CN106258955A - 一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，包括以下步骤：（1）果实筛选；（2）将步骤（1）得到罗汉果果实进行外表面消毒处理；（3）获取罗汉果种子并进行灭菌处理：（4）获取胚乳细胞：用无菌刀将灭菌处理过的种子的种壳切开，取出种子中的胚细胞，再用无菌镊子将胚细胞中的胚乳细胞取出，得到胚乳细胞；（5）制备培养基，培养基的组分为MS+（0.5~1.5）mg/L 6‑BA+（0.05~0.5）mg/L NAA。（6）接种培养：将步骤（4）中得到的胚乳细胞接种到步骤（5）制备得到的培养基中进行培养即可诱导成苗。本发明通过组织培养技术可以获得大量的无菌苗，繁殖速度快，植株结构完整，解决了罗汉果种子发芽率低，外植体组培诱导成苗染菌力成活率高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，属于生物技术领域。
背景技术
罗汉果（Siraitia grosvenorii）是葫芦科多年生藤本植物。其叶心形，雌雄异株，夏季开花，秋天结果。我国传统中药以其果实入药，含有罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等药用成分，主治肺热痰火咳嗽、咽喉炎、扁桃体炎、急性胃炎、便秘等 。此外，罗汉果为卫生部首批公布的药食两用名贵中药材，其所含罗汉果甜甙比蔗糖甜300倍，不产生热量，是饮料、糖果行业的名贵原料，是蔗糖的最佳替代品。常饮罗汉果茶，可防多种疾病，现代医学证明，罗汉果对支气管炎、高血压等疾病有显著疗效，还是起到防治冠心病、血管硬化、肥胖症的作用，因此市场对罗汉果的需求十分旺盛。同时罗汉果是我国特有的珍贵葫芦科植物，素有良药佳果之称。果实中含有丰富的葡萄糖、果糖及多种维生素等，用途广泛，畅销国内外市场，在国际市场上享有很高罗汉果的声誉。
近年来，由于市场需求的扩大，为满足罗汉果的需求量的增加，人工大量繁育和栽培罗汉果势在必行。罗汉果种子的种壳坚硬，在催芽前不将种壳去掉，很难吸水，发芽十分缓慢，且不整齐，因此在自然状况下很难萌发和生长，实生苗的栽培较为困难，传统的栽培主要靠嫁接繁殖，但嫁接繁殖周期长，而且耗时量大，很难满足大量栽培的需要，组织培养技术可以快速繁殖大量的种苗，远比分株繁殖快速高效。但罗汉果外植体组培易被微生物污染，成苗率以及成活率低，所以为了提高罗汉果组培获得无菌苗的成活率，提供一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，是亟待解决的一个问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，提高罗汉果组培获得无菌苗成苗率，并提高无菌苗的成活率，以克服现有技术的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，包括以下步骤：
（1）果实筛选：采摘并筛选出健康、无病虫害的罗汉果果实；
（2）将步骤（1）得到罗汉果果实进行外表面消毒处理；
（3）获取罗汉果种子并进行灭菌处理：
（4）获取胚乳细胞：用无菌刀将灭菌处理过的种子的种壳切开，取出种子中的胚细胞，再用无菌镊子将胚细胞中的胚乳细胞取出，得到胚乳细胞；
（5）制备培养基，培养基的组分为MS+（0.5~1.5）mg/L 6-BA+（0.05~0.5）mg/L NAA。
（6）接种培养：将步骤（4）中得到的胚乳细胞接种到步骤（5）制备得到的培养基中进行培养，即可诱导成苗。
优选的，步骤（1）中，所筛选的罗汉果果实，其成熟度为八至九成熟，即罗汉果果实的果皮颜色表现在青黄之间。
步骤（2）中，包括对未开裂的罗汉果果实进行外表面消毒、以及对开裂的罗汉果果进行外表面消毒：
未开裂果实外表面具体消毒方法为：采用流动水冲洗30~60min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有75%酒精的烧杯里消毒3~5min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，即可；
开裂果实外表面具体消毒方法为：采用流动水冲洗30~60min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有0.1%HgCl溶液的烧杯里消毒3~5min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，即可。
