CN102939916A - 一种提高牡蛎体内epa含量的育种方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高牡蛎体内EPA含量的育种方法及其应用，利用来自于同一物种不同亚种或种群的纯种牡蛎为亲本，通过种内亚种间或种群间同源远交产生EPA含量高的杂种后代。本发明的育种方法能够显著地提高牡蛎体内的EPA含量达10%以上，效率高，且不需要转基因、药物处理等技术，操作简便，实用性强。

Description

一种提高牡蛎体内EPA含量的育种方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高牡蛎营养成分的育种方法及其应用，具体说是一种提高牡蛎体内EPA含量的育种方法及其应用。 

背景技术

二十碳五烯酸（Eicosapntemacnioc Acid，缩写为EPA），是人体自身不能合成但又不可缺少的重要长链多不饱和脂肪酸，因此称为人体必需脂肪酸。EPA具有清理血管中垃圾（胆固醇、甘油三酯），疏导心脏血管的功能，也被誉为“血管清道夫”；EPA能够促进体内饱和脂肪酸代谢，加强水代谢，具有减肥作用；EPA还可以防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展及预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病。然而，人体不能够自己合成EPA，必须从食物中获得。因此，提高食物中的EPA含量对人类健康具有非常重要的意义。 

牡蛎俗称“蚝”、“海蛎子”等，味道鲜美、营养丰富，蛋白含量高，素有“海洋牛奶”之称。牡蛎中也含有较高的不饱和脂肪酸，其含量通常在4.74%-19.96%。中医学认为，牡蛎重镇安神，潜阳补阴,软坚散结,收敛固涩；对于惊悸失眠、劳神伤脾、阳萎、腰痛、崩漏等症有疗效。因品种和地区的差异，牡蛎的营养成分也有一定的差别。 

牡蛎也是世界水产养殖产量最高的种类。据世界粮农组织统计，全世界仅太平洋牡蛎养殖产量在2003年就已达到440万吨。我国是贝类养殖大国，同时也是牡蛎养殖大国，2009年，牡蛎养殖产量达350.38万吨，占养殖贝类总产量的32.55%。近10年来我国牡蛎产量一直呈上升趋势。目前，我国养殖的牡蛎多为巨蛎属（Crassostrea）种类，如太平洋牡蛎（C.gigas）、近江牡蛎（C.ariakensis）、香港巨 牡蛎（C.hongkongensis）、葡萄牙牡蛎（C.angulata）等。然而，由于养殖规模的扩大，“水蛎子”日渐增多，导致牡蛎的营养品质不断下降，严重地影响了牡蛎的产量和效益。因此，必须寻求一种方法来提高牡蛎的营养成分，解决养殖牡蛎营养品质下降问题。 

太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)和葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)在系统分类学上均属软体动物门（Mollusca）、双壳纲（Bivalvia）、珍珠贝目（Pterioida）、牡蛎科（Ostreidae）、巨蛎属（Crassostrea），它们都是非常优良的养殖贝类，在日本、欧洲、澳大利亚等世界各地都有大量养殖。它们也是我国牡蛎养殖的主要种类，其总产量占中国养殖牡蛎年总产量的2/3以上。 

太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎的分类地位一直存在争议。有人认为它们是同一个种（Ranson，1960；Mathers，1974）；有人认为它们是两个种（Heral，1986；Bougrier，1986；Parache，1989；Boudry，1998）；也有人把它们归为两个亚种（Huvet，1974；Menzel，1974；Batista等,2007；wang等，2010;郑怀平等，2012）。根据杂交试验结果，将太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎认定为处于亚种水平（郑怀平等，2012）。尽管，这两个亚种间杂交在生长、存活等产量性状方面都有报道（Batista等,2007；郑怀平等，2012），但能否提高EPA含量方面却没有报道。 

