至斜面培养基中进行扩繁培养；(2)将步骤(1)中扩繁培养得到的菌种接种至液体培养基中进行扩大培养；(3)将步骤(2)中扩大培养的菌种接种至栽培种培养基中进行培养，培养过程中，采摘幼嫩子实体进行菌种分离，培养结束后，采摘成熟子实体；(4)根据步骤(1)、(2)和(3)进行扩繁培养、扩大培养以及进行栽培和进行菌种分离，如此循环；需要改变的是：液体培养基中的速效碳源和速效氮源每次循环均分别增加5～10mL/L，磷酸氢钾、硫酸镁、维生素B1每次循环分别增加0.1～0.2g/L。

Description

一种桑黄菌种稳定培养方法

技术领域

本公开涉及一种桑黄菌种稳定培养方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

菌种是指食用菌、工业菌、农用菌等菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。在生产中根据菌种的来源、繁殖代数及生产目的，把菌种分为母种、原种和栽培种，分别叫做一级种、二级种、三级种。

目前针对桑黄菌丝高效生产多糖、黄酮等活性成分的研究较多，而专门对桑黄菌种的研究较少，尤其是目前仍存在桑黄菌种容易退化和不稳定等的问题，制约了桑黄的大规模生产和应用。

此外，全世界每年大约形成1000～2000亿吨植物有机质，其中有一半是纤维素物质，我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣约有7亿吨，这些废弃物既没有得到充分的利用，又污染环境，因此需要合理开发和利用这一丰富的天然资源。

发明内容

针对以上背景技术，本公开提供了一种桑黄菌种稳定培养方法，解决了桑黄菌种容易退化和不稳定的问题，以及提供了一种生产桑黄的新方法，并且实现了农林副产品和/或其下脚料的综合利用。

具体的，本公开采用以下技术方案：

本公开提供一种桑黄菌种稳定培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)将母种接种至斜面培养基中进行扩繁培养；

(2)将步骤(1)中扩繁培养得到的菌种接种至液体培养基中进行扩大培养；其中，液体培养基包括速效碳源和速效氮源；

(3)将步骤(2)中扩大培养的菌种接种至栽培种培养基中进行培养，培养过程中，采摘幼嫩子实体进行菌种分离，培养结束后，采摘成熟子实体；

其中，栽培培养基包括长效碳源、速效氮源、长效氮源、速效氮源和肉桂废弃物；所述速效碳源是由长效碳源发酵制得，所述速效氮源是由长效氮源发酵制得；所述长效碳源为农林副产品和/或其下脚料，长效氮源为麸皮、豆饼和畜禽粪便的混合物；

(4)根据步骤(1)、(2)和(3)进行扩繁培养、扩大培养以及进行栽培和进行菌种分离，如此循环；

需要改变的是：液体培养基中的速效碳源和速效氮源每次循环均分别增加5～10mL/L，磷酸氢钾、硫酸镁、维生素B1每次循环分别增加0.1～0.2g/L；比如第一次培养时液体培养基的组成为：速效碳源60mL/L，速效氮源15mL/L，磷酸氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，维生素B10.5g/L，自然pH；

循环第一次时，液体培养基的组成为：速效碳源65mL/L，速效氮源20mL/L，磷酸氢钾0.6g/L，硫酸镁0.6g/L，维生素B10.6g/L，自然pH；

第二次循环时，液体培养基的组成为：速效碳源70mL/L，速效氮源25mL/L，磷酸氢钾0.7g/L，硫酸镁0.7g/L，维生素B10.7g/L，自然pH；

第三次循环时，液体培养基的组成为：速效碳源75mL/L，速效氮源30mL/L，磷酸氢钾0.8g/L，硫酸镁0.8g/L，维生素B10.8g/L，自然pH；

……

第n次循环时，液体培养基的组成为：速效碳源60+n×5mL/L，速效氮源15+n×5mL/L，磷酸氢钾0.5+n×0.1g/L，硫酸镁0.5n×0.1g/L，维生素B10.5n×0.1g/L，自然pH；