优选的，步骤（3）的种子灭菌处理的方法为：将已消毒的果实用无菌刀切开果皮，取出种子放入已灭菌的烧杯中，用无菌水冲洗3~5次，将种子上的果肉冲洗掉，再将冲洗好的种子用浓度为75%酒精消毒30s，用无菌水清洗3~5次，再用浓度为0.1%HgCl溶液消毒10min，用无菌水清洗3~5次，即可。
优选的，步骤（5）中，培养基的组分具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
优选的，步骤（6）中，培养温度为27±2℃，每天光照时间为11h，光照强度为1700lx。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、所制备的培养基中，提供了诱导苗生长所需的大量元素、微量元素、有机质以及N、P、K，能促进幼苗的快速生长，整个过程中，采用严格的灭菌处理，通过组织培养技术可以获得大量的无菌苗，繁殖速度快，植株结构完整，解决了罗汉果种子发芽率低，外植体组培诱导成苗染菌力成活率高的问题。
2、本发明选用八成熟的罗汉果果实来获取种子的胚乳细胞进行培养，由于八成熟的果实，其胚乳细胞还处于成长阶段，有着较旺盛的生长能力，因此采用八成熟的果实的胚乳细胞来培养，无菌苗成活率就得以大大提高。3、
3、采用本发明生产罗汉果人工幼苗不受季节限制，节省制种用地，可实现工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对发明进行进一步介绍：
实施例1：
一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，包括以下步骤：
（1）果实筛选：采摘并筛选出健康、无病虫害的罗汉果果实；
（2）将步骤（1）得到罗汉果果实进行外表面消毒处理；
（3）获取罗汉果种子并进行灭菌处理：
（4）获取胚乳细胞：用无菌刀将灭菌处理过的种子的种壳切开，取出种子中的胚细胞，再用无菌镊子将胚细胞中的胚乳细胞取出，得到胚乳细胞；
（5）制备培养基，培养基的组分为MS+（0.5~1.5）mg/L 6-BA+（0.05~0.5）mg/L NAA。
（6）接种培养：将步骤（4）中得到的胚乳细胞接种到步骤（5）制备得到的培养基中进行培养，即可诱导成苗。
在本实施例中，步骤（1）中，所筛选的罗汉果果实，其成熟度为八成熟，即罗汉果果实的果皮颜色表现在青黄之间。
进一步的，步骤（2）中，包括对未开裂的罗汉果果实进行外表面消毒、以及对开裂的罗汉果果进行外表面消毒：
未开裂果实外表面具体消毒方法为：采用流动水冲洗30~60min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有75%酒精的烧杯里消毒3~5min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，即可；
开裂果实外表面具体消毒方法为：采用流动水冲洗30~60min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有0.1%HgCl溶液的烧杯里消毒3~5min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，即可。
在步骤（3）的种子灭菌处理的方法为：将已消毒的果实用无菌刀切开果皮，取出种子放入已灭菌的烧杯中，用无菌水冲洗3~5次，将种子上的果肉冲洗掉，再将冲洗好的种子用浓度为75%酒精消毒30s，用无菌水清洗3~5次，再用浓度为0.1%HgCl溶液消毒10min，用无菌水清洗3~5次，即可。
作为本发明的优选方案，步骤（5）中，培养基的组分具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
作为本发明的优选方案，步骤（6）中，培养温度为27±2℃，每天光照时间为11h，光照强度为1700lx。
实施例2：
进行实验组试验：
步骤（1）：选取八成熟（果实的果皮颜色表现在青黄之间）、且未开裂的罗汉果果实。
步骤（2）：对选取出来的果实进行表面消毒处理，采用流动水冲洗45min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有75%酒精的烧杯里消毒4min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，得的果实。
