CN104920064B - 一种蛹虫草生产用的专用母种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛹虫草生产用的专用母种的制备方法，利用麸皮，小米为原料，加入一定比例含有蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁的营养液，调节pH后作为培养基，装入茄瓶后，121℃，灭菌30min，无菌操作，接种蛹虫草菌种，18～25℃，恒温培养7～14天，获得生产蛹虫草用的专用母种，将专用母种加入一定量无菌水，接种于发酵罐或固态栽培料，可以大规模获得蛹虫草菌丝体和子实体。本发明省去菌种逐级扩大培养过程，节约生产周期1/3以上；节省了种子逐级扩大设备成本，降低生产成本1/3以上；接种简便，减少污染；降低了菌株退化风险，工业化生产蛹虫草菌丝体及子实体。

Description

一种蛹虫草生产用的专用母种的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种蛹虫草生产用的专用母种的制备方法，属于食用菌生产技术领域。

背景技术：

蛹虫草Cordyceps militaris L.Link，又名北冬虫夏草，北虫草。蛹虫草是为数不多的几种可以在人工培养基、家蚕或柞蚕蛹上进行人工批量培养的药用真菌。蛹虫草的菌丝体及子实体中含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、SOD、腺苷、鸟苷、尿苷等多种药用成分，同时富含多种人体必需氨基酸和微量元素。蛹虫草工业化获得菌丝体及子实体需要大量制备液体菌种。蛹虫草的液体菌种制备过程包括：斜面母种制备→一级摇瓶→二级摇瓶(扩大培养)→液体菌种(发酵罐)。菌种需逐级扩大培养，这种生产方法存在生产周期长、易污染、生产成本高、菌种容易退化等缺点。这些问题不利于蛹虫草菌丝体和子实体的工业化生产。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种解决现有技术问题的一种蛹虫草生产用的专用母种的制备方法。

实现本发明目的的技术方案有以下步骤：

专用母种制备方法：

1、一级摇瓶菌种

①培养基配方(g/L)：马铃薯200g，磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、柠檬酸铵1g、葡萄糖30g、蛋白胨3g、维生素B1 50mg。

②生产工艺：

马铃薯浸汁制备：优质无菌的马铃薯削皮，用水清洗干净，称重200g马铃薯，切成3-4mm片，放入锅中，加入清水1L煮到酥而不烂，用纱布过滤残渣，取出过滤液倒入容器中冷却后待用。

配料：称取磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、柠檬酸铵1g、葡萄糖30g、蛋白胨3g、维生素B150mg，加入马铃薯煮出液，搅拌均匀，定容至1000mL。

分装：将配置好的培养基分装到500mL锥形瓶中，每瓶200mL。三角瓶中放入5mm玻璃株20-30粒，8层纱布和双层报纸封口。

灭菌：将培养基放入高压灭菌锅，115℃，高压灭菌20分钟，冷却后取出备用。

接种：接入蛹虫草一级斜面母种，每瓶接种0.5-1cm²菌种块，5-6块。

培养：将接好种的菌瓶，在23-25℃静置培养2天，再放在回转式摇床中，23-25℃，120-160转/分震荡培养3-5天。

2、专用母种生产：按重量百分比计

培养基配方：麸皮78％，小米20％，另外加入营养液，料液比1∶1.3，pH 6.5。

营养液配方：(蔗糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁5g，水1000mL)。

生产工艺：

原料处理：将麸皮和小米分别过孔径为1mm和2mm筛，选用两筛之间的颗粒做为原料。

配料：按营养液配方称取配料，将其溶解在水中，配制营养液。然后按培养基配方称取上述过筛后的麸皮和小米，按料液比＝1∶1.3加入营养液，料液比为重量比，与小米、麸皮等充分混匀。

装瓶：将上述培养料装入，500mL茄瓶，摊平，每瓶装干料50-70g，装料厚度1-2cm，塞好棉塞，扎好牛皮纸，121-126℃灭菌45分钟，待温度降至30℃以下备用。

