CN106978354B - 一种高纯度块菌菌种的培育方法 - Google Patents

一种高纯度块菌菌种的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高纯度块菌菌种的培育方法，其特征是块菌子囊果去除杂质、用水清洗干净并表面消毒后，将子囊果内孢子组织在试管内进行培养，然后对培养出的母种进行提纯和复壮，高纯度复壮菌种接入到食用菌液体母种电磁涡流增氧机内进行液体母种培养，培养出的液体母种接入到培养罐中培养液体生产用菌种。使用本发明培育块菌菌种繁殖系数高，原料成本低；从子囊果分离得到的菌种，经过驯化、提纯、复壮等一系列技术处理后，提高了菌种的纯度，激活了子囊果孢子的活性，提高了菌种生命力及种苗的合成感染率；获得的菌种满足低温存放时的养份供应，保藏容易和保藏时间长。使用本发明生产的块菌菌种质量好、成本低。

Description

一种高纯度块菌菌种的培育方法
技术领域
本发明涉及一种块菌菌种的培育方法，特别涉及一种高纯度块菌菌种的培育方法。
背景技术
块菌（Truffles）为了囊菌类、块菌目（Tuberales）、块菌科（Tuberaceae）、块菌属（Tuber），是一类与维管束植物形成共生关系，具有很高营养价值与经济开发价值的地下名贵食用真菌、除具有较高的维生素B1、维生素B2与独特的口感及香味外，其内所含的雄性酮类成份是其它类食用菌所无法与之相比的，特别是欧美等国家块菌号称“黑色钻石”。
过去块菌主要靠自然生长，随着需求量的增长，掠夺式的采挖已导致自然野生产量逐年下降，目前已成为濒危物种。近年来，逐步开展了人工栽培块菌的研究，但种苗接种块菌所用的菌种均采用块菌子囊果经表面消毒处理后，用破碎机破碎使子囊组织内孢子出壳后制成匀浆无菌稀释液。这种块菌菌种的生产方法：1、需要大量的块菌子囊果，繁殖系数低，原料成本高；2、贮存难度大，如果子囊果在4～6℃的冷藏箱内低温保存，由于子囊果内所含孢子只能存活7～18天，并且随着保藏时间的增加、子囊果内孢子因缺乏营养及水份补给而逐步失去活性，18天后，子囊果内孢子将逐步死亡，贮存时间短；如果在-20℃~-25℃的冷冻箱内冷冻保存，所保存的子囊果因生物处于超低温静态休眠状态，生物停止了新陈代谢，虽然将物种保存了下来，但经解冻活化后重新培育的子囊果内孢子活性只有新采挖时的60-70%，甚至不及一半的活性。3、由于低温或冷冻保存的子囊果、解冻后未经过提纯与复壮等技术手段而且直接用于悬浮液种子的制作，并直接用于合成苗的生产上，导致合成苗感染及成品率下降。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种繁殖系数高、纯度高、容易保藏、活性强的块菌菌种培育方法。
本发明是这样实现的：包括块菌子囊果处理、试管母种培养、母种提纯复壮、液体母种培养、液体生产用菌种培养，其特征是：
1、块菌子囊果处理：选取野生生长饱满、桑椹状突疣较少，疣突较园钝，手捏相对较硬，未见自然裂纹，经显微观察剖开后的子囊果孢子纹理清晰、成熟的黑褐色孢子占总孢子量的80%以上，与未成熟的黄褐色的孢子占总孢子量的20%以下，作为分离用材料。将选用的子囊果，去除杂质后用水清洗干净、并表面消毒；
2、试管母种培养：将步骤1的块菌子囊果在超净工作台上用经消毒灭菌后的手术刀剥去皮层后，将露出的子囊果内孢子组织切割后接入已通过灭菌的试管内进行培养，培养温度为10～38℃，培养时间为15～18天，培养基配方为：鲜阔叶木屑煎汁液130～150mL，鲜松毛煎汁液130～150mL，马铃薯煎汁液270～300mL，块菌生长土浸泡液400～470mL，麦芽糖15～20g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，琼脂18～20g/L，pH值4.5～7.5，鲜阔叶木屑煎汁液为鲜阔叶木屑与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，鲜松毛煎汁液为鲜松毛与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，马铃薯煎汁液为马铃薯与水按质量比1：1.4～1.5混合后煮10～15分钟后的滤液，块菌生长土浸泡液为块菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；
3、母种提纯复壮：按步骤2培养基配方配制的培养基在121℃高压下灭菌20～30分钟，冷却至30～45℃时，加入5.1～5.5万单位/L的金霉素混合均匀后，倒入步骤2的试管内，覆盖母种厚度1～3mm，凝固后放置在18～25℃条件下培养10～15天后，挑取先端菌丝转管复壮，在15～25℃条件下培养18～20天，转管培养的培养基配方与步骤2培养基相同；
4、液体母种培养：液体母种培养液经121℃高压灭菌20～30分钟，冷却后放入食用菌液体母种电磁涡流增氧机内，将步骤3得到的高纯度复壮菌种接入到食用菌液体母种电磁涡流增氧机内，在转速80～300转/分钟，温度18～28℃的条件下培育15～18天，液体母种培养液的配方为：鲜阔叶木屑煎汁液130～150mL，鲜松毛煎汁液130～150mL，马铃薯煎汁液270～300mL，块菌生长土浸泡液400～470mL，麦芽糖5～10g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，蛋白胨0.5～10g/L，VB1 5～50mg/L，pH值7.5～8.5，鲜阔叶木屑煎汁液为鲜阔叶木屑与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，鲜松毛煎汁液为鲜松毛与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，马铃薯煎汁液为马铃薯与水按质量比1：1.4～1.5混合后煮10～15分钟后的滤液，块菌生长土浸泡液为块菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；
