KR100772941B1

KR100772941B1 - 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지와 이를이용한 사포닌 함유 부정근의 대량증식방법

Info

Publication number: KR100772941B1
Application number: KR1020060119526A
Authority: KR
Inventors: 오병권; 강준희
Original assignee: 오병권
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2007-11-05

Abstract

본 발명은 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지와 이를 이용한 사포닌 함유 부정근의 대량증식방법에 관한 것이다.

본 발명의 식물배양배지를 이용한 사포닌 함유 식물 부정근의 대량증식방법은, 감귤과즙에 대나무추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ로 혼합하여 식물배양배지를 제조하고, 사포닌이 함유된 식물체를 살균 소독한 후 멸균수로 세척하여 3 ~ 5 ㎜씩 절단한 다음, 절단된 절편을 MS배지에 치상하여 캘루스를 유도한 후, 계대배양하여 캘루스를 증식하고, 이 캘루스를 MS배지에서 부정근을 유도한 다음, 상기에서 준비한 식물배양배지에 배양한 후, 양호하게 생육한 부정근을 생물반응기에 넣고 대량증식하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해 사포닌 함유 식물의 부정근 대량증식시 배양과정이 용이하고, 배양기간이 단축되고, 부정근의 생체 증가율이 높은 식물배양배지가 제공되며, 본 발명의 대량증식시 인공생장조절제 등을 사용하지 않고 천연재료만을 사용하여 안전하여 음료조성물, 식품첨가제 등으로 사용될 수 있는 사포닌 함유 식물의 부정근이 제공된다.

부정근, 사포닌, 감귤, 대나무, 배지

Description

대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지와 이를 이용한 사포닌 함유 부정근의 대량증식방법{PLANT MEDIUM USING BAMBOO EXTRACTS AND CITRUS JUICE, AND MASS PROPAGATION METHOD OF ADVENTITIOUS ROOT CONTAINED SAPONIN USING THAT}

도 1은 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지의 제조공정도.

도 2는 본 발명의 식물배양배지를 이용한 사포닌 함유식물의 부정근 대량증식 공정도1.

도 3은 본 발명의 식물배양배지를 이용한 사포닌 함유식물의 부정근 대량증식 공정도2.

도 4는 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지를 이용하여 6년근 인삼의 부정근 대량증식 과정 사진.

도 5는 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지를 이용하여 배양한 산삼 부정근 사진.

최근 생물산업의 급속한 발달에 따라 식의약품 등의 개발 원료용으로써 희소가치가 있는 산삼 등의 약용 식물의 일부분(캘루스, 부정근 등)을 대용량 생물반응기 등을 이용하여 단시간 내에 대량생산하는 것이 가능해졌다.

현재 생물 산업용으로 이용하는 식물조직배양법은 식물조직으로부터의 캘루스와 부정근 및 식물체 등을 대량유도 생산하기 위하여 MS배지, SH배지, 화이트 배지(White 배지) 등을 이용한 화학약품과 2,4-D, NAA, IBA 등의 식물생장조절제, 그리고 산삼 등의 부정근 유도에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려진 아그로박테리움(Agrobacterium)과 같은 미생물접종방법이 등이 사용되고 있다.

그러나, 이러한 공정으로 생산된 부정근 등에는 식물생장조절제는 물론 배양과정에 이용하는 인공배지 유래의 무기염류, 미생물 등이 다소 함유되어 있으므로, 보다 안전한 식품 및 의약품의 목적으로 이용할 수 있도록 화학약품과 식물생장조절제 및 미생물이 첨가되지 않은 천연재료를 배지로 이용한 식물의 대량배양방법이 요구되고 있다.

한국등록특허공보 10-0537176 "천연과일을 배지로서 이용하여 사포닌 함유식물의 부정근을 대량증식하는 방법”에는, 사포닌을 함유하는 식물의 조직을 배양하여 캘루스를 유도하고, 유도된 캘루스에서 부정근을 유도 증식시킨 후, 유도된 부 정근을 감귤, 사과, 토마토, 당근, 백년초, 포도를 착즙하여 제조한 배지에서 배양하여 대량증식하는 방법에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 상기의 종래기술은 식물 과피 유래의 펄프성 섬유질이 산삼, 인삼, 오가피 등의 배양체의 부정근과 결합하여 덩어리를 형성하고, 침전물이 다량 생성되며, 이로 인해 배양기간이 길어지고 침전물을 제거해야 하는 작업의 불편함도 발생하여 그 효율성이 떨어지는 문제가 있었다.

한편, 2000년대에 들어 제주도 감귤의 년간 평균 생산량은 60 만톤 이상으로 과잉생산되고 있어 지역산업경제의 몰락을 야기하는 가장 큰 문제가 되고 있으나, 여전히 감귤의 소비형태는 과일 그 자체로 생식하는 생과 거래에 크게 의존하고 있는 실정이다.

근래 감귤가공공장이 설립되어 비상품의 부분적인 감귤 농축액으로의 가공이 이루어지고는 있으나, 값싼 수입 오렌지 농축액에 비하여 경쟁력이 떨어져 해마다 적자경영을 하고 있어 실질적인 해결책이 되고 있지 않다.

