CN112931058B

CN112931058B - 一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法

Info

Publication number: CN112931058B
Application number: CN202110123216.7A
Authority: CN
Inventors: 闫静; 王伟科; 周祖法; 陆娜
Original assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112931058A

Abstract

本发明公开了一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，该方法包括：采集莫干山竹林中的野生红托竹荪蛋进行清洗和消毒；将红托竹荪蛋纵向剖开，取出中间第二层的菌裙组织，接种至分离培养基上，进行分离培养；挑取菌落尖端菌丝接种到新的分离培养基上，继续培养，获得莫干山野生红托竹荪纯菌种。本发明方法通过分离野生红托竹荪的白色菌群，并采用竹林土、柠檬酸铵和马铃薯用量减半的PDA综合培养基作为分离培养基组分进行配合使用，不仅能够分离纯化获得到莫干山野生红托竹荪菌种，而且能够有效缩短菌种的萌发时间，提高萌发率，促进菌种菌丝的生长，以及抑制菌丝的老化。

Description

一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法

技术领域

本发明涉及食用菌育种和生产技术领域，尤其涉及一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法。

背景技术

红托竹荪是常见并可供食用的四种竹荪中最名贵的一种。野生红托竹荪主要生长于贵州、云南、四川I和浙江等竹林的腐殖土。自从人工分离驯化以来，红托竹荪经过四五十年的摸索，目前已经可以大规模人工栽培。红托竹荪最早是在贵州省织金县野生驯化开始人工栽培的，因此目前红托竹荪的种植主要集中在贵州省内，是贵州省的名优特产。红托竹荪在贵州漫长的栽培过程中，目前已出现了严重的菌种退化，存在品种单一，优良品种紧缺的问题。

莫干山风景名胜区位于浙江省湖州市德清县，属天目山余脉，主峰塔山海拔758米。以竹、泉、云和清、绿、凉、静的环境著称，素有“清凉世界”之美誉。莫干山独特的自然条件孕育了丰富的野生菌，在该处的竹林经常能找到野生红托竹荪。由于红托竹荪，野生种分离不易萌发，菌丝萌发后在培养基中随着培养时间的延长，容易发生色变，主要由白色变为淡红色，菌丝易失水等独特的生物学特性，从而很难获得莫干山野生红托竹荪纯菌种。同时由于红托竹荪特殊的生物学特性，常规的琼脂培养基配方都不适红托竹荪菌种分离、纯化和扩繁，给红托竹荪野生资源收集、纯化造成困难，特别是莫干山野生红托竹荪种质资源难以利用。

公布号为CN110637681A的名称为“一种红托竹荪母种的培养方法”的发明专利申请提到利用竹素土、马尾松针、杂木屑等物质煮汁配制琼脂培养基，一方面竹素土配制程序复杂，需将竹枝、竹根、竹屑、竹叶以及废旧竹片、断竹材料等进行粉碎，按照竹元素粉碎物、牛(羊)粪粉、沼渣、复合肥为100:15:10:1的比例混匀并发酵腐熟，所需物质种类多，配制时间长，另一方面，这一琼脂培养基用于红托竹荪菌种扩繁可以，用于分离野生红托竹荪萌发困难，尤其是莫干山野生红托竹荪菌种萌发困难，接种块易褐化。

公告号为CN104920065B的名称为“一种梵净山野生红托竹荪母种制作方法”的发明专利申请提到一种野生红托竹荪菌种分离方法，但莫干山野生红托竹荪利用该方法分离萌发速度和菌丝生长速度都很慢，容易变红老化，难以获得高利用价值的纯菌种。文献“红托竹荪母种分离培养初探”提到的方法中用于分离的红托竹荪为人工栽培所得，用该方法分离莫干山野生红托竹荪也不能获得成功。同时利用木屑等固体菌种进行红托竹荪菌种保藏、扩繁，污染不易发现，造成菌种纯化困难，容易退化。例如公布号为CN110100657A的名称为“一种红托竹荪试管母种的生产方法”的专利申请采用的即是木屑培养基。

因此，有必要提供一种适合莫干山野生红托竹荪的分离和纯化方法。

发明内容

本发明提供了一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，该方法适用于莫干山野生红托竹荪的分离和纯化，不仅能够分离纯化获得到莫干山野生红托竹荪菌种，而且能够有效缩短菌种的萌发时间，提高萌发率，促进菌种菌丝的生长，以及抑制菌丝的老化。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，包括以下步骤：