接种：用灭菌好的移液管把培养好的一级摇瓶菌种接种到上述茄瓶中的固态培养基中。

培养：在23-25℃条件下避光培养，菌丝长满后即可。

保藏：将培养好的专用母种，加入30-50mL 30％的无菌甘油，混匀，于4℃冰箱保藏。

本发明的积极效果有：

(1)省去菌种逐级扩大培养过程，节约生产周期1/3以上。

(2)节省了种子逐级扩大设备成本，降低生产成本1/3以上。

(3)接种简便，减少污染。

(4)降低了菌株退化风险。

具体实施方式：

以下通过实施例对本发明做进一步描述：

实施例1：专用母种制备

专用母种制备方法：

1、一级摇瓶菌种

①培养基配方(g/L)：马铃薯200g，磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、柠檬酸铵1g、葡萄糖30g、蛋白胨3g、维生素B1 50mg。

②生产工艺：

马铃薯浸汁制备：优质无菌的马铃薯削皮，用水清洗干净，称重200g马铃薯，切成3-4mm片，放入锅中，加入清水1升煮到酥而不烂，用纱布过滤残渣，取出过滤液倒入容器中冷却后待用。

配料：称取磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、柠檬酸铵1g、葡萄糖30g、蛋白胨3g、维生素B150mg，加入马铃薯煮出液，搅拌均匀，定容至1000mL。

分装：将配置好的培养基分装到500mL锥形瓶中，每瓶200mL。三角瓶中放入5mm玻璃株20-30粒，8层纱布和双层报纸封口后。

灭菌：将培养基放入高压灭菌锅，115℃，高压灭菌20分钟，冷却后取出备用。

接种：接入蛹虫草一级斜面母种，每瓶0.5-1cm²菌种块，5-6块。

培养：将接好种的菌瓶，在23-25℃静置培养2天，再放在回转式摇床中，23-25℃，120-160转/分震荡培养3-5天。

2、专用母种生产

培养基配方：按重量百分比计。麸皮78％，小米20％，另外加入营养液，料液比1∶1.3，pH 6.5。

营养液配方：(蔗糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁5g，水1000mL)。

生产工艺：

原料处理：将麸皮和小米分别过孔径为1mm和2mm筛，选用两筛之间的颗粒做为原料。

配料：按营养液配方称取配料，将其溶解在水中，配制营养液。然后按培养基配方称取上述过筛后的麸皮和小米，按料液比＝1∶1.3加入营养液，料液比为重量比，与小米、麸皮等充分混匀。

装瓶：将上述培养料装入，500mL茄瓶，摊平，每瓶装干料50-70g，装料厚度1-2cm，塞好棉塞，扎好牛皮纸，121-126℃灭菌45分钟，待温度降至30℃以下备用。

接种：用灭菌好的移液管把培养好的一级摇瓶菌种接种到上述茄瓶中的固态培养基中。

培养：在23-25℃条件下避光培养，菌丝长满后即可。

实施例2菌丝体大量培养

发酵培养基配方：蛋白胨20g，蔗糖20g，MgSO4·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1g，植物油20mL或(泡敌0.3mL)，水1000mL，pH 6.5。