步骤（3）：将已消毒的果实用无菌刀切开果皮，取出种子放入已灭菌的烧杯中，用无菌水冲洗4次，将种子上的果肉冲洗掉，再将冲洗好的种子用浓度为75%酒精消毒30s，用无菌水清洗4次，再用浓度为0.1%HgCl溶液消毒10min，得到灭菌的种子。
步骤（4）：用无菌刀将灭菌处理过的种子的种壳切开，取出种子中的胚细胞，再用无菌镊子将胚细胞中的胚乳细胞取出，得到胚乳细胞。
步骤（5）：制备培养基，其组分具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
步骤（6）：将步骤（4）中得到的胚乳细胞接种到步骤（5）制备得到的培养基中进行培养，培养株数为400株，诱导成苗。
进行对照组试验：步骤（1）选取成熟（果实的果皮颜色表现为黄色）、且未开裂的罗汉果果实。其余步骤与实验组的相同。
观察实验组和对照组的出苗率，结果如表1所示：
表1 实验组与对照组的胚乳细胞诱导后的出苗率数据统计（n=3, 400株）
根据公式：发芽率=（发芽数/总数）×100%，由此可以计算出在4周后罗汉果的成苗率。
实验组的发芽率=（388/400）×100%=97%
对照组的发芽率=（272/400）×100%=68%
以上试验数据表明：本发明是人工诱导罗汉果成苗快繁技术中能够大大提高成苗率的一种方法，且选用八成熟果实的胚乳细胞诱导成苗率为97%。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）果实筛选：采摘并筛选出健康、无病虫害的罗汉果果实；
（2）将步骤（1）得到罗汉果果实进行外表面消毒处理；
（3）获取罗汉果种子并进行灭菌处理：
（4）获取胚乳细胞：用无菌刀将灭菌处理过的种子的种壳切开，取出种子中的胚细胞，再用无菌镊子将胚细胞中的胚乳细胞取出，得到胚乳细胞；
（5）制备培养基：培养基的组分为MS+（0.5~1.5）mg/L 6-BA+（0.05~0.5）mg/L NAA；
（6）接种培养：将步骤（4）中得到的胚乳细胞接种到步骤（5）制备得到的培养基中进行培养，即可诱导成苗。
2.根据权利要求1所述的一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，其特征在于：步骤（1）中，所筛选的罗汉果果实，其成熟度为八成熟，即罗汉果果实的果皮颜色表现在青黄之间。
3.根据权利要求1所述的一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，其特征在于：步骤（2）中，包括对未开裂的罗汉果果实进行外表面消毒、以及对开裂的罗汉果果进行外表面消毒，
未开裂果实外表面具体消毒方法为：采用流动水冲洗30~60min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有75%酒精的烧杯里消毒3~5min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，即可；
开裂果实外表面具体消毒方法为：采用流动水冲洗30~60min，使表面的泥沙冲洗干净，之后放置于盛装有0.1%HgCl溶液的烧杯里消毒3~5min，再将消毒过的果实放置在无菌操作台上，再用溶度浓度为0.1%HgCl溶液对果实消毒3min，之后用无菌水清洗，再用溶度为75%酒精消毒5min，之后用无菌水清洗，即可。
4.根据权利要求1所述的一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，其特征在于：步骤（3）的种子灭菌处理的方法为：将已消毒的果实用无菌刀切开果皮，取出种子放入已灭菌的烧杯中，用无菌水冲洗3~5次，将种子上的果肉冲洗掉，再将冲洗好的种子用浓度为75%酒精消毒30s，用无菌水清洗3~5次，再用浓度为0.1%HgCl溶液消毒10min，用无菌水清洗3~5次，即可。
5.根据权利要求1所述的一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，其特征在于：步骤（5）中，培养基的组分具体为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
6.根据权利要求1所述的一种诱导罗汉果胚乳细胞成苗的方法，其特征在于：步骤（6）中，培养温度为27±2℃，每天光照时间为11h，光照强度为1700lx。
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