经过试验验证，可至少循环10次，菌种的性能仍然优异，故此处n≤10，n为整数。

步骤(1)中，优选的，所述斜面培养基为PDA综合培养基。

步骤(1)中，优选的，培养条件为25～28℃恒温黑暗培养8～12天。

桑黄最重要的营养来源是碳源，葡萄糖、甘露糖、果糖、乳糖等单糖是桑黄的速效碳，可通过细胞膜主动吸收进入细胞内，不需要转换，直接参与细胞代谢，同样的，低分子蛋白质、多肽和氨基酸等是桑黄的速效氮，菌丝可以不经过转化直接吸收利用。本公开根据桑黄菌丝的生长特性，经过试验和筛选，采用发酵特定原料作为桑黄的速效碳和速效氮，发酵而成的速效碳源和氮源种类丰富，可为菌丝提供充足的营养，菌丝生长活力旺盛。

步骤(2)中，优选的，初始液体培养基的组成为：

速效碳源60～80mL/L，速效氮源15～30mL/L，磷酸氢钾0.5～1g/L，硫酸镁0.5～1g/L，维生素B10.5～1g/L，自然pH；

其中，所述速效碳源是由农林副产品和/或其下脚料经过发酵制得，农林副产品和/或其下脚料为稻草、麦草、玉米芯、棉籽壳、木屑等中的一种或多种；所述速效氮源由麸皮、豆饼和畜禽粪便混合物经过发酵制得。

进一步的，所述速效碳源是通过以下方法制备得到的：

A、将农林副产品和/或其下脚料粉碎，加水混合均匀；

B、将纤维素降解菌接种至步骤A中的混合物中进行自然常温发酵，发酵时间为10～15天；

C、发酵结束后，固液分离，得到上清液，浓缩，即为速效碳源。

其中，农林副产品和/或其下脚料与水的添加比例为(5～10)kg：(3～5)L。

在本公开的一个或多个实施方式中，为了提高单糖的得率，优选纤维素降解菌为复合菌，由里氏木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌组成，其数量比例为(1～2)：(1～2)：(2～4)，这些菌种均可以通过常规的商业途径购买得到。经过试验验证，采用上述三种菌种组成的纤维素降解菌得到的单糖含量较高，单糖种类丰富，从而为桑黄菌种提供充足的速效碳。

在本公开的一个或多个实施方式中，纤维素降解菌的接种量为：每100g培养基接种1.5mL菌液，1mL菌液含有的菌种如下：里氏木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌分别为(1～2)×10¹⁰cfu、(1～2)×10¹⁰cfu和(2～4)×10¹⁰cfu。

在本公开的一个或多个实施方式中，纤维素降解菌发酵的温度为30～40℃。

进一步的，所述速效氮源是通过以下方法制备得到的：

a、将麸皮、豆饼和畜禽粪便混合粉碎，加水混合均匀；

b、将酵母菌和乳酸菌接种至步骤a中的混合物中进行常温自然发酵，发酵时间为24～48h；

c、发酵结束后，固液分离，得到上清液，浓缩，即为速效氮源。

其中，麸皮、豆饼、畜禽粪便和水的添加比例为(1～2)kg：(2～4)kg：(2～4)kg：(3～8)L。

经过筛选和优化，选择酵母菌和乳酸菌对物料进行发酵，可以更加高效的分解蛋白质，产生适宜桑黄快速利用的氮源。在本公开的一个或多个实施方式中，酵母菌为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，乳酸菌为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，其数量比例为(1～2)：(2～4)，这些菌种均可通过常规的商业途径购买得到。

在本公开的一个或多个实施方式中，酵母菌的接种量为每100g培养基接种(1～1.5)g菌粉，1g菌粉含有1.5×10¹¹cfu酵母菌活菌，乳酸菌的接种量为每100g培养基接种(1～1.5)g菌粉，1g菌粉含有3×10¹¹cfu乳酸菌活菌。

在本公开的一个或多个实施方式中，酵母菌和乳酸菌混合发酵的温度为35～42℃。

麸皮中含有较多的蛋白质和丰富的氨基酸，并且含有丰富的B族维生素和微量元素，这些对桑黄菌丝以及子实体的生长具有重要的作用；豆饼的粗蛋白质含量可达42％以上，可消化性好，各种必需氨基酸的含量均较高，且富含烟酸、泛酸、胆碱等各种维生素；畜禽粪便营养丰富，含有丰富的氮、磷、钾、钙、镁；这些原料组合在一起经过适当发酵后，可增加氨基酸和活性肽等活性成分的含量，成为适宜桑黄吸收和利用的碳源和氮源，同时还含有丰富的、适宜其生长的磷源、钾、镁、生长素等。