따라서, 과잉생산되는 감귤의 새로운 가공방법의 개발로 가공비율을 높여 수급조절은 물론 부가가치 제고에 의한 감귤재배농가의 소득증대를 이끌 수 있는 방안이 절실히 요구되고 있다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위해 감귤을 이용하면서 식물생장호르몬의 역할을 할 수 있도록 개발된 새로운 식물배양배지를 이용하여 사포닌 함유식물의 부정근을 대량증식하고, 이 대량증식된 사포닌 함유 부정근 및 그 배양체가 식품 및 의약품 등의 산업에 다양하게 이용하기 위해 보다 많은 연구가 필요한 실정이다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해서, 대나무추출물과 감귤과즙을 이용하여 식물배양배지를 제조하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 식물배양배지를 이용하여 사포닌 함유 식물의 부정근 대량증식시 배양과정이 용이하고, 배양기간이 단축되며, 인공 생장조절제 등의 인공재료를 사용하지 않고 천연재료만을 사용하여 안전하며, 부정근의 생체 증가율이 뛰어나 그 효과가 뛰어난 식물배양배지를 제조하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 식물배양배지를 이용하여 대량배양된 사포닌 함유 식물체의 부정근이 유효성분으로 포함된 식품조성물을 제조하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 식물배양배지를 이용한 사포닌 함유 식물 부정근의 대량증식은, 대나무추출물과 감귤과즙을 혼합하여 식물배양배지를 제조하는 제1공정, 인삼, 및 산삼 등의 식물체를 살균 소독한 후 멸균수로 3 ~ 5 회 세척하여 3 ~ 5 ㎜씩 절단하는 제2공정, 제2공정에서 절단된 절편을 MS배지에 치상하여 7 ~ 10 일 동안 암처리한 다음, 암처리된 절편을 14 ~ 16 시간동안 24 ~ 28 ℃로, 3,000 ~ 5,000 룩스 의 광조건 하에서 캘루스를 유도한 후, 2 ~ 4 주 간격으로 계대배양하여 캘루스를 증식하는 제3공정, 제3공정에서 유도된 캘루스를 MS배지에서 부정근을 유도하는 제4공정, 제4공정에서 유도된 부정근을 제1공정에서 준비한 식물배양배지에 배양하는 제5공정, 제5공정에서 양호하게 생육한 부정근을 생물반응기에 넣고 대량증식하는 제6공정을 거쳐 사포닌 함유 식물의 부정근을 대량증식한다.

또한, 본 발명의 또 다른 대량증식 방법으로써, 대나무추출물과 감귤과즙을 혼합하여 식물배양배지를 제조하여 준비하는 제1공정, 제1공정에서 준비한 식물배양배지를 배양용기에 각각 나누어 담고 고압멸균기에서 멸균처리하는 제2공정, 사포닌을 함유하는 식물의 세근조직을 살균소독한 후 멸균수로 3 ~ 5 회 세척하여 5 ~ 10 ㎜씩 절단하는 제3공정, 제2공정에서 준비한 멸균처리된 배양용기에 제3공정의 세근 절편을 각각 접종한 후, 회전식 진탕배양기에 넣고 배양하는 제4공정을 거쳐 대량증식을 할 수도 있다.

이때, 본 발명의 부정근 대량증식에 사용한 본 발명의 식물배양배지는, 감귤의 과육을 준비하여 착즙한 후 증류수를 넣고 희석하여 농도가 30 %인 감귤과즙을 제조하는 제1공정, 대나무를 준비하여 세척 후 잘게 자르고, 밀폐용기에 넣은 다음 100 ℃ 건열기에 넣고 3 시간 동안 가열하여, 흘러나온 액을 채취하여 대나무추출물을 제조하는 제2공정, 제1공정에서 제조한 30 % 농도의 감귤과즙에 제2공정에서 제조한 대나무추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ로 넣고 혼합하여 식물배양배지를 제조하는 것으로 구성된다.

또한, 본 발명에서 사용하는 사포닌을 함유하는 식물은 인삼, 산삼, 장뢰삼, 가시오가피, 두릅 중에서 선택된 1 종으로서, 잎, 줄기, 뿌리 조직을 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 감귤은 온주밀감, 금귤, 한라봉 등을 사용할 수 있으며, 대나무는 참대나무, 왕대나무, 맹죽, 조릿대 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 발명자가 선출원하여 등록받은 특허 제0537176호 “천연과일을 배지로서 이용하여 사포닌 함유식물의 부정근을 대량증식하는 방법”에 대하여 개량발명한 것이다.

즉, 본 발명자가 선출원하여 등록받은 발명은, 인삼, 산삼, 장뢰삼, 가시오가피, 두릅 등의 뿌리, 줄기, 잎의 조직을 배양하여 캘루스를 유도하는 단계와 상기의 방법으로 유도된 캘루스에서 부정근을 유도 증식시키는 단계와, 상기의 방법으로 유도된 부정근을 감귤, 사과, 토마토, 당근, 백년초, 포도의 착즙 배지에서 배양하여 양호하게 적응 생육한 부정근을 선발하여 생물반응기 내에서 대량으로 배양하는 것에 관한 것이다.

상기 배양시 사용한 배지 중 감귤 착즙액을 이용한 배지에서 배양할 때 가장배양이 잘 되었고, 그 감귤 착즙액 중 30 % 농도로 희석된 착즙액을 사용했을때 가장 생체중 증가율이 컸음을 알 수 있었다.

또한, 상기의 감귤 착즙액 제조시 감귤 과피에 함유되어 있는 플라보노이드와 카로티노이드 성분은 식물세포의 분열과 생장을 촉진하는 생장조절기능이 있어 이를 적극적으로 활용하면 인위적으로 생장조절호르몬 등을 사용할 필요가 없을 거 라 생각해 감귤과피 착즙액을 사용하였다.

그러나, 대량증식시 생물반응기 내에서 감귤과피 유래의 펄프성 섬유질이 산삼, 인삼, 오가피 등의 배양체의 부정근과 결합하여 덩어리를 형성하고, 배양시 침전물이 형성되는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 상기의 문제를 해결하면서 생장조절기능을 보완할 수 있는 방법을 찾아 많은 시행착오를 겪으며 본 발명을 완성하였다.

