CN102907258A - 食用菌菌种的脱毒方法 - Google Patents

Abstract

一种食用菌菌种的脱毒方法，包括如下步骤：常规法制作PDA培养基，氯霉素处理培养基表面，接入待脱毒菌种，常规培养；待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，提取原基组织接入PDA培养基，常规法培养；待菌丝发至1/2时，挑取菌丝尖端2-3mm处的菌丝体，再次接入PDA培养基，常规法培养；采用前述原基分离法和尖端分离法，循环操作进行2-4次，即可达到脱毒目的。脱毒后的菌种可完全恢复原有生物学特性和生产性状，抗逆性、抗病性明显增强，发病率较常规菌种降低60%以上，原种和栽培种的制种成活率可提高至95%以上。

Description

食用菌菌种的脱毒方法

技术领域

本发明涉及一种食用菌菌种的脱毒方法。

背景技术

食用菌生产领域，在推广应用新选育的食用菌菌种的过程中，由于易受病毒、病菌的危害，其性状不稳定、易退化、老化，优良性状难以保持长久，菌种的退化现象严重制约了食用菌生产的发展。生产中急需一种食用菌菌种的脱毒复壮技术，可抑制菌种的退化，保持并恢复菌种原有的优良生物学特性和生产性状。

发明内容

本发明要解决的问题在于提供一种食用菌菌种的脱毒方法。

一种食用菌菌种的脱毒方法，包括如下步骤：

步骤一：常规法制作PDA培养基，无菌处理后，无菌条件下在PDA培养基表面滴入浓度0.25-0.5%的氯霉素数滴，使之布满培养基表面，常规组织分离接入待脱毒菌种，常规温度培养；

步骤二：待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，出现1.5厘米大小的原基时，无菌条件下去掉原基表层，将其纵横各划切4-5刀，使成9-16块的小组织块，每支试管内接入1-2块，常规法培养；

步骤三：待菌丝发至1/2时，挑取菌丝尖端2-3mm处的菌丝体，再次接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤四：待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，重复步骤二的操作，分离原基组织接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤五：待菌丝发至1/2时，重复步骤三的操作，以尖端分离法分离菌丝，接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤六：待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，重复步骤二的操作，分离原基组织接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤七：常规法将步骤六所得菌种转接至PDA培养基扩大培养，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，再通过常规法转入二级种即可投入使用。

其原理如下：食用菌的常规组织分离技术并不能达到使菌种脱毒的目的，这是由于子实体已生长至中后期，携带病毒、病菌的概率相当高。菌种脱毒的原理，就是采用先进的尖端分离技术，配合对成熟菌丝体不同阶段、不同形态自然生成物的分离技术以及选用不同基质，使接入种有条件进行选择性生长，并经2-4个循环后，使该菌种彻底摆脱原携病毒、病菌，恢复其原本生物特性。根据该定义，根据品种的不同，反复2-4次循环，并有意令培养基处于不稳定即所谓富养-贫瘠的交替条件下，通过一系列往复操作，使菌种在“脱”掉原携病毒、病菌的前提下，自然恢复和产生较强抗性，保持并恢复菌种原有的优良生物学特性和生产性状。

菌种脱毒的操作过程需花费较长时间，需严格控制脱毒时机进行操作，主要技术要求如下：

（1）要求培养基的配方营养相对贫乏一些。斜面及平板培养基相对贫乏，食用菌菌丝较难发展，但某些病毒、病菌生长也很难发展，而食用菌菌丝相对较有生长优势，再次分离操作时，利用菌丝尖端远离病毒、病菌的条件，可将其“甩”在原在质中而避免重新带入新的培养基质中，从而达到逐步脱毒的目的。

（2）常温培养，或创造相对不适宜的温度等条件，利用食用菌的生产优势，达到脱毒的目的。一般情况下，可采取偏低温度的条件，使食用菌菌丝能够缓慢生长，某些病毒、病菌无法萌动，由此达到分离目的。

（3）菌种脱毒采用的是“尖端”脱毒原理，因此，应适时、及时地进行分离操作，否则，一旦超过时限，病毒、病菌便会“跟踪前进”，使脱毒工作前功尽弃。一旦某环节被延长时间，则很难保证脱毒效果。

（4）脱毒操作需连续进行，中间不得有停顿、保存等过程。如果因时间或其他条件无法完成本次操作，或将某级生物体进行冰箱保存时，则难以达到脱毒目的。

本发明工艺有如下优点：

1、菌种脱毒后，恢复了其原有生物学特性，无论在品种推广还是在菇农生产中，脱毒菌种将彻底保持品种的原有性状。

2、菌种脱毒后，抗逆性明显增强。包括对温度、湿度等外界环境的抗性，以及以某些人为因素如通风不及时、通风量不足等不良生长条件的抗性等，在相对管理比较粗放的情况下，照样长出好蘑菇。

3、脱毒菌种的抗病性提高，较常规菌种的发病率降低60%以上，黄褐病、褐斑病、褐腐病等病害很少发生，原种和栽培种的制种成活率可提高至95%以上。

具体实施方式

实施例1

平菇菌种华平6号的脱毒，具体操作包括如下步骤：

第一循环 ：

（1）使用20毫米×200毫米试管及90毫米培养皿，制备PDA培养基，每只试管内加入浓度0.25-0.5%的氯霉素3滴，每个培养皿内加入浓度0.25-0.5%的氯霉素6滴，使之均匀粘附培养基表面。无菌条件下，常规接入待脱毒的平菇菌种，30℃或常温培养。