“同源远交”指的是源自于同一物种的不同亚种（种群）间的个体或群体水平的交配。众所周知，杂交是动植物遗传改良的重要手段，其目的就是为了获得杂种优势。杂种优势是指两个遗传背景不同的亲本杂交产生的杂种F1在生长势、生活力、生殖力、抗逆性、产量和品质上比亲本的一方或双亲优越的现象。但并不是所有杂交都能够产生杂种优势。当杂种的表型超越双亲表型的平均值时，这样的杂交产生了杂种优势，当杂种的表型值低于双亲表型的平均值时，这样的杂交就产生了杂种衰退。研究表明，牡蛎的种间远源杂交绝大多数是不成 功的。然而，利用种内不同亚种或不同地理种群的同源远交方法改良牡蛎品种性状却取得了可喜的进展，大多能够产生正的杂种优势。但迄今为止，利用同源远交的育种方法提高牡蛎体内EPA含量的文献却一直没有报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种提高牡蛎EPA含量的育种方法，该育种方法有效地解决了我国牡蛎养殖营养品质低下的问题，为高值化牡蛎品种的培育提供了一条新途径，推动了我国牡蛎养殖产业的发展。 

为达到上述目的，本发明提供的提高牡蛎EPA含量的育种方法包括下列步骤： 

（1）纯种种贝选择与性腺促熟：选择源自同一种牡蛎的不同亚种或种群的纯种种贝，并调控种贝性腺同步成熟； 

（2）杂种后代的生成：以性腺成熟的种贝为亲本，分别获得精子和卵子，然后采用种内亚种间或种群间远交产生杂种后代。 

其中，步骤（1）中，选择养殖在我国长江以北的纯种的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas gigas，简称为G)和养殖在长江以南的纯种的葡萄牙牡蛎(Crassostrea gigas angulata，简称为A)为种贝，采用形态学和分子生物学方法对亲本进行纯种鉴定，并采用常规的升温方法在室内调控种贝性腺同步成熟。 

步骤（2）中，以性腺成熟的太平洋牡蛎（Crassostrea gigas gigas，简称为G）和葡萄牙牡蛎（Crassostrea gigas angulata，简称为A）为亲本，每种种贝的雌雄个体数至少为20个，采用解剖法分别获得精子和卵子，采用种内亚种间远交进行人工授精，产生杂种后代GA和AG。杂种后代的受精卵在水温23℃-30℃、盐度28-33、连续微充气条件下，经过20-28h即可发育至D型幼虫。 

本发明提供的提高牡蛎EPA含量的育种方法还包括幼虫培育与稚贝养成。 

幼虫培育和稚贝养成采用如下方法：幼虫培育在室内进行，连续微充气；幼虫培育的初始密度为2-5个/ml，优选为3个/ml；幼虫的饵料为球等鞭金藻（Isochrysis galbana）和青岛大扁藻（Platymonas subcordiformis.(wille)Hazen），幼虫培育时每日投饵3次，前3天投喂金藻，每次1-2万个藻类细胞/ml，优选为1万个藻类细胞/ml；接下来投喂金藻与扁藻（1：1），头7天每次3-6万个藻类细胞/ml，优选为5万个藻类细胞/ml；之后每次投喂8-10万个藻类细胞/ml，优选为10万个藻类细胞/ml；每日换水1次。当20%~30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的牡蛎壳、扇贝壳等附着基进行采苗，按每个附着基附着8-10个稚贝投放，优选为10个。当水体中的浮游幼虫全部附着变态后，进行海上稚贝养成。 

对杂种后代的EPA含量进行测定：解剖获得杂种后代的新鲜的软体组织，至少为15个。将软体组织先搅匀、真空冷冻干燥再研磨成粉，先根据Folch等的A simple method for the isolation and purifica-tion of total lipids from animal tissues.J Biol Chem,1957,226,497-509中的方法用氯仿-甲醇混合液抽提脂肪，然后根据Morrison等的Preparation of fatty acid methyl esters and dimethylacetals from lipids with boron fluoride-methanol.J Lipid Res,1964,5,600-608的方法用NaOH甲醇溶液对脂肪进行甲酯化，最后采用气相色谱测定杂种牡蛎的EPA含量。 