감귤(온주밀감)은 알카리성 식품으로 신진대사를 촉진하며 과당, 포도당, 자 당, 맥아당 등과 같은 유리당 형태로 탄수화물이 약 8.5 ∼ 8.79 % 존재하며, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 페닐알라닌 등의 17 가지 아미노산과 말린산, 옥살린산, 푸마린산 등의 유도산이 함유되어 있고, 다른 과일과는 달리 과피 부분에는 생체내에서 항산화를 유도하며 항암물질로 알려진 나린진, 헤스페리딘과같은 플라보노이드 배당체와 리모노이드 성분이 함유되어 있다.

그리고 K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Cu 등의 무기물과 카로티노이드, 비타민 C를 함유하고 있어 식물 세포 및 조직배양에 필요한 탄소원과 질소원은 물론 거의 모든 성분이 존재하며, 특히 플라보노이드와 카로티노이드 성분은 식물세포의 분열과 생장을 촉진하는 생장조절기능이 있는 것으로 알려져 있어 배양 중에 생장조절제를 첨가하지 않는 무공해 청정 무화학약품, 무호르몬 배지로 이용이 가능하다.

본 발명에서는 상기와 같은 감귤을 이용하여 식물배양배지를 제조하였고, 이때 상기에 기재된 본 발명의 발명자의 선발명에서 여러 문제가 되었던 과피부분은 제외하고 과육만 착즙하여 사용하기로 하였으며, 선발명에서 가장 효과가 양호했던 농도 조건이 30 %로 희석하여 사용한 경우였으므로, 본 발명에서는 감귤과육을 착즙하여 농도가 30 %인 희석액을 제조하여 사용하기로 하였다.

또한, 본 발명의 발명자들은 이러한 감귤과 잘 어우러지면서 본 발명의 부정근 대량증식에 유용하게 쓰일수 있는 재료 및 물질을 찾기 위해 많은 시도를 하였다.

그 결과, 감귤이 대나무와 잘 어우러지면서 감귤만 사용한 경우에 비해 대나무를 함께 사용할 경우 본 발명의 부정근의 생체 증가율을 월등히 높이는 역할을 한다는 사실을 확인하였다.

대나무는 고혈압, 발한, 중풍 등의 치료에 민간요법으로 사용되어 왔으며, 최근에는 대나무 성분을 이용한 건강음료 개발과 항균성에 관한 연구가 많이 진척되어 천연식품보존제로도 개발되고 있어 식품의 안정성 및 저장성 측면에서 중요성이 대두 되고 있는 식물이다.

대나무는 생장 속도가 매우 빨라 하루에 1 m 이상 자라기도 하며, 죽순대는 하루에 119 cm, 왕대는 하루 121 cm나 자라기도 하는데, 이러한 급속한 생장에는 대나무에 함유되어 있는 지베렐린, 카이네틴, 티로신 등의 식물 호르몬이 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

대나무에 함유된 주요 성분으로는 단백질 2.61 %, 지방 0.35 %, 조섬유 1.15 % 등과, 무기염류로 나트륨(Na) 46.2 ㎎/ℓ, 마그네슘(Mg) 117.7 ㎎/ℓ, 칼륨(K) 909.3 ㎎/ℓ, 칼슘(Ca) 401.5 ㎎/ℓ, 철(Fe) 0.5 ㎎/ℓ 및 과당, 포도당, 자당 등이 함유되어 있다.

즉, 대나무에 함유되어 있는 지베렐린, 카이네틴, 티로신 등의 식물호르몬이 인위적인 식물호르몬이나 생장조절제 등을 사용하지 않고 부정근을 빠르게 배양시키고 생체증가율을 높이는 것이라고 추측된다.

본 발명의 식물배양배지 제조시에 사용되는 대나무는 추출하여 대나무추출물을 사용하는데, 대나무를 직접 가열하여 스며나오는 액을 채취하는 직접가열추출법, 잘게 자른 대나무를 밀폐용기에 넣고 100 ℃의 건열기에 넣고 3 시간 동안 가열한 후 흘러나오는 액을 채취하는 간접가열추출법, 잘게 자른 대나무를 2 ℓ 삼각플라스크에 넣고 대나무무게의 10 중량%의 증류수를 첨가하고 밀봉한 후 고압멸균기에서 1 시간 동안 처리하여 추출하는 열수추출법, 잘게 자른 대나무를 플라스크에 넣고 에탄올을 25 % 첨가하여 밀봉한 후 80 ℃의 항온수조에서 3시간 동안 처리하여 추출하는 알콜추출법의 방법으로 대나무추출물을 제조하여 다양한 실험을 하였다.

그 결과, 대나무 추출액의 수율과 pH는 추출방법에 따른 큰 차이가 없었다(표 1).

또한, 각각의 대나무추출물에 함유되어 있는 유리당과 유리산을 분석한 결과, 유리당은 글루코스(glucose), 프락토스(fructose), 수크로스(Sucrose)가 검출되었으며, 글루코스는 직접가열추출물과 간접가열추출물에서 높았고, 수크로스는 열수추출과 알콜추출에서 높게 측정되었다(표 2).

대나무추출물에 함유되어 있는 유리산은 시트릭산(citric acid), 말린산(malic acid), 아세틱산(acetic acid) 등이 검출되었으며, 추출법에 따라 유기산의 함량이 다르게 나타났다.

간접가열추출물에서 유기산의 함량이 가장 높았으며, 열수추출물과 알콜추출물은 시트릭산이 검출되지 않았다(표 3).