(1)采集莫干山竹林中未开出的完好、硬实野生红托竹荪蛋，清除野生红托竹荪蛋表面的杂尘，对野生红托竹荪蛋进行清洗和消毒；

(2)将野生莫干山野生红托竹荪蛋纵向剖开，取出中间第二层的菌裙组织，接种至分离培养基上，将培养基封口后置于黑暗条件下进行分离培养；

所述分离培养基的配方为：葡萄糖20～30g，蛋白胨2～4g，磷酸二氢钾1～3g，硫酸镁0.5～2g，柠檬酸铵0.5～2g，维生素B1 40～60mg，含90～110g马铃薯、40-55g豆粕和70～100g竹林土的混合煮出液，纯净水定容至1L后，加入琼脂粉11-15g；

所述混合煮出液的制备方法为：按比例将马铃薯、豆粕和竹林土加入至纯净水中，大火煮沸后，小火继续煮一段时间，至溶液中固体物质充分沉淀后，取上清液，得到混合煮出液；所述竹林土为采集到的野生红托竹荪蛋周边的地面以下5～10cm土层的土壤；

(3)菌裙组织经步骤(2)分离培养一段时间后，选择菌丝生长整齐、色泽均匀的培养皿，通过无菌操作挑取菌落尖端菌丝接种到新的分离培养基上，继续培养一段时间直至培养皿发满，获得莫干山野生红托竹荪纯菌种。

本发明通过实验摸索，发现：在经典PDA综合培养基的基础上将马铃薯的量减半，同时添加柠檬酸铵和含有竹林土的混合煮出液，能显著促进红托竹荪子实体组织在琼脂培养基上快速萌发，也能保证萌发菌丝在正常生长，形成一整套适合莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化的方法，对野生红托竹荪种质资源利用有很大帮助，容易获得野生红托竹荪的纯菌种，可以加速驯化、利用莫干山野生红托竹荪种质资源的速度，丰富红托竹荪种植品种，促进红托竹荪产业的快速、稳定发展。

进一步地，步骤(1)中，所述野生红托竹荪蛋的清洗和消毒方法为：用无菌水冲洗野生红托竹荪蛋2～4遍后，用灭菌过的滤纸吸干水分；再用75％的酒精喷洒野生红托竹荪蛋的表面，然后用75％的酒精棉球反复擦拭，进行表面消毒。

进一步地，步骤(2)中，所述菌裙组织为块状，大小为：(5～6)×(5～6)×(3～4)mm。

进一步地，步骤(2)中，所述分离培养的条件为：22-28℃下培养2～4天。

进一步地，步骤(2)的混合煮出液制备过程中，小火继续煮的时间为15～20min。

进一步地，步骤(2)中，所述竹林土为采集到的野生红托竹荪蛋周边2～5cm范围内的土壤，去除土壤表面覆盖的落叶。

进一步地，步骤(2)中，所述分离培养基的制备方法为：

(A)马铃薯去皮后，切成厚薄片；按比例将马铃薯厚薄片、豆粕和竹林土加入至纯净水中，大火煮沸后，小火继续煮一段时间，至溶液中固体物质充分沉淀后，取上清液，得到混合煮出液；

(B)按比例将葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硫酸镁，柠檬酸铵，维生素B1加入到步骤(A)的混合煮出液中，再用纯净水定容至1L，纯净水定容后加入琼脂粉，充分搅拌后微波炉加热至沸腾，取出后轻轻搅拌，再重复加热2～3次，保证琼脂粉完全融化，得到分离培养基；

(C)待分离培养基冷却至60～80℃后，封口，进行高压灭菌，灭菌结束后，冷却至60～80℃，得到灭菌后的分离培养基。

进一步地，步骤(C)中，高压灭菌的条件为：121-126℃下高压灭菌20-30min。

进一步地，步骤(3)中，继续培养的条件为：黑暗条件下，22-28℃下培养2～4天。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明方法通过分离野生红托竹荪的白色菌群，并采用竹林土、柠檬酸铵和马铃薯用量减半的PDA综合培养基作为分离培养基组分进行配合使用，不仅能够分离纯化获得到莫干山野生红托竹荪菌种，而且能够有效缩短菌种的萌发时间，提高萌发率，促进菌种菌丝的生长，以及抑制菌丝的老化。

附图说明

图1为实施例1中野生莫干山野生红托竹荪蛋纵向剖开后取出的中间第二层菌裙组织的图片(白色区域为菌群组织)。

图2为实施例1中经分离、纯化后挑去尖端菌丝继续培养1周的照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、野生资源的采集