本发明的另一目的是上述育种方法在培育高值化牡蛎品种中的应用。 

本发明的提高牡蛎体内EPA含量的育种方法具有如下优点： 

1、本发明的育种方法通过1代杂交就可使牡蛎体内的EPA含量显著地提高10%以上，效率高。 

2、本发明的育种方法不需要转基因、药物处理等技术，操作简便，实用性强，对生物和环境安全没有影响。 

3、本发明的育种方法首次从提高多不饱和脂肪酸含量的角度改良牡蛎的营养品质，开辟了高值化牡蛎品种培育的新途径，也为其他贝类新品种的培育起到了示范作用。 

4、EPA对医疗、保健等方面有特殊的作用，EPA含量的提高也可提高牡蛎产品的附加值，使其经济价值得到提高，因此本发明的育种方法可有效地解决目前牡蛎产品价格贱、产值低等问题，增加养殖企业和养殖户的收入，市场前景广阔。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照本领域的常规方法和条件进行。 

实施例1 

1、种贝选择、纯种鉴定及性腺促熟：2010年6月，从汕头和青岛两地各选择100个健康、无损伤的1龄牡蛎为种贝。先各取10个，通过形态学和16S测序对种贝进行纯种鉴定，结果表明青岛养殖的牡蛎为太平洋牡蛎（Crassostrea gigas gigas，简称为G），汕头养殖的牡蛎为葡萄牙牡蛎（Crassostrea gigas angulata，简称为A），二者都属于太平洋牡蛎这个种、均为纯种，但属于不同亚种。这些种贝先在海区自然催熟半个月，然后再移到室内、放在4个500L的聚乙烯桶中通过常规的升温方法对性腺进行人工促熟。约10天左右，两个亚种的种贝性腺即可同步成熟。可采用常规的镜检方法检查性腺是否成熟。 

2、杂种和纯种后代的生成：以性腺成熟的G和A为种贝，解剖分别获得各自的精子和卵子。每个亚种的雌雄种贝都用20个，接着将同一亚种的卵子混在一起并等分为两部分、同一亚种的精子也混在一起，并等分为两部分。然后取适量的G精子与A卵子，取适量的 A精子与G卵子受精进行亚种间远交，建立了同源杂种后代，即为杂种组；同时取适量的G精子与G卵子受精、取适量的A精子与A卵子受精进行亚种内近交，建立了同源纯种后代，即为纯种组，作为杂种组的对照组。最后产生两个杂种组GA和AG、两个纯种组GG和AA。通过显微镜观察，精子量以每个卵子周围4-5个为宜。在27℃-28℃、盐度31-32条件下，经过24h，受精卵发育至D型幼虫。 

3、幼虫培育与稚贝养成：幼虫培育与稚贝养成采用常规方法。幼虫培育在室内进行，稚贝养成在海上进行。用300目筛绢网收集D型幼虫放入500L的聚乙烯桶中充气培育。幼虫培育的初始密度为3个/ml、水温为27℃-28℃、盐度为31-32，每个组设置3个重复。幼虫的饵料以球等边金藻和青岛大扁藻为主，每日投饵3次。前3天投喂金藻、每次1万个藻类细胞/ml；接下来投喂金藻与扁藻（1：1）、头7天每次5万个藻类细胞/ml、之后每次投喂10万个藻类细胞/ml；每日换水1次，壳顶期和出眼点时将幼虫换入其他干净的500L的聚乙烯桶中培育。每两天对幼虫培养密度进行定量，并通过调节培养水体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致。幼虫培育期间不加抗生素。15天后，幼虫眼点率为30%，投放牡蛎壳或扇贝壳等附着基，按每个附着基附着10个稚贝投放。投放附着基约1周后，幼虫全部变态为稚贝。稚贝在室内500L的聚乙烯桶中继续养殖1周，将附有稚贝的牡蛎壳或扇贝壳用绳子串起并做好标记，在天气晴朗的下午出池，挂到海上进行稚贝养成；之后，定期检查稚贝的生长和存活情况。6个月后，可生长到5cm-6cm。为了减少环境的影响，从幼虫、稚贝到养成阶段，杂种组与纯种组的养殖环境始终保持一致。 