따라서, 대나무추출물의 유기산 함량은 간접추출물에서 전반적으로 높게 나타났음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 식물배양배지 제조시 사용되는 30 % 농도의 감귤과즙에 대나무추출물을 혼합하여 제조할 때, 어떠한 조건으로 혼합할 때 가장 효과가 좋은지를 알기 위해 다양한 실험을 하였다.

즉, 30 % 감귤과즙에 각각의 방법으로 제조한 대나무추출물을 각각 0, 1, 5, 10, 20, 30, 50, 100 ㎎/ℓ씩 처리한 후, 여기에 절단한 부정근을 접종하여 그 증식정도를 관찰한 결과, 직접가열추출물과 간접가열추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ 처리한 경우에서 발생된 세근의 수와 상태가 양호했으며, 특히 직접추출물은 처리 농도가 커질수록 발생된 세근이 짧아져서 전반적으로 간접가열추출물이 가장 양호한 결과를 얻었다.

알콜추출물을 처리한 경우에는 부정근의 한쪽 절단부위에서 부분적으로 캘루스가 형성되어 본 발명의 목적에는 적합하지 못하였다(표 4).

따라서, 본 발명의 식물배양배지는 30 % 농도의 감귤과즙에 간접가열추출방법에 의해 제조된 대나무추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ의 농도로 혼합하여 제조하는 것 이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 발명자가 선발명하여 선등록된 특허인 감귤과피가 포함된 감귤과즙 배양배지를 이용하여 사포닌 함유 식물의 부정근을 배양하는 경우와, 감귤 과육만 이용하여 착즙한 감귤과즙 배양배지를 이용한 경우, 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 배양배지를 이용한 경우에 대하여 부정근의 세근발생기간 및 생육정도를 실험한 결과, 본 발명의 식물배양배지를 이용한 경우가 다른 대조군에 비해 세포발생 및 세근발생기간이 훨씬 단축되어 전체적인 배양기간이 단축되었고, 그 생체중 증가율 또한 월등히 높아졌음을 확인할 수 있었다(표 5, 6).

이하, 본 발명의 식물배양배지의 제조공정 및 이를 이용한 사포닌 함유 부정근의 대량증식방법에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

<대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지의 제조공정>

1. 제1공정 : 감귤과즙 제조

시중에서 감귤을 준비하고 세척한 후, 그 과피는 제거하여 과육부분만 준비한다.

준비한 감귤과육을 착즙하고, 이 착즙액에 증류수를 넣고 희석하여 농도가 30 %인 감귤과즙을 제조한다.

2. 제2공정 : 대나무추출물 제조

대나무를 준비하여 세척 후 잘게 자른다.

잘게 자른 대나무를 밀폐용기에 넣은 다음 100 ℃ 건열기에 넣고 3 시간 동 안 가열하여, 흘러나온 액을 채취하여 대나무추출물을 제조한다.

제3공정 : 혼합

상기의 제1공정에서 준비한 30 % 농도의 감귤과즙에 제2공정에서 준비한 대나무추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ의 농도가 되도록 넣고 혼합하여 본 발명의 식물배양배지를 제조한다.

<식물배양배지를 이용한 사포닌이 함유된 부정근의 대량증식 1>

1. 제1공정 : 식물배양배지 준비

상기와 같이 대나무추출물과 감귤과즙을 혼합하여 제조한 본 발명의 식물배양배지를 준비한다.

2. 제2공정 : 세척 및 절단

인삼, 산삼, 가시오가피, 두릅 등의 사포닌이 함유된 식물체를 준비하여, 살균 소독한 후 멸균수로 3 ~ 5 회 세척하여 3 ~ 5 ㎜씩 절단하여 준비한다.

이때, 사포닌 함유 식물체는 잎, 줄기, 뿌리 등 전체부위를 모두 사용할 수 있다.

제3공정 : 캘루스 증식

상기의 제2공정에서 절단된 절편을 MS배지에 치상하여 7 ~ 10 일 동안 암처리한 다음, 암처리된 절편을 14 ~ 16 시간동안 24 ~ 28 ℃로, 3,000 ~ 5,000 룩스의 광조건 하에서 캘루스를 유도한 후, 2 ~ 4 주 간격으로 계대배양하여 캘루스를 증식한다.

제4공정 : 부정근 유도

상기의 제3공정에서 유도된 캘루스를 MS배지에서 24 ~ 28 ℃ 에서 30 일 동안 부정근을 유도한다.

제5공정 : 배양

상기의 제1공정에서 준비한 식물배양배지에 상기 제4공정에서 유도한 부정근을 넣고 24 ~ 28 ℃ 에서 4주 간격으로 계대배양한다.

제6공정 : 대량증식

상기의 제5공정에서 양호하게 배양된 부정근을 생물반응기에 넣고 24 ℃ 에서 4 주 동안 대량증식한다.

<식물배양배지를 이용한 사포닌이 함유된 부정근의 대량증식 2>

1. 제1공정 : 식물배양배지 준비

2. 제2공정 : 멸균처리

제1공정에서 준비한 식물배양배지를 배양용기에 각각 나누어 담고, 고압멸균기에서 멸균처리한다.

3. 제3공정 : 세척 및 절단

인삼, 산삼, 가시오가피, 두릅 등의 사포닌이 함유된 식물의 세근조직을 준비하여, 살균 소독한 후 멸균수로 3 ~ 5 회 세척하여 5 ~ 10 ㎜씩 절단하여 준비한 다.