步骤(2)中，优选的，培养条件为：培养温度为25～28℃，培养时间为4～7d，摇瓶转速100～150rpm，间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强200～400μE·m^-2·s^-2。

步骤(3)中，优选的，栽培种培养基是由以下重量份的原料组成：

长效碳源60～80份，速效碳源30～40份，长效氮源30～50份，速效氮源15～25份，石膏5～10份，肉桂废弃物5～10份，加水，使培养基含量为60～70w/w％。

在栽培时，选择长效碳源、速效碳源、长效氮源和速效氮源相结合作为桑黄的栽培基质，速效碳源和速效氮源的存在，可以促进桑黄菌种早吃料、早发菌、早定植，缩短桑黄子实体的生长周期，提高循环菌种的稳定性。所述肉桂废弃物是指桂油生产之后产生的桂皮渣、桂皮叶等废弃物。经过试验验证，在栽培培养基中加入少量的肉桂废弃物，能够有效降低菌袋和桑黄子实体的污染率。由于其含芳香油类物质和烯萜类，对桑黄的生长有一定的抑制作用，含量不宜较高。

步骤(3)中，优选的，培养条件为：昼温(6:00～18:00)为28～32℃，夜温(18:00～第二天6:00)为22～26℃，温差为5～6℃，湿度85～95％，散射光照射，一日通风两次，每次0.5～1h。

步骤(3)中，在接种后的第65～80天，子实体大约九成熟，进行采摘。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)采用本公开的方法，桑黄菌种菌丝生长粗壮、生长快，菌种的生命力强。

(2)采用本公开的方法，桑黄子实体生长周期短、长势整齐、子实体产量多，菌袋污染率低。

(3)本公开为研究周年生产人工桑黄提供基础，有利于规模化人工栽培桑黄。

(4)采用农林副产品和/或其下脚料等作为主要培养基质原料，成本降低，提高了废弃物的综合利用率，利于工业化生产。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1是本公开实施例和实验例中的菌丝干重和子实体干重。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为解决本公开提出的技术问题，其设计思路是：首先，采用周年生产桑黄的方法不仅能提高桑黄菌种的稳定性，还能实现桑黄的周年生产，培养周期缩短，经济效益提高；二是，长期使用单一种类和配方、成分相同的培养基，会造成营养不能达到生理要求，菌丝生长活力由强变弱，菌种衰老退化，因此，在菌丝液体生长阶段，采用了不同配方的培养基，经过试验验证，当循环次数较多时，菌丝仍生长粗壮、浓密，生命力较强；三是，菌丝生长发育期环境不良，杂菌污染，也会加速菌种退化，因此，本公开设定了特定的环境条件，经过试验验证，在液体扩大培养时，采用间歇光照培养可以进一步提高菌种的稳定；四是，设计了适宜桑黄吸收和利用的速效碳源和氮源，以及设计了速效碳源、氮源和长效碳源、氮源相结合的培养基质，进一步提高了菌种的稳定性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

若无特殊说明，以下实施例均采用以下试验材料和试验方法。

试验材料：

(1)菌种来源：本公开所使用的桑黄种类为火木层孔菌(桑黄)Phellinusigniarius，编号BNCC231138，保存在PDA斜面培养基上，该菌种可通过常规商业途径得到。

(2)PDA综合培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B18g，琼脂20g，水1000mL，自然pH。

(3)初始液体培养基组成为：速效碳源60mL/L，速效氮源15mL/L，磷酸氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，维生素B10.5g/L，自然pH；

所述速效碳源是通过以下方法制备得到的：

A、将玉米芯粉碎至粒径100目，加水混合均匀，玉米芯和水的添加比例为5kg：3L；

B、将里氏木霉Trichoderma reesei CICC 2626、黑曲霉Aspergillus niger CICC2420和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CICC 10088组成的纤维素降解菌接种至步骤A中的混合物中进行自然常温发酵14天；