5、液体生产用菌种培养：将按步骤4培养液配方配制的培养液添加聚氧丙烯甘油0.1~0.4 mL /L后高压灭菌，灭菌冷却后添加金霉素5.1～5.5万单位/L，混合均匀后装入培养罐中，装至培养罐的5/7，接入步骤4培养的液体母种，接入量为培养液体积的5～10%，温度18～28℃的条件下培育15～18天，即成为液体生产用菌种。
使用本发明培育块菌菌种，一是繁殖系数高，一只块菌子囊果可以培育出成千上万倍的块菌菌种，原料成本低；二是块菌菌种纯度和活性高，从子囊果分离得到的菌种，经过驯化、提纯、复壮等一系列技术处理后，提高了菌种的纯度，激活了子囊果孢子的活性，提高了菌种生命力及种苗的合成感染率；三是保藏容易和保藏时间长，用本发明获得的菌种满足低温存放时的养份供应，只需存放于4～6℃的冷藏箱内，每隔1～3个月转管一次，可以长期低温保存。使用本发明生产的块菌菌种质量好、成本低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作具体说明。
1、块菌子囊果处理：选取野生生长饱满、桑椹状突疣较少，疣突较园钝，手捏相对较硬，未见自然裂纹，经显微观察剖开后的子囊果孢子纹理清晰、成熟的黑褐色孢子占总孢子量的80%以上，与未成熟的黄褐色的孢子占总孢子量的20%以下，作为分离用材料。将选用的子囊果，去除杂质后用水清洗干净，用75%乙醇浸泡25～30分钟，乙醇浸泡后的子囊果用无菌水冲洗3～4次后，再用质量比为0.1～0.2%的HgCl2溶液浸泡6～15分钟，无菌水冲洗5～6次。
2、试管母种培养：将步骤1的块菌子囊果在超净工作台上用经消毒灭菌后的手术刀剥去皮层后，将露出的子囊果内含孢子组织切割后接入已通过灭菌的试管内进行培养，培养温度为10～38℃，培养时间为15～18天，3～5天后可见菌丝萌发生长，培养15～18天可长满试管斜面，培养基配方为：鲜阔叶木屑煎汁液130～150mL，鲜松毛煎汁液130～150mL，马铃薯煎汁液270～300mL，块菌生长土浸泡液400～470mL，麦芽糖15～20g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，琼脂18～20g/L，pH值4.5～7.5，鲜阔叶木屑煎汁液为鲜阔叶木屑与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，鲜松毛煎汁液为鲜松毛与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，马铃薯煎汁液为马铃薯与水按质量比1：1.4～1.5混合后煮10～15分钟后的滤液，块菌生长土浸泡液为块菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；
3、母种提纯复壮：按步骤2培养基配方配制的培养基在121℃高压下灭菌20～30分钟，冷却至30～45℃时，加入5.1～5.5万单位/L的金霉素混合均匀后，倒入步骤2的试管内，覆盖母种厚度1～3mm，凝固后放置在18～25℃条件下培养10～15天后，挑取先端菌丝转管复壮，在15～25℃条件下培养18～20天，可以反复2～3次操作，将得到驯化后的纯度更高的块菌母种，转管培养的培养基配方与步骤2培养基相同；
4、液体母种培养：液体母种培养液经121℃高压灭菌20～30分钟，冷却后放入食用菌液体母种电磁涡流增氧机内，将步骤3得到的高纯度复壮菌种接入食用菌液体母种电磁涡流增氧机内，在转速80～300转/分钟，温度18～28℃的条件下培育15～18天，培育5～8天后，接入的菌丝片段开始萌发，但尚未形成菌球，培养液由原来的浑浊逐渐变为清澈，培育9～15天后，培养液由清澈变为光亮状、并已形成菌球、培育15-18天后，随着培育时间的延长、菌球逐渐长大，肉眼可见，培养液变为更加光亮，菌球含量占整个培养液的70～90%时，可用做规模化生产的专用液体母种；液体母种培养液的配方为：鲜阔叶木屑煎汁液130～150mL，鲜松毛煎汁液130～150mL，马铃薯煎汁液270～300mL，块菌生长土浸泡液400～470mL，麦芽糖5～10g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，蛋白胨0.5～10g/L，VB1 5～50mg/L，pH值7.5～8.5，鲜阔叶木屑煎汁液为鲜阔叶木屑与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，鲜松毛煎汁液为鲜松毛与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，马铃薯煎汁液为马铃薯与水按质量比1：1.4～1.5混合后煮10～15分钟后的滤液，块菌生长土浸泡液为块菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；
5、液体生产用菌种培养：将按步骤4培养液配方配制的培养液添加聚氧丙烯甘油0.1~0.4 mL /L后高压灭菌，灭菌冷却后添加金霉素5.1～5.5万单位/L，混合均匀后装入培养罐中，装至培养罐的5/7，接入步骤4培养的液体母种，接入量为培养液体积的5～10%，温度18～28℃的条件下培育15～18天，即成为液体生产用菌种。添加聚氧丙烯甘油后可以防止高压灭菌过程中培养液沸腾后产生液泡，避免培养液渗出罐体给外界杂菌带来入侵的机会，避免成品率低、菌种质量差等诸多问题，添加金霉素后，在培养过程中可以抑制霉菌的产生和生长，提高产品的纯度和质量。