4. 제4공정 : 배양

제2공정에서 멸균처리한 배양용기에 제3공정에서 준비한 부정근 절편들을 각각 접종한 후 회전식 진탕배양기에 넣고 24 ~ 28 ℃ 에서 4 주간 배양한다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실험예 1> 추출방법에 따른 대나무추출물의 수율 및 pH 측정실험

제주도 중간산 지대에서 수령이 3 년생인 참대나무를 채취하여 준비하였다.

대나무추출물은 추출방법에 따라 함유성분이 다른 것으로 알려져 있어 본 발명에 가장 효율적인 추출방법을 찾기 위해 직접가열추출물, 간접가열추출물, 열수추출물, 알콜추출물을 각각 제조하여 준비하였다.

즉, 대나무 줄기를 30 ㎝로 자르고 절단부위를 비이커로 받쳐 분젠버너로 대나무를 가열하여 스며나오는 액을 채취하여 직접가열추출물을 제조하였다.

또, 같은 방법으로 자른 대나무를 밀폐용기에 넣고 100 ℃ 건열기에 넣어 3시간 동안 가열처리 한 후 흘러나온 액을 채취하여 간접가열추출물을 제조하였다.

또, 같은 방법으로 잘게 자른 대나무를 2ℓ삼각플라스크에 넣고 대나무 중량대비 10 중량%의 증류수를 첨가하고 밀봉한 후 고압멸균기(121℃, 1.5기압)에서 1시간 동안 추출하여 열수추출물을 제조하였다.

또한, 같은 방법으로 잘게 자른 대나무를 플라스크에 넣고 에탄올을 대나무 중량대비 25 중량% 첨가하여 밀봉한후 80 ℃ 항온수조에서 3시간 동안 추출하여 알콜추출물을 제조하였다.

상기의 각각의 대나무추출물에 대하여 수율 및 pH를 측정한 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

<표 1> 추출방법에 따른 대나무추출물의 수율 및 pH 측정결과

대나무추출물	수율(%)	pH
직접가열추출물	4.7	5.1
간접가열추출물	4.2	5.1
열수추출물	8.7	5.3
알콜추출물	15.0	5.4

상기의 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 각각의 대나무추출물의 수율과 pH는 직접가열추출물은 4.7 %, 간접가열추출물은 3.2 %, 열수출출물은 8.7 %, 알콜추출물은 15.0 %였으며, pH는 5.1에서 5.4로 추출방법에 따른 큰 차이는 없었다(표 1).

<실험예 2> 추출방법에 따른 대나무추출물의 유리당 및 유기산 분석실험

본 발명의 실험예 1의 방법으로 제조된 각각의 대나무추출물을 준비하였다.

추출방법에 따라 대나무추출물에 함유되어있는 유리당 및 유기산을 분석하기 위하여, 각각의 추출물을 0.45 ㎛ 여과막으로 여과하여 HPLC(Waters 2690 XE, Waters Corporation USA)으로 분석하였다.

글루코스(glucose), 프락토스(fructose)와 수크로스(sucrose)가 검출되었는데, 이들의 함량은 글루코스는 직접가열추출과 간접가열추출에서 높았고, 수크로스는 열수추출과 알콜추출에서 높게 측정되었다(표 2).

<표 2> 추출방법에 따른 대나무추출물의 유리당 함량 측정결과

대나무추출물	글루코스(㎎/ℓ)	프락토스(㎎/ℓ)	수크로스(㎎/ℓ)
직접가열추출물	15.5	5.0	7.3
간접가열추출물	17.7	5.8	9.2
열수추출물	9.7	2.6	12.1
알콜추출물	8.7	2.3	10.6

또한, 대나무추출물의 유기산은 시트르산(citric acid, 구연산), 말린산 (malic acid, 사과산), 아세트산(acetic acid, 식초산) 등이 검출되었는데, 아래의 표 3에서 보는 바와 같이, 간접가열추출물은 유기산 함량이 가장 높았으며, 열수추출물과 알콜추출물은 시트르산(citric acid)이 검출되지 않았다(표 3).

<표 3> 추출방법에 따른 대나무추출물의 유기산 측정결과

대나무추출물	시트르산(㎎/ℓ)	말린산(㎎/ℓ)	아세트산(㎎/ℓ)
직접가열추출물	9.0	38.5	30.0
간접가열추출물	9.2	101.2	52.0
열수추출물	0	38.7	28.6
알콜추출물	0	15.0	36.9

따라서, 추출물에 따라 유리당 및 유기산의 함량이 크게 다르다는 사실을 확인할 수 있었으며, 전반적으로 간접가열추출법으로 추출한 대나무추출물이 유리당 및 유기산의 함량이 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> 대나무추출물의 종류 및 그 첨가량에 따른 사포닌 함유 부정근의 증식 실험

본 발명의 사포닌 함유식물의 부정근 대량증식에 적합한 조건을 찾기 위해 대나무추출물을 다양한 농도로 첨가하여 다음과 같이 부정근을 대량증식하여 그 결과를 살펴보았다.

시중에서 6년산 인삼, 80년산 산삼 및 가시오가피를 구입하여 준비하였다.

제주도에서 재배된 온주밀감을 구입하여 준비하고, 깨끗하게 세척한 다음, 과피를 벗기고 과육부분만 착즙하여 감귤착즙액을 준비하였다.

준비한 감귤 착즙액 3 ℓ에 증류수 7 ℓ를 넣고 혼합하여 농도가 30 %인 감귤과즙을 제조하여 준비하였다.

또한, 본 발명의 실험예 1과 같이 각기 다른 방법으로 제조된 대나무추출물을 준비하였다.