纤维素降解菌的接种量为每100g培养基接种1.5mL菌液，1mL菌液含有的菌种如下：里氏木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌＝1×10¹⁰cfu、1×10¹⁰cfu、2×10¹⁰cfu；

C、发酵结束后，离心，得到上清液，浓缩至可溶性固形物含量为10w/w％，得到的浓缩液即为速效碳源；

所述速效氮源是通过以下方法制备得到的：

a、将麸皮、豆饼和畜禽粪便按照质量比例1:2:2混合粉碎，过100目筛，加水混合均匀，加水量为：上述固体原料：水＝5kg：3L；

b、将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和嗜热链球菌Streptococcusthermophilus接种至步骤a中的混合物中进行自然常温发酵36h；

其中，酵母菌接种量为每100g培养基接种1g酿酒酵母(每g菌粉中活性菌为1.5×10¹¹cfu)，接种前进行活化，1g酿酒酵母采用10mL2w/w％红糖水进行活化30min，乳酸菌的接种量为每100g培养基接种1g乳酸菌(每g菌粉中活性菌为3×10¹¹cfu)；

c、发酵结束后，离心，得到上清液，浓缩至可溶性固形物含量为20w/w％，得到的浓缩液即为速效氮源。

实施例

一种桑黄菌种稳定培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)选择菌丝生长健壮的桑黄菌种BNCC231138，严格按照无菌操作的步骤接种至PDA综合培养基中进行扩繁培养，25℃恒温黑暗培养8天；

(2)将步骤(1)中扩繁培养得到的菌种接种至液体培养基中进行扩大培养，培养瓶选择500mL摇瓶，装液量为200mL，接种量为10g/100mL；培养温度为25℃，培养时间为6天，摇瓶转速120rpm，光暗比为1:1，光暗时长分别为6h和6h，光强300μE·m^-2·s^-2；

(3)菌袋采用15×40cm的聚乙烯袋，将栽培种培养基装入菌袋中，边装边压实，然后进行封口，高压灭菌后，将步骤(2)中扩大培养的菌种接种至栽培种培养基中进行培养，接种量为每袋20ml，25℃恒温下进行暗培养，培养室内湿度65％，10天后菌种长满菌袋，继续在25℃下恒温暗培养，并观察菌袋内菌丝的颜色变化，菌袋内的菌丝由之前的浅黄色基本全部变成深黄色时，在菌袋两侧开长方形口(尺寸：约3～4×1～2cm)，并控制出菇培养室环境条件，昼温(6:00～18:00)为28℃，夜温(18:00～第二天6:00)为22℃，湿度85～95％，散射光照射，一日通风两次，每次0.5～1h；

培养过程中，采摘幼嫩子实体进行菌种分离，在接种后的第65～70天，子实体大约九成熟，进行采摘；

(4)采摘结束后，然后根据步骤(1)、(2)和(3)进行扩繁培养和扩大培养，再次进行栽培和进行菌种分离，如此循环；

需要改变的是：液体培养基中的速效碳源和速效氮源每次循环均分别增加5mL/L，磷酸氢钾、硫酸镁、维生素B1每次循环分别增加0.1g/L；比如第一次培养时液体培养基的组成为：速效碳源60mL/L，速效氮源15mL/L，磷酸氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，维生素B10.5g/L，自然pH；

……

第6次循环时，液体培养基的组成为：速效碳源90mL/L，速效氮源45mL/L，磷酸氢钾1.1g/L，硫酸镁1.1g/L，维生素B11.1 g/L，自然pH。

计算每次培养的步骤(2)中菌丝干重和步骤(3)的每袋子实体干重，循环6次，依次记为样品1～样品7，测定结果如图1所示。

实验例

与实施例不同的是，步骤(2)中的液体培养基相同。其他培养步骤和条件与实施例相同。循环6次，依次记为样品8～15，计算每次培养的步骤(2)中菌丝干重和步骤(3)的子实体干重，测定结果如图1所示。

从图1中可以看出，实施例中培养的菌丝干重和每袋子实体干重在一个稳定的范围之内，说明菌种比较稳定，而随着循环培养，实验例中的菌丝干重和子实体干重下降的比较明显，说明菌种退化比较严重。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种桑黄菌种稳定培养方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