4、EPA含量的测定与比较：从杂种组和纯种组中各取15个成体牡蛎为材料，活体解剖获得新鲜的软体组织。同一种的软体组织先搅匀、真空冷冻干燥再研磨成粉。先根据Folch等(1957)的方法用氯仿-甲醇混合液（v/v=2/1）方法抽提脂肪，氯仿:甲醇=2:1，每次2ml。 然后根据Morrison等（1964）的方法用NaOH甲醇溶液对脂肪进行甲酯化，最后用气相色谱仪分析脂肪酸组分，测定出杂种组和纯种组样品中的EPA含量。杂种牡蛎GA和AG的EPA含量分别为14.91%±0.12%和13.94%±0.14%，平均值为14.43%，纯种牡蛎GG和AA的EPA含量分别为12.74%±0.42%和13.04%±0.02%，平均值为12.89%，然后对杂种与纯种的EPA含量进行比较，发现杂种牡蛎体内的EPA含量比纯种牡蛎体内的EPA含量显著地高出了11.95%。因此，同源远交能够提高牡蛎体内的EPA含量达10%以上。 

显然本发明能够显著地提高牡蛎体内的EPA含量，从而可有效地解决目前养殖牡蛎营养品质低下的问题，为高值化牡蛎品种的培育提供了一条新途径。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (10)

1.一种提高牡蛎体内EPA含量的育种方法，包括下列步骤：

（1）纯种种贝选择与性腺促熟：选择源自同一种牡蛎的不同亚种或种群的纯种种贝，并调控种贝性腺同步成熟；

（2）杂种后代的生成：以性腺成熟的种贝为亲本，分别获得精子和卵子，然后采用种内亚种间或种群间远交产生杂种后代。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤（1）中，选择养殖在我国长江以北的纯种的太平洋牡蛎（Crassostrea gigasgigas，简称为G）和养殖在长江以南的纯种的葡萄牙牡蛎（Crassostreagigas angulata，简称为A）为种贝。

3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，纯种种贝是通过采用形态学和分子生物学方法鉴定进行选择的。

4.根据权利要求1-3任一项所述的育种方法，其特征在于，步骤（2）中，以性腺成熟的太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎为亲本，采用解剖法分别获得精子和卵子，采用种内亚种间远交进行人工授精，产生杂种后代GA和AG。

5.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，杂种后代的受精卵在水温23℃-30℃、盐度28-33、连续微充气条件下，经过20-28h发育至D型幼虫。

6.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，该育种方法还包括幼虫培育与稚贝养成。

7.根据权利要求6所述的育种方法，其特征在于，幼虫培育的初始密度为2-5个/ml。

8.根据权利要求6所述的育种方法，其特征在于，幼虫的饵料为球等鞭金藻（Isochrysis galbana）和青岛大扁藻（Platymonassubcordiformis.(wille)Hazen），幼虫培育时每日投饵3次，前3天投喂金藻，每次1-2万个藻类细胞/ml；接下来投喂金藻与扁藻（1：1），头7天每次3-6万个藻类细胞/ml；之后每次投喂8-10万个藻类细胞/ml；每日换水1次。

9.根据权利要求6所述的育种方法，其特征在于，当20%~30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的附着基进行采苗，按每个附着基附着8-10个稚贝投放。

10.权利要求1至9中任一项所述的育种方法在培育高值化牡蛎品种中的应用。