준비한 30 % 농도의 감귤과즙에 준비한 대나무추출물을 각각 0, 1, 5, 10, 20, 30, 50, 100 ㎎/ℓ씩 첨가하여 혼합한 다음, 멸균처리하여 식물배양배지를 각각 제조하였다.

준비한 식물배양배지를 무균대에서 페트리디시에 20 ㎖씩 붓고 식힌 후 5 ㎜로 절단한 부정근을 페트리디시당 10 개씩 10 회 반복 접종(각 처리구당 100개씩 접종)하여 부정근의 증식정도를 관찰하였다.

이때, 배양조건은 24 ℃, 14 시간 일장처리(3,000룩스)에서 실험하였다.

접종 4 주후의 부정근에서 발생한 세근의 수를 측정(육안으로 관찰가능한 것만)하여 아래의 표 4와 같은 결과를 나타내었다.

<표 4> 대나무추출물의 종류 및 첨가량에 따른 식물배양배지에서의 사포닌 함유 식물의 부정근 발생수 측정결과

추출물의 종류	처리농도(mg/ℓ)	접 종 식 물			비고
추출물의 종류	처리농도(mg/ℓ)	인삼	산삼	가시오가피	비고
대조구	0	5.9(+)	4.2(+)	2.3(+)	양호 짧은세근
직접가열 추출물	1	5.9(+)	4.2(+)	2.3(+)
	5	6.1(+)	4.3(+)	4.7(++)
	10	6.7(+)	5.8(++)	4.7(++)
	20	7.0(++)	6.1(++)	5.2(++)
	30	8.1(++)	6.9(++)	6.0(+++)
	50	9.2(++)	8.7(++)	6.2(+++)
	100	9.0(++)	9.0(+++)	5.7(++)
간접가열 추출물	1	6.1(+)	4.3(+)	2.2(+)	가장양호 양호
	5	6.3(+)	4.5(+)	4.0(+)
	10	6.9(+)	5.9(+)	4.9(++)
	20	7.9(++)	6.9(++)	5.2(++)
	30	8.8(++)	7.5(++)	6.4(++)
	50	9.9(+++)	9.4(+++)	6.8(+++)
	100	9.5(++)	9.3(+++)	6.7(++)
열수추출물	1	5.8(+)	4.1(+)	2.3(+)
	5	5.8(+)	4.9(+)	2.3(+)
	10	5.9(+)	5.5(+)	2.5(+)
	20	6.1(+)	6.0(+)	2.9(+)
	30	6.5(+)	5.7(+)	2.8(+)
	50	6.5(+)	5.5(+)	2.4(+)
	100	6.0(+)	5.3(+)	2.4(+)
알콜추출물	1	5.8(+)	4.2(+)	2.3(+)	대체적으로 부정근 절단부위에서 캘루스가 유도되는 현상이 발생함
	5	5.8(+)	4.3(+)	2.3(+)
	10	6.1(+)	4.8(+)	2.6(+)
	20	6.0(+)	4.8(+)	2.5(+)
	30	6.1(+)	5.1(+)	2.5(+)
	50	6.1(+)	5.0(+)	2.4(+)
	100	6.0(+)	5.2(+)	2.0(+)

( )안의 +표시는 대조구를 기준으로 부정근 발육의 증가 정도를 표시한 것.

상기의 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 대나무의 간접가열추출물을 이용하여 감귤과즙에 첨가하여 부정근을 증식하였을때 다른 추출방법으로 제조한 대나무추출물을 이용한 경우 보다 그 효과가 뛰어났음을 확인하였다.

이때, 30 % 농도의 감귤과즙에 대나무추출물을 10 ~ 100 mg/ℓ첨가하였을 때 가장 적합하다는 사실을 확인하였다.

이는 추출방법에 따른 유기산 함량의 차이가 부정근 발생에 큰 영향을 미치 는 것으로 여겨진다.

한편, 직접가열추출물 100 ㎎/ℓ으로 처리한 경우는 부정근의 굵기가 가늘게 형성되는 것이 특징이였고, 알콜추출물을 처리한 경우에는 부정근의 한쪽 절단부위에서 부분적으로 세포분열이 발생하여 캘루스가 형성되는 현상이 발생하여 본 발명의 목적에는 적합하지 않았다.

따라서, 상기의 결과로 볼 때 작업의 간편성과 결과의 효율성으로 볼때 간접가열추출법을 통해 대나무추출물을 제조하는 것이 본 발명에 가장 바람직하다는 것을 확인하였다.

<실시예 1> 본 발명의 감귤과즙과 대나무추출액을 이용한 식물배양배지의 제조

제주도에서 재배된 온주밀감을 구입하여 준비하였다.

깨끗하게 세척한 다음, 과피를 벗기고 과육부분만 착즙하여 감귤착즙액을 준비하였다.

준비한 감귤 착즙액 3 ℓ에 증류수 7 ℓ를 넣고 혼합하여 농도가 30 %인 감귤과즙을 제조하였다.

제주도 * 에서 5년생 참대나무를 채취하고 세척 후 30 ㎝로 잘랐다.

자른 대나무를 밀폐용기에 넣은 다음 100 ℃ 건열기에 넣고 3 시간 동안 가열하여, 흘러나온 액을 채취하여 대나무추출물을 제조하였다.

준비한 30 % 농도의 감귤과즙 10 ℓ에 상기의 대나무추출물 500 ㎎을 넣고 혼합하여 본 발명의 식물배양배지를 제조하였다.

<실시예 2> 본 발명의 식물배양배지를 이용한 사포닌이 함유된 식물체로부터 부정근의 제조1

본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 식물배양배지를 준비하였다.

시중에서 6 년근 인삼을 구입하여 준비하였다.