（1）将母种接种至斜面培养基中进行扩繁培养；

（2）将步骤（1）中扩繁培养得到的菌种接种至液体培养基中进行扩大培养；其中，液体培养基包括速效碳源和速效氮源；

（3）将步骤（2）中扩大培养的菌种接种至栽培种培养基中进行培养，培养过程中，采摘幼嫩子实体进行菌种分离，培养结束后，采摘成熟子实体；

其中，栽培培养基包括长效碳源、速效碳源、长效氮源、速效氮源和肉桂废弃物；所述速效碳源是由长效碳源发酵制得，所述速效氮源是由长效氮源发酵制得；

（4）根据步骤（1）、（2）和（3）进行扩繁培养、扩大培养以及进行栽培和进行菌种分离，如此循环；

需要改变的是：液体培养基中的速效碳源和速效氮源每次循环均分别增加5~10mL/L，磷酸氢钾、硫酸镁、维生素B1每次循环均分别增加0.1~0.2g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述长效碳源为农林副产品和/或其下脚料，农林副产品和/或其下脚料为稻草、麦草、玉米芯、棉籽壳、木屑中的一种或多种；长效氮源为麸皮、豆饼和畜禽粪便的混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）中，培养条件为25~28℃恒温黑暗培养8~12天。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（2）中，速效碳源60~80mL/L，速效氮源15~30mL/L，磷酸氢钾0.5~1g/L，硫酸镁0.5~1g/L，维生素B1 0.5~1g/L，自然pH。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是，所述速效碳源是通过以下方法制备得到的：

A、将农林副产品和/或其下脚料粉碎，加水混合均匀；

B、将纤维素降解菌接种至步骤A中的混合物中进行自然常温发酵，发酵时间为10~15天；

C、发酵结束后，固液分离，得到上清液，浓缩，即为速效碳源；

其中，农林副产品和/或其下脚料与水的添加比例为（5~10）kg：（3~5）L。

6.如权利要求4所述的方法，其特征是，所述速效氮源是通过以下方法制备得到的：

a、将麸皮、豆饼和畜禽粪便混合粉碎，加水混合均匀；

b、将酵母菌和乳酸菌接种至步骤a中的混合物中进行常温自然发酵，发酵时间为24~48h；

c、发酵结束后，固液分离，得到上清液，浓缩，即为速效氮源；

其中，麸皮、豆饼、畜禽粪便和水的添加比例为（1~2）kg：（2~4）kg：（2~4）kg：（3~8）L。

7. 如权利要求5所述的方法，其特征是，纤维素降解菌为复合菌，由里氏木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌组成，其数量比例为（1~2）：（1~2）：（2~4）；纤维素降解菌的接种量为每100g培养基接种1.5mL菌液，1 mL菌液含有的菌种如下：里氏木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌=（1~2）×10¹⁰cfu、（1~2）×10¹⁰cfu、（2~4）×10¹⁰cfu。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是，酵母菌为酿酒酵母，乳酸菌为嗜热链球菌，其数量比例为（1~2）：（2~4）；酵母菌的接种量为每100g培养基接种（1~1.5）g菌粉，1g菌粉含有1.5×10¹¹cfu酵母菌活菌，乳酸菌的接种量为每100g培养基接种（1~1.5）g菌粉，1g菌粉含有3×10¹¹cfu乳酸菌活菌。

9.如权利要求5所述的方法，其特征是，纤维素降解菌发酵的温度为30~40℃。

10.如权利要求6所述的方法，其特征是，酵母菌和乳酸菌混合发酵的温度为35~42℃。

11. 如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（2）中，培养条件为：培养温度为25~28℃，培养时间为4~7d，摇瓶转速100~150rpm，间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强200~400μE·m ^-2 ·s ^-2。

12.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）中，栽培种培养基是由以下重量份的原料组成：

长效碳源 60~80份，速效碳源 30~40份，长效氮源30~50 份，速效氮源15~25份，石膏5~10份，肉桂废弃物 5~10 份，加水，使培养基含量为60~70w/w%。

13.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）中，培养条件为：昼温6:00~18:00为28~32℃，夜温18:00~第二天6:00为22~26℃，温差为5~6℃，湿度85~95%，散射光照射，一日通风两次，每次0.5~1h。