培养基配制：按配方比例称取上述试剂，配制75L液体培养基。

上料：先将发酵罐pH电极和溶氧电极进行标定，再加入发酵培养基和消泡剂植物油或泡敌。

灭菌：121-126℃灭菌30分钟，待温度降至30℃以下备用。调节转速150r/min，通气量1.5vvm，调节溶氧浓度为100％。

种子液准备：在专用母种茄瓶中，加入300mL无菌水，将菌种捣碎，制成菌悬液。

接种：用火圈法无菌接入种子液。

培养：发酵过程中控制温度25℃，溶氧浓度10-20％，发酵周期96h。发酵过程中每8小时取样1次，分析测定菌体干重、pH、残糖、虫草素浓度、发酵液氮含量。

放料：发酵结束后，压差法放出发酵液。

菌丝体收集：用板框过滤机，过滤收集菌丝体，洗涤、干燥。

实施例3：子实体栽培

固态栽培料配方：大米(30g)+营养液35mL。

营养液配方：(蔗糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁5g，水1000mL)。

培养基制备：按配方称取大米和配置营养液。

装瓶：14×8×12cm高的塑料容器，加入30g大米，再加入35mL营养液，摇匀，用高压聚丙烯薄膜和皮筋包扎封口。

灭菌：高压蒸汽灭菌121℃，灭菌30min，灭菌后取出瓶子进行冷却，接种。

液体菌种制备：在专用母种茄瓶中，加入300mL无菌水，将菌种捣碎，制成菌悬液。

接种：用灭过菌的枪头(枪头口用剪刀剪大)吸取液体菌种，每盒接入液体菌种10mL，使菌种均匀覆盖培养基表面，用封口膜封好，转入培养室培养。

菌丝体培养：待菌丝体布满培养瓶之后(大约需要进过五天培养，温度不同时间长短会略有差异)，调节温度20℃(低于或者高于这个温度，生长速度减慢)继续栽培15天左右。遮光保持黑暗状态，温度保持在16～20℃，相对湿度控制在60％左右。发菌阶段一般需10～14d，等菌丝布满培养基表面并穿透培养基见底时，就可转移出蛹虫草发菌室进行见光培养。

转色：优良的蛹虫草菌丝见光后2～3d便会从白色转为橘黄色，转色阶段光照强度为150～2500Lux，光照时间每天不少于12h，培养温度20～22℃

催芽及出草：转色结束后催芽，催芽阶段需拉大温差，适宜温差在10℃左右，即温度白天保持为20～22℃、晚上为10～12℃。如果控温设施条件有限，晚上温度尽可能降至16℃以下。催芽一至两个星期恢复到常培养温度20～22℃。出草初期出草室的湿度保持80％左右.待子实体生长至1cm时，用在封口膜戳4～6个小孔(孔直径6mm左右)，加大湿度至90％左右，每天早、中、晚三次通风，通风时间为30min，每天12h以上光照。

采收及保存：蛹虫草子实体跃至10cm左右时，长成上粗下细的棒状且表面出现粒状粉末时，表明子实体成熟，即可采收。用消过毒的医用镊子夹取子实体。采收后的子实体40℃以下烘干或晾干，密封于塑料袋中，短期保存置阴凉干燥处，长期保存可置于低温冰柜中。

Claims (1)

1.一种蛹虫草生产用的专用母种的制备方法，其特征在于：

I培养基配方：按重量百分比计，麸皮78％，小米20％，另外加入营养液，料液比1∶1.3，pH 6.5；营养液配方：蔗糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁5g，水1000mL；

II生产工艺：

原料处理：将麸皮和小米分别过孔径为1mm和2mm筛，选用两筛之间的颗粒做为原料，

配料：按营养液配方称取配料，将其溶解在水中，配制营养液，然后按培养基配方称取上述过筛后的麸皮和小米，按料液比＝1∶1.3加入营养液，料液比为重量比，与小米、麸皮等充分混匀，

装瓶：将上述培养料装入500mL茄瓶，摊平，每瓶装干料50-70g，装料厚度1-2cm，塞好棉塞，扎好牛皮纸，121-126℃灭菌45分钟，待温度降至30℃以下备用，

接种：用灭菌好的移液管把培养好的一级摇瓶菌种接种到上述茄瓶中的固态培养基中，

培养：在23-25℃条件下避光培养，菌丝长满后即可，

保藏：将培养好的专用母种，加入30-50mL 30％的无菌甘油，混匀，于4℃冰箱保藏。