준비한 산삼의 잎, 줄기, 뿌리조직에서 캘루스를 유도하기 위하여, 70 % 에탄올과 1 ~ 2 % 차아염소산 나트륨용액을 이용하여 살균 소독한 후 멸균수로 3회 이상 세척한 후 3 ㎜로 절단하였다.

상기의 절단한 절편을 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 1.0 ㎎/ℓ와 수크로스(sucrose) 30 g/ℓ, 한천 0.9 %를 첨가한 MS배지에 치상하여 5,000 룩스의 광조건하에서 캘루스를 유도하였고, 2 주 간격으로 계대배양하면서 캘루스를 증식 시켰다.

유도된 캘루스를 NAA(Naphthalene acetic acid) 1.0 ㎎/ℓ를 첨가한 MS배지에 접종하여 24 ℃에서 30 일 동안 부정근을 유도하였다.

유도된 부정근을 상기에서 준비한 식물배양배지에 넣고 24 ℃에서 4 주 간격으로 계대배양하였다.

상기에서 양호하게 생육한 배양 절편체를 포함한 부정근을 1 ㎝ 길이로 절단한 후, 50 g을 생물반응기(20ℓ 용)에 넣고 4주 동안 대량증식하였다(도 4).

이때, 배양조건을 온도 24 ℃, 공기 주입량은 0.05 ~ 0.3 vvm로 하였다.

<실시예 3> 본 발명의 식물배양배지를 이용한 사포닌이 함유된 식물체로부터 부정근의 제조2

준비한 식물배양배지를 10 개의 용기에 각각 200 ㎖ 씩 담은 다음, 고압멸균기에서 멸균처리 하였다.

시중 한약방에서 80 년근 산삼을 구입하여 준비하였다.

준비한 인삼의 센근을 살균 소독한 후 멸균수로 5 회 세척하여 10 ㎜씩 절단하였다.

멸균처리 하여 준비한 배양용기에 상기의 세근 절편을 각각 10 g 씩 접종한 다음, 24 ℃에서 150 rpm으로 회전식 진탕배양기에 넣고 4 주 동안 배양하였다(도 5).

<실험예 4> 본 발명의 식물배양배지를 이용하여 대량증식한 부정근의 생체증가율 측정실험

대조군으로 감귤과피가 포함된 감귤과즙을 준비하여 농도가 30 %가 되도록 희석하여 준비하였다.

또 다른 대조군으로 감귤과육만 이용하여 제조한 감귤과즙을 준비하여 농도가 30 %가 되도록 희석하여 준비하였다.

본 발명의 실시예 1의 방법으로 제조된 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지를 준비하였다.

시중에서 6년생 인삼, 80년생 산삼 및 가시오가피를 구입하고, 세척한 다음 각각의 부정근을 잘게 잘라 준비하였다.

상기와 같이 각각의 배지를 이용하여 준비한 각각의 절편을 본 발명의 실시예 2의 방법으로 배양하였다.

배양 4주후의 부정근의 생체증가율을 측정하여 아래의 표 5에 나타내었다.

<표 5> 본 발명의 식물배양배지에서의 부정근의 생체 증가율 측정결과

배양배지	접종식물
배양배지	인삼	산삼	가시오가피
30 % 감귤과즙(과육+과피)	245 g	260 g	255 g
30 % 감귤과즙(과육)	111 g	98 g	103 g
30 % 감귤과즙+대나무추출물 50 ㎎/ℓ첨가	283 g	288 g	260 g

상기의 표 5에서 보는 바와 같이 종래기술인 과피가 포함된 감귤과즙을 이용하여 부정근을 배양한 경우에 비해 감귤과육만 사용한 감귤과즙을 이용하여 부정근을 배양한 경우에는 생체증가율이 현저히 감소했지만, 감귤과즙과 대나무추출물을 함께 사용하여 배양한 경우에서는 모든 식물체에 대해 뛰어나게 증가하였음을 확인할 수 있었다.

특히, 종래기술인 과피가 포함된 감귤과즙으로 배양한 경우에 비해 침전물이 발생하지 않아 배양이 보다 용이했다.

또한, 본 발명의 대나무추출물을 첨가한 식물배양배지에서 배양했을 때 인삼과 산삼의 부정근발육은 감귤과즙배지에만 배양한 경우에 비해 30 ~ 40 g의 생체 증가율을 보였다.

<실험예 5> 식물배양배지의 종류에 따른 세포분열 및 세근발육 개시일 측정실험

시중에서 6년생 인삼, 80년생 산삼, 가시오가피, 두릅을 구입하여 준비한 다음, 세척하여 그 부정근을 잘게 절단하여 준비하였다.

준비한 각각의 배지를 이용하여 본 발명의 실시예 2의 방법으로 각각의 부정근을 배양하였다.

각각의 식물에 대해 세포분열 개시일 및 세근발육 개시일을 측정하여 그 결과를 아래의 표 6에 나타내었다.

<표 6> 식물배양배지의 종류에 따른 세포분열 및 세근발육 측정실험 결과

배양배지		접 종 식 물
배양배지		인삼	산삼	가시오가피
30 % 감귤과즙 (과육+과피)	세포분열개시일	배양3일부터	배양4일부터	배양7일부터
30 % 감귤과즙 (과육+과피)	세근발육개시일	배양7일부터	배양7일부터	배양13일부터
30 % 감귤과즙 (과육)	세포분열개시일	배양5일부터	배양5일부터	말단부 비대현상
30 % 감귤과즙 (과육)	세근발육개시일	배양11일부터	배양13일부터	관찰 안됨
30 % 감귤과즙+ 대나무추출물 50 ㎎/ℓ	세포분열개시일	배양3일부터	배양3일부터	배양5일부터
30 % 감귤과즙+ 대나무추출물 50 ㎎/ℓ	세근발육개시일	배양5일부터	배양5일부터	배양10일부터

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 배지의 종류에 따른 세포분열 및 세근발육 정도를 광학실체현미경(50 배율)을 이용하여 관찰한 결과 대조군의 감귤과육이 포함된 과즙배지에서 가시오가피의 경우 말단부위의 비대현상이 일어나고 경화되어 배양 4 주 후에는 서서히 갈변현상이 나타났다.