Claims (3)

1.一种高纯度块菌（Truffles）菌种的培育方法，包括块菌子囊果处理、试管母种培养、母种提纯复壮、液体母种培养、液体生产用菌种培养，其特征是：
（1）块菌子囊果处理：选取野生生长饱满、桑椹状突疣少，疣突园钝，手捏相对较硬，未见自然裂纹，经显微观察剖开后的子囊果孢子纹理清晰、成熟的黑褐色孢子占总孢子量的80%以上，与未成熟的黄褐色的孢子占总孢子量的20%以下，作为分离用材料，将选用的块菌子囊果，去除杂质后用水清洗干净、并表面消毒；
（2）试管母种培养：将步骤（1）处理的块菌子囊果在超净工作台上用经消毒灭菌后的手术刀剥去皮层后，将露出的子囊果内孢子组织切割后接入已通过灭菌的试管内进行培养，培养温度为10～38℃，培养时间为15～18天，培养基配方为：鲜阔叶木屑煎汁液130～150mL，鲜松毛煎汁液130～150mL，马铃薯煎汁液270～300mL，块菌生长土浸泡液400～470mL，麦芽糖15～20g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，琼脂18～20g/L，pH值4.5～7.5，鲜阔叶木屑煎汁液为鲜阔叶木屑与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，鲜松毛煎汁液为鲜松毛与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，马铃薯煎汁液为马铃薯与水按质量比1：1.4～1.5混合后煮10～15分钟后的滤液，块菌生长土浸泡液为块菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；
（3）母种提纯复壮：按步骤（2）培养基配方配制的培养基在121℃高压下灭菌20～30分钟，冷却至30～45℃时，加入5.1～5.5万单位/L的金霉素混合均匀后，倒入步骤（ 2 ） 的试管内，覆盖母种厚度1～3mm，凝固后放置在18～25℃条件下培养10～15天后，挑取先端菌丝转管复壮，在15～25℃条件下培养18～20天，转管培养的培养基配方与步骤（ 2 ） 培养基相同；
（4）液体母种培养：液体母种培养液经121℃高压灭菌20～30分钟，冷却后放入食用菌液体母种电磁涡流增氧机内，将步骤（3）得到的高纯度复壮菌种接入到食用菌液体母种电磁涡流增氧机内，在转速80～300转/分钟，温度18～28℃的条件下培育15～18天，液体母种培养液的配方为：鲜阔叶木屑煎汁液130～150mL，鲜松毛煎汁液130～150mL，马铃薯煎汁液270～300mL，块菌生长土浸泡液400～470mL，麦芽糖5～10g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，蛋白胨0.5～10g/L，VB1 5～50mg/L，pH值7.5～8.5，鲜阔叶木屑煎汁液为鲜阔叶木屑与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，鲜松毛煎汁液为鲜松毛与水按质量比1：1.3～1.5混合后煮20～30分钟后的滤液，马铃薯煎汁液为马铃薯与水按质量比1：1.4～1.5混合后煮10～15分钟后的滤液，块菌生长土浸泡液为块菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；
（5）液体生产用菌种培养：将按步骤（4）培养液配方配制的培养液添加聚氧丙烯甘油0.1~0.4 mL /L后高压灭菌，灭菌冷却后添加金霉素5.1～5.5万单位/L，混合均匀后装入培养罐中，装至培养罐的5/7，接入步骤（4）培养的液体母种，接入量为培养液体积的5～10%，温度18～28℃的条件下培育15～18天，即成为液体生产用菌种。
2.根据权利要求1所述的高纯度块菌菌种的培育方法，其特征是块菌子囊果处理时，将选用的子囊果，去除杂质后用水清洗干净，用75%乙醇浸泡25～30分钟，乙醇浸泡后的子囊果用无菌水冲洗3～4次后，再用质量比为0.1～0.2%的HgCl2溶液浸泡6～15分钟，无菌水冲洗5～6次。
3.根据权利要求1所述的高纯度块菌菌种的培育方法，其特征是母种的提纯和复壮反复2～3次操作。
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