CN103865801A - 一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，包括：高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段接种液的制备；选取大小均一的蚕蛹，用5%的聚维酮碘液擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min后用无菌水漂洗3次，再用1mol/lNaOH擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min后用无菌水漂洗3次，沥干水分后，取蚕蛹浸蘸浓度大于106个菌丝段/ml的高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段接种液，而后置于用滤纸加无菌水保湿的平皿内，在20-23℃培养，3-5天后大部蚕蛹变硬，再保湿培养3-5天后从蛹体的节间先长出菌丝体和很细小的子实体，进行12h见光培养，12h暗培养，到25-30天时即可收获子实体。本发明能大幅度提高通过体表对家蚕的侵染率、成本较低且易于规模化培养。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法。
背景技术
Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz. 1941（= Isaria tenuipes peck（1879）=Isaria japonica Yasuda（1915）=Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson（1974）= Paecilomyces japonica ）是一种优良的虫草资源，研究发现它在抗癌、抗抑郁、抗虫、抗菌、抗病毒及调节免疫力等方面有明显作用。特别是近年发现，它的一种抗癌成分乙酰环氧单端孢烯二醇（4β – acetoxyscirpene -3α,15 – diol＝AETD）的抗癌活性大约比目前用于临床癌症病患者治疗用的顺铂强4-6倍。药理试验表明高雄山虫草对小鼠毒性口服剂量LD_(50)为70g/kg；腹腔注射 LD_(50)为17.6±1.78g/kg，毒性较低（陈祝安和徐珊，1989）。另外，该菌的小鼠急性毒性和大鼠亚急性毒性实验显示其毒性低，安全范围大（吴真列等，1995）。因此，高雄山虫草无论作为药物开发还是作为保健品应用都具有广阔前景。在韩国，高雄山虫草已经应用于食品及保健品中。而利用家蚕培养虫草是当前工厂化生产虫草子实体，用于药品及保健食品的主要方法之一。虫草菌感染家蚕主要有两种方法，注射法和体表侵染法，其中体表侵染法是一种易于在大规模培养时使用的感染方法，但在通常条件下它的感染率要低于注射法，制约了其在虫草人工培养中的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种能大幅提高体表侵染率、成本较低且易于规模化培养的提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法。
一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，包括以下步骤：
（1）高雄山虫草GZUIFR-PT211 (Cordyceps takaomontana Yakush.& Kumaz. GZUIFR-PT211)菌丝段接种液的制备：
在PDA培养基上活化高雄山虫草GZUIFR-PT211菌种，然后将活化好的菌种接种到液体种子培养基（使用常规马铃薯培养基即可）中，摇床常规培养3-4天后即可备用。制备菌丝段接种液：使用菌丝段生产培养基，接种量20ml/l，摇床转速为200 r/min，26℃下培养96h，将培养好的发酵液用灭菌的双层滤纸过滤即得到高雄山虫草GZUIFR-PT211的菌丝段接种液。
（2）体表侵染及子实体的人工培养
选取大小均一的蚕蛹，用5%的聚维酮碘液擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min后用无菌水漂洗3次，再用1mol/l NaOH擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min后用无菌水漂洗3次，沥干水分后，取蚕蛹浸蘸浓度大于106个菌丝段/ml的高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段接种液，而后置于用滤纸加无菌水保湿的容器内，在20-23℃培养，3-5天后大部蚕蛹变硬，再保湿培养3-5天后从蛹体的节间先长出菌丝体和很细小的子实体，此时将感染的蚕蛹放入较大容器，进行12h见光培养，12h暗培养，在暗培养阶段降低培养温度5℃培养，在侵染20-25天时已生长旺盛，到25-30天时子实体大部分表面披一层白色的孢子粉，此时，子实体已经成熟，可以收获（也可根据使用的不同目的，提前收获）。
上述的一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，其中：第（1）步中的液体种子培养基为常规马铃薯培养基。
上述的一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，其中：第（1）步中的生产培养基配方为：葡萄糖为32.83g/l，硝酸铵为3.19g/l，K2HPO4 1g/l，KCl 0.5 g/l，CaCl2 0.5 g/l，FeSO4 0.01 g/l，初始pH为6。