（2）菌丝发至近1/2时，接入二级种。二级种常规制作，配方为：棉子壳2500克，过磷酸钙50克，石膏粉50克，尿素15克，链霉素1.5克。瓶口应装基料稍满一些，仅留0.5-1厘米即可。培养：25℃×5天→33℃×10天→20℃×3天-→25℃×5天。发满后，于4-5℃培养24小时，或常温培养。

第二循环 ：

（3）二级种瓶口出现1厘米见方的原基组织块时，制备PDA培养基，同步骤（1）的方法用氯霉素处理PDA培养基表面。无菌条件下，用刀片将原基的表层削掉，换刀片将其纵横各划切4-5刀，使成9-16块的小组织块，每支试管内接入1-2块。培养温度：30℃或常温。

（4）试管发至近1/2时，挑取菌丝尖端0.2-0.3厘米处菌丝体，接入PDA培养基试管及培养皿，接入前同步骤（1）的方法用氯霉素处理PDA培养基表面。培养温度：30℃或常温。

（5）配制二级种：木屑800克，棉子壳1700克，过磷酸钙50克，石膏粉50克，尿素15克，链霉素1.5克，常规制作。将步骤（4）所得试管种接入。培养：25℃×5天→30℃×15天→15℃×5天→25℃×5天，发满后，于4-5℃培养24小时，或常温培养。

第三循环：

（6）瓶口出现1厘米大小原基组织时，制备PDA培养基。一种优选方式为，制备PDA木屑改良养基，配方：土豆150克，木屑50克，棉子壳30克，葡萄糖15克，琼脂粉13克，水1000毫升。将木屑、棉子壳加水共煮费30分钟后，加入土豆再煮沸30分钟，取滤液约1000毫升，加入琼脂粉，加热融化，最后加入葡萄糖，搅拌融化后即可分装。采用同步骤（3）组织分离法将原基组织接入试管及培养皿，接入前同步骤（1）的方法用氯霉素处理PDA培养基表面。培养条件：20℃左右×2天→32℃×2天。也可常温培养。

（7）菌丝发至近1/2时，尖端分离法转入试管及培养皿，方法同步骤（4），常规培养。

（8）制备二级种：棉子壳2500克，石膏粉60克，石灰粉50克，常规制作。将步骤（7）所得试管种接入瓶内，常规培养。

第四循环  

（9）常规制作PDA培养基，分装于试管及培养皿，以步骤（3）的方法分离原基组织，常规法接入PDA培养基，接入前同步骤（1）的方法用氯霉素处理PDA培养基表面。

（10）常规制作PDA培养基，同步骤（1）的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，将步骤（9）所得菌种接入，25℃培养。

(11)将步骤（10）所得菌种转入二级种（不少于20瓶），进行生长观察。将发好菌的二级种，直接进行出菇培养，观察其长速、长相、1-2潮产量，作出品比鉴定，最后确定该批菌种的脱毒操作是否成功。

结果表明：脱毒后菌种抗杂菌能力提高，原种和栽培种的制种成活率由70%提高至95%，子实体品质提高，发病率降低60%。

实施例2

应用于黑木耳新科5号菌种脱毒，所有步骤同实施例1，不同之处仅在于待脱毒的菌种为黑木耳新科5号，结果表明：脱毒后，菌种抗杂菌能力明显提高，原种和栽培种的制种成活率由75%提高至95%，子实体品质也明显提高，发病率降低65%。

实施例3

应用于香菇9608菌种脱毒，所有步骤同实施例1，不同之处仅在于待脱毒的菌种为香菇9608菌种，结果表明：脱毒后，菌种抗杂菌能力明显提高，原种和栽培种的制种成活率由70%提高至97%，子实体更厚实，块形增大，品质提高，发病率降低70%。

Claims (1)

1.一种食用菌菌种的脱毒方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：常规法制作PDA培养基，无菌处理后，无菌条件下在PDA培养基表面滴入浓度0.25-0.5%的氯霉素数滴，使之布满培养基表面，常规组织分离接入待脱毒菌种，常规温度培养；

步骤二：待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，出现1.5厘米大小的原基时，无菌条件下去掉原基表层，将其纵横各划切4-5刀，使成9-16块的小组织块，每支试管内接入1-2块，常规法培养；

步骤三：待菌丝发至1/2时，挑取菌丝尖端2-3mm处的菌丝体，再次接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤四：待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，重复步骤二的操作，分离原基组织接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤五：待菌丝发至1/2时，重复步骤三的操作，以尖端分离法分离菌丝，接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤六：待菌丝发至1/2时，常规法接入二级种培养基进行培养，重复步骤二的操作，分离原基组织接入PDA培养基，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，常规法培养；

步骤七：常规法将步骤六所得菌种转接至PDA培养基扩大培养，接入前按步骤一的方法用氯霉素处理PDA培养基表面，再通过常规法转入二级种即可投入使用。