每年8月10日—9月15日，选择雨后晴天到浙江省湖州市德清县莫干山镇庙前村附近的山脚下竹林采集未开出的完好、硬实野生红托竹荪蛋，这附近地面腐殖质比较厚的2-5年人工竹林容易采集到。每个野生红托竹荪蛋清除表面杂尘后，用餐巾纸单独包裹，既保持通气，又可以避免损伤。同时，挖取野生红托竹荪周围的竹林土500g左右备用。取土的方法是：清除野生红托竹荪周边2～5cm范围内的土壤表面的竹叶、杂草等覆盖物，取地面以下5-8cm的土层。

2、分离培养基的制备

分离培养基是在PDA综合培养基的基础上进行的优化，具体配方为：以1L计，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，柠檬酸1g，维生素B1 50mg/L，含马铃薯、豆粕和竹林土的混合煮出液，纯净水定容至1L后，加琼脂粉13g。

分离培养基的配制方法为：

(A)马铃薯去皮后，切成厚2-3mm的薄片；按重量称取马铃薯薄片100g,豆粕50g，竹林土80g，加纯净水900ml，先大火煮沸，然后再小火继续煮20分钟，等溶液中固体物质充分沉淀后，取上清液，得到混合煮出液；注意煮上述三种物质时纯净水应适量，一般建议配制1L培养基用900mL左右的纯净水；加入所有物质后，不足部分用纯净水定容至配制培养基总体积；

(B)按重称取葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，柠檬酸铵1g，维生素B1 50mg加入到步骤(A)的混合煮出液中，再用纯净水定容至1L，然后加入琼脂粉13g，充分搅拌后微波炉加热至沸腾，取出后轻轻搅拌30s，再重复加热2次，保证琼脂粉完全融化，得到分离培养基；

(C)待分离培养基冷却至60～80℃后，平均分装至4支500ml三角瓶，用专用封口膜封口之后，125℃高压灭菌25min，灭菌结束后，冷却至60～80℃，在超净工作台将培养基分装至事先准备好的直径9cm一次性无菌培养皿中，1000ml培养基装50-60个培养皿，即每个培养皿装16.5-20ml培养基。培养基每10个一摞叠好，至于超净工作台备用。用培养皿作为分离培养基的容器容易观察组织块的萌发、生长情况、污染等情况，试验阶段还有利于菌丝生长速度的测量等。

3、野生红托竹荪菌种的消毒、分离和纯化

消毒：当日将采集回来的野生红托竹荪在无菌超净工作台上用无菌水冲洗3遍，用灭菌过的滤纸吸干水分，再用75％的酒精喷洒表面，并用75％酒精棉球反复擦，进行表面消毒：

分离：用酒精灯灼烧消毒并冷却的手术刀将野生莫干山野生红托竹荪蛋纵向剖开，取出中间第二层菌裙组织(如图1)，切成约6×6×3mm大小块状，接种到上述琼脂培养基平板(即：分离培养基)上，培养皿用Parafilm专用封口膜封口后置于黑暗，25℃条件下培养3天。

纯化：组织分离培养两周后，选择菌丝生长整齐、色泽均匀的培养皿，在超净工作台上通过无菌操作，用接种铲挑取菌落尖端菌丝接种到新培养基上，培养基配方同上。继续培养3周左右培养皿发满(培养1周的图片如图2)，获得野生红托竹荪纯菌种。

通过设置不同的培养基成分、不同分离部位的处理来进行上述分离培养(除表1中提及的不同设置外，其余步骤完全与上述内容相同)，得到的结果如表1所示。

其中，“I”为PDA，即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，配方为：1L培养基计，马铃薯煮出液200g，葡萄糖20g，用加纯净水定容后，加琼脂粉13g，微波炉加热至琼脂粉完全溶解。

“II”为PDA综合培养基，配方为：1L培养基计，200g马铃薯煮出液，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B1 50mg，用纯净水定容后加琼脂粉13g，微波炉加热至琼脂粉完全溶解。

“III”为PDA综合培养基+竹林土(马铃薯减半)，配方为：1L培养基计，100g马铃薯和80g竹林土两种一起的煮出液，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B150mg，用纯净水定容后加琼脂粉13g，微波炉加热至琼脂粉完全溶解。