上述的一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，其中：高雄山虫草GZUIFR-PT211 (Cordyceps takaomontana Yakush.& Kumaz. GZUIFR-PT211)，属于粪壳菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，于2011年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCC No：M 2011217，地址：中国 武汉 武汉大学。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明的：使用一定浓度的NaOH对蚕体进行感染前的预处理是关键一步，会明显提高感染率，解决了体表侵染法中感染率不够理想的瓶颈问题。温度对子实体形成的影响显著，在感染阶段温度超过25°C时，会明显抑制菌株对家蚕的感染，甚至不能感染；菌丝段的浓度对感染效果也有较大影响，浓度为106以下时感染率会明显降低；本方法操作简单，节省时间、人力和物力，同时也没有注射法的创伤造成蚕体感染腐败的风险，有利于降低成本和进行规模化培养。
具体实施方式
一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，包括以下步骤：
（1）高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段的制备：
在PDA培养基上活化高雄山虫草GZUIFR-PT211菌种，然后将活化好的菌种接种到液体种子培养基（使用常规马铃薯培养基即可）中，摇床常规培养3-4天后即可备用。将培养好的种子培养液接种到菌丝段生产培养基（葡萄糖为32.83g/l，硝酸铵为3.19g/l， K2HPO4 1g/l，KCl 0.5 g/l，CaCl2 0.5 g/l，FeSO4 0.01 g/l，初始pH为6）中进行培养，培养条件为：接种量20ml/l，摇床转速为200 r/min，26℃下培养96h，将培养好的发酵液用灭菌的双层滤纸过滤即得到高雄山虫草GZUIFR-PT211的菌丝段接种液；
（2）体表侵染及子实体的人工培养
选取30头大小均一的蚕蛹，放入盘中，用5%的聚维酮碘液擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min 后用无菌水漂洗3次，再用1mol/L NaOH擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min 后用无菌水漂洗3次，沥干水分后，在超净台上用灭菌的镊子夹取蚕蛹浸蘸制备好的浓度大于106个菌丝段/ml的高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段接种液，而后置于用滤纸加无菌水保湿的容器内，在20-23℃培养，侵染后蛹体不久变黑，3-5天后大部蚕蛹变硬，感染率可达90%以上，再保湿培养2-5天后从蛹体的节间先长出菌丝体和很细小的子实体，此时将感染的蚕蛹放入较大容器，进行12h见光培养，12h暗培养，在暗培养阶段降低培养温度5℃培养，培养中可观察到节间、气孔等处的子实体进一步发育长高。在侵染20-25天时已生长旺盛，到25-30天时子实体大部分表面披一层白色的孢子粉，此时，子实体已经成熟，可以收获（也可根据使用的不同目的，提前收获）。整个培养周期约4周左右。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，包括以下步骤：
（1）高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段接种液的制备：
在PDA培养基上活化高雄山虫草GZUIFR-PT211菌种，然后将活化好的菌种接种到液体种子培养基中，摇床常规培养3-4天后即可备用；制备菌丝段接种液：使用菌丝段生产培养基，接种量20ml/l，摇床转速为200 r/min，26℃下培养96h，将培养好的发酵液用灭菌的双层滤纸过滤即得到高雄山虫草GZUIFR-PT211的菌丝段接种液；
（2）体表侵染及子实体的人工培养
选取大小均一的蚕蛹，用5%的聚维酮碘液擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min后用无菌水漂洗3次，再用1mol/l NaOH擦涂或喷施于蚕蛹体表，作用5min后用无菌水漂洗3次，沥干水分后，取蚕蛹浸蘸浓度大于106个菌丝段/ml的高雄山虫草GZUIFR-PT211菌丝段溶液，而后置于用滤纸加无菌水保湿的容器内，在20-23℃培养，3-5天后大部蚕蛹变硬，再保湿培养3-5天后从蛹体的节间先长出菌丝体和很细小的子实体，此时将感染的蚕蛹放入较大容器，进行12h见光培养，12h暗培养，在暗培养阶段降低培养温度5℃培养，在侵染20-25天时已生长旺盛，到25-30天时子实体大部分表面披一层白色的孢子粉，此时，子实体已经成熟。
2.如权利要求1所述的一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，其中：第（1）步中的液体种子培养基为常规马铃薯培养基。
3.如权利要求1或2所述的一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，其中：第（1）步中的生产培养基配方为：葡萄糖为32.83g/l，硝酸铵为3.19g/l，K2HPO4 1g/l，KCl 0.5 g/l，CaCl2 0.5 g/l，FeSO4 0.01 g/l，初始pH为6。
4.如权利要求3所述的一种提高高雄山虫草体表侵染家蚕产子实体率的方法，其中：高雄山虫草GZUIFR-PT211，保藏号：CCTCC No：M 2011217。
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