또한, 감귤과피가 포함된 과즙을 이용한 경우에는 배양개시 3 ~ 7 일부터 세포분열이 절단부위에서 왕성하게 일어나고 있는 것이 관찰되었고, 감귤과피가 생략된 과즙을 이용한 경우에는 세포분열일이 1 ~ 2 일 더 늦게 나타났다.

그러나, 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 경우에는 배양개시 3 ~ 5 일부터 세포분열이 나타났음을 확인하였다.

또한, 세근발육에 있어서는 종래기술인 감귤과피가 포함된 과즙을 이용한 경우에는 배양개시 7 ~ 13 일부터 나타났으나, 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 경우에는 5 ~ 10 일부터 세근발육이 시작되었음을 알 수 있었다.

따라서, 종래기술인 감귤과즙배지를 이용하여 사포닌 함유 식물의 부정근을 배양하는 경우에 비해 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지를 사용하여 사포닌 함유 식물의 부정근을 배양하는 경우에 세포분열 및 세근발육의 개시일을 보다 앞당기는 것을 확인하여, 본 발명의 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지가 식물호르몬 및 생장조절제의 역할을 대신 그 효과가 더욱 좋다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 의해 대나무추출물과 감귤과즙을 이용한 식물배양배지가 제공된다.

또한, 본 발명의 식물배양배지를 이용하여 사포닌 함유 식물의 부정근 대량증식시 배양과정이 용이하고, 배양기간이 단축되며, 인공생장조절제 등을 사용하지 않고 천연재료만을 사용하여 안전하며, 부정근의 생체 증가율이 뛰어나 그 효과가 월등히 뛰어난 식물배양배지가 제공된다.

또한, 본 발명의 식물배양배지를 이용하여 대량배양된 사포닌 함유 식물체의 부정근이 유효성분으로 포함된 음료조성물 및 식품첨가제가 제공된다.

Claims

식물의 부정근 대량증식 방법에 있어서,

대나무추출물과 감귤과즙을 혼합하여 식물배양배지를 제조하는 제1공정,

사포닌 함유 식물체를 살균 소독한 후 멸균수로 3 회 이상 세척하여 3 ~ 5 ㎜씩 절단하는 제2공정,

제2공정에서 절단된 절편을 MS배지에 치상하여 7 ~ 10 일 동안 암처리한 다음, 암처리된 절편을 14 ~ 16 시간동안 24 ~ 28 ℃로, 3,000 ~ 5,000 룩스의 광조건 하에서 캘루스를 유도한 후, 2 ~ 4 주 간격으로 계대배양하여 캘루스를 증식하는 제3공정,

제3공정에서 유도된 캘루스를 MS배지에서 부정근을 유도하는 제4공정,

제4공정에서 유도된 부정근을 제1공정에서 준비한 식물배양배지에 접종하여 배양하는 제5공정,

제5공정에서 양호하게 배양된 부정근을 생물반응기에 넣고 대량증식하는 제6공정을 거치는 것으로 구성된,

식물배양배지를 이용한 사포닌 함유 식물의 부정근 대량증식방법.
식물의 부정근 대량증식방법에 있어서,

감귤의 과육을 준비하여 농도가 30 %인 감귤과즙을 제조하고, 이 감귤과즙에 대나무추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ로 혼합하여 식물배양배지를 제조하는 제1공정,

제1공정에서 준비한 식물배양배지를 배양용기에 각각 나누어 담고 고압멸균기에서 멸균처리하는 제2공정,

사포닌 함유 식물의 세근 조직을 살균소독한 후 멸균수로 3 ~ 5 회 세척하여 5 ~ 10 ㎜씩 절단하는 제3공정,

제2공정에서 준비한 멸균처리된 배양용기에 제3공정의 세근 절편을 각각 접종한 후, 회전식 진탕배양기에 넣고 배양하는 제4공정을 거치는 것으로 구성된,

식물배양배지를 이용한 사포닌 함유 식물의 부정근 대량증식방법.
제1항에 있어서,

제1공정의 식물배양배지는, 감귤의 과육을 준비하여 착즙한 후 증류수를 넣고 희석하여 농도가 30 %인 감귤과즙을 제조하는 제1공정, 대나무를 준비하여 세척 후 잘게 자르고, 밀폐용기에 넣은 다음 100 ℃ 건열기에 넣고 3 시간 동안 가열하여, 흘러나온 액을 채취하여 대나무추출물을 제조하는 제2공정, 제1공정에서 제조한 30 % 농도의 감귤과즙에 제2공정에서 제조한 대나무추출물을 10 ~ 100 ㎎/ℓ로 넣고 혼합하는 제3공정을 거쳐 제조하는 것이 특징인,

식물배양배지를 이용한 사포닌 함유 식물의 부정근 대량증식방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 대량증식된,

사포닌 함유 식물의 부정근.
제4항에 있어서,

음료조성물 또는 식품첨가물에 유효성분으로 포함되는 것이 특징인,

사포닌 함유 식물의 부정근.