“IV”为PDA综合培养基+竹林土+1g柠檬酸铵(马铃薯减半)，配方为：1L培养基计，100g马铃薯和80g竹林土两种一起的煮出液，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B1 50mg，柠檬酸铵1g，用纯净水定容后加琼脂粉13g，微波炉加热至琼脂粉完全溶解。

“V”为PDA综合培养基+竹林土+5g豆粕(马铃薯减半)，配方为：1L培养基计，100g马铃薯、50g豆粕和80g竹林土三种一起的煮出液，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B1 50mg用纯净水定容后加琼脂粉13g，微波炉加热至琼脂粉完全溶解。

“VI”为PDA综合培养基+竹林土+1g柠檬酸铵+50g豆粕(马铃薯减半)，配方为：1L培养基计，100g马铃薯、50g豆粕和80g竹林土三种一起的煮出液，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B150mg，柠檬酸铵1g，用纯净水定容后加琼脂粉13g，微波炉加热至琼脂粉完全溶解。

表1

“+++”表示菌丝整齐浓白，生长势强，不变色、老化；“++”表示菌丝整齐度和生长势一般，不变色、老化；“+”表示菌丝生长不整齐，生长势差，菌丝易老化变色；

由表1可以看出，分离野生红托竹荪的白色菌群，并采用竹林土、柠檬酸铵和用量减半的马铃薯与PDA综合培养基作为分离培养基进行配合使用，不仅能够有效缩短菌种的萌发时间，提高培养120小时的萌发率，还能够促进菌种菌丝的生长，抑制菌丝的老化。

Claims

1.一种莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采集莫干山竹林中未开出的完好、硬实野生红托竹荪蛋，清除野生红托竹荪蛋表面的杂尘，对野生红托竹荪蛋进行清洗和消毒；

（2）将野生莫干山野生红托竹荪蛋纵向剖开，取出中间第二层的菌裙组织，接种至灭菌后的分离培养基上，将培养基封口后置于黑暗条件下进行分离培养；

所述分离培养基的配方为：葡萄糖20~30 g，蛋白胨2~4 g，磷酸二氢钾1~3 g，硫酸镁0.5~2 g，柠檬酸铵0.5~2 g，维生素B1 40~60 mg，含90~110 g马铃薯、40-55 g豆粕和70~100g竹林土的混合煮出液，纯净水定容至1L后，加入琼脂粉11-15g；

所述竹林土为采集到的野生红托竹荪蛋周边2~5cm范围内的地面以下5~10 cm土层的土壤，去除土壤表面覆盖的落叶；

所述分离培养基的制备方法为：

（A）马铃薯去皮后，按比例将马铃薯、豆粕和竹林土加入至纯净水中，大火煮沸后，小火继续煮一段时间，至溶液中固体物质充分沉淀后，取上清液，得到混合煮出液；

（B）按比例将葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硫酸镁，柠檬酸铵，维生素B1加入到步骤（A）的混合煮出液中，再用纯净水定容至1L，纯净水定容后加入琼脂粉，充分搅拌后微波炉加热至沸腾，取出后轻轻搅拌，再重复加热2~3次，保证琼脂粉完全融化，得到分离培养基；

（C）待分离培养基冷却至60~80℃后，封口，进行高压灭菌，灭菌结束后，冷却至60~80℃，得到灭菌后的分离培养基；

（3）菌裙组织经步骤（2）分离培养一段时间后，选择菌丝生长整齐、色泽均匀的培养皿，通过无菌操作挑取菌落尖端菌丝接种到新的分离培养基上，继续培养一段时间直至培养皿发满，获得莫干山野生红托竹荪纯菌种。

2.如权利要求1所述的莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述野生红托竹荪蛋的清洗和消毒方法为：用无菌水冲洗野生红托竹荪蛋2~4遍后，用灭菌过的滤纸吸干水分；再用75%的酒精喷洒野生红托竹荪蛋的表面，然后用75%的酒精棉球反复擦拭，进行表面消毒。

3.如权利要求1所述的莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述菌裙组织为块状，大小为：（5~6）×（5~6）×（3~4）mm。

4.如权利要求1所述的莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离培养的条件为：22-28℃下培养2~4天。

5.如权利要求1所述的莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，步骤（A）的混合煮出液制备过程中，小火继续煮的时间为15~20 min。

6.如权利要求1所述的莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，步骤（C）中，高压灭菌的条件为：121-126℃下高压灭菌20-30min。

7.如权利要求1所述的莫干山野生红托竹荪菌种的分离和纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，继续培养的条件为：黑暗条件下，22-28℃下培养2~4天。