CN110741873B

CN110741873B - 热带棕榈灵芝的驯化、栽培及控制其生长的方法

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Publication number: CN110741873B
Application number: CN201910772935.4A
Authority: CN
Inventors: 任鹏飞; 曲玲; 任海霞; 彭世豪; 刘宪瑞; 王淑梅; 王晓丹; 董丽丽; 连洁; 万鲁长; 郭惠东; 蔡伊文
Original assignee: Quanyu Industry Co ltd; Institute of Agricultural Resources and Environment of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Quanyu Industry Co ltd; Institute of Agricultural Resources and Environment of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2039-08-21
Also published as: CN110741873A

Abstract

本发明属于微生物栽培领域,具体涉及生长于棕榈树上的热带棕榈灵芝的驯化方法、栽培方法及控制其生长的方法。本发明通过设置不同的变量，获得了热带棕榈灵芝的驯化方法；并且以该驯化后的热带棕榈灵芝为种源进行栽培。本发明在热带棕榈树上喷洒木霉菌菌丝体提取液，以控制该热带棕榈灵芝的生长，在此控制过程中采用的木霉菌为拮抗棕榈灵芝的木霉菌，该木霉菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC NO.17669。本发明通过对灵芝生长环境的研究，不仅合理有效的利用资源与环境，而且适应性调整并获得了热带棕榈灵芝最适生长环境，得到的热棕榈灵芝菌盖厚实坚硬，品质优越，菌丝呈白色。

Description

热带棕榈灵芝的驯化、栽培及控制其生长的方法

技术领域

本发明属于微生物栽培领域,具体涉及生长于棕榈树的热带棕榈灵芝的驯化方法、栽培方法及控制方法。

背景技术

油棕产业在马来西亚国家的农业发展中拥有非常辉煌的历史。19 世纪末，马来半岛已经开始尝试种植油棕，并于1917年开始实行商业种植。1997年，马来西亚油棕种植面积达到289万hm²，年产约 1000万t棕榈油，其中超过90％出口国外，当年马来西亚的棕榈油出口占全世界产量的51.9％，成为全球最大的棕榈油出口国。2014年，马来西亚油棕种植面积达到485万hm²，棕榈油产量达到1699万t，其中1666万t出口国外，创外汇约620亿美元。申请人发现热带棕榈灵芝品种寄生于马来西亚棕榈树上，对棕榈树的商品性造成不良影响，严重影响了棕榈书的生长和棕榈油的生产。因此,对此灵芝进行品种驯化工作，期望得到有效控制此灵芝生长的方法和种植此灵芝的方法，合理有效的利用资源与环境。

灵芝在我国古代早就作为滋补强壮、扶正培本的珍贵药材。东汉年间的《神农本草经》、宋代的《重修政和经史证类备用本草》以及明代的《本草纲目》等古典医书对灵芝的药用功效均有记载，认为灵芝具有“益心气”、“坚筋骨”、“利关节”和“治耳聋”等功效。现代科学也已经证实，灵芝富含具有药用功效成分和保健作用的多种有效成分，具有明显的镇静、镇痛、强心、止咳、祛痰、平喘、降压、降血糖、降血压等功效，可以增强冠状血管循环功能，促进肝脏合成血清蛋白，而且有抗肿癌和抗辐射损伤的作用，长期服用，有美容、抗衰老和益寿延年之功效。

热带灵芝是我国已被人们所利用的14种灵芝之一，具有保肝健肝之功效，福建民间常用来治冠心病，亦被用于制作灵芝糖浆。鉴于近年来热带灵芝资源的减少趋势，申请人拟从野生热带灵芝中分离出纯化的菌种并对其进行驯化，探究热带棕榈灵芝的最适生长特性并进行扩大繁殖，并在人工条件下进行驯化栽培，以便为热带灵芝的种质保存和生物学特性研究等领域提供第一手资料，并为热带灵芝今后的产业开发提供科学依据和技术支撑。

虽然刘国民在“野生热带灵芝G anoderm a tropicum(J ungh)B res.菌种分离与驯化研究”介绍了热带灵芝的驯化方法，但是其针对的灵芝是生长于海南的海口市海南师范大学校园内的相思树(Acacia auriculiform is A.Cunn.ex Benth.)腐朽树桩上的热带灵芝，并不是本申请针对的生长于热带棕榈树上的灵芝，并且刘国民并未对热带灵芝最适生长环境进行筛选，仅仅针对的是自然环境到人工栽培环境的驯化，未涉最适生长环境的优选。

基于上述背景技术的介绍，本申请的发明人发现现有技术存在以下技术问题亟待解决：热带棕榈灵芝品种寄生于马来西亚棕榈树上，对棕榈树的商品性造成不良影响，严重影响了棕榈油的生产；热带棕榈灵芝在长出子实体后子实体会变得坚硬，且自然生长的热带棕榈灵芝在长出子实体后会因高温高湿而霉变，热带棕榈灵芝资源并未得到有效利用；热带棕榈灵芝的人工栽培技术还处于空白阶段。热带棕榈灵芝的控制技术目前还处于空白阶段。

经申请人检索，目前鲜有相关的专利文献或期刊文献针对热带棕榈灵芝驯化时最优生长环境的筛选，也没有控制热带棕榈树上热带棕榈灵芝生长的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明探究热带棕榈灵芝的生理特性，根据此生理特性对此灵芝进行人工驯化栽培并得到控制其生长的方法，以减轻对马来西亚棕榈树的危害情况。

本发明所要解决的另一问题是：获得热带棕榈灵芝的人工栽培方法以解决热带棕榈灵芝子实体变硬导致的营养物质难以利用和热带棕榈灵芝子实体霉变的问题。

一种热带棕榈灵芝的驯化方法，包括如下步骤:

(1)选择生长旺盛、长势较好的热带棕榈灵芝菌种，以不同的碳源为变量，配制培养基，灭菌，将优势热带棕榈灵芝菌种在无菌环境下接入不同碳源的平板中培养；

(2)设置不同温度梯度，配制相同的培养基，灭菌，在无菌条件下接入优势热带棕榈灵芝菌种；

(3)设置不同的湿度梯度，配制干料比相同的木屑试管培养基，调至不同的湿度，灭菌冷却后将优势热带棕榈灵芝菌种接入木屑试管培养基中培养；

(4)设置不同的pH梯度配制相同的培养基调节为上述梯度的 pH，灭菌后，在无菌条件下接入优势热带棕榈灵芝菌种培养；

(5)获得热带棕榈灵芝菌种生长的最佳碳源、温度、湿度、pH 条件；

(6)在(5)中获得的最佳碳源、温度、湿度、pH条件下，栽培。

优选的，(1)中，碳源为葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉。

具体的，(1)中菌种选择：选在25℃培养箱中培养的菌丝雪白、生长旺盛、长势较好的热带棕榈灵芝菌种，设置葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉这6个变量，每个变量4个平板重复，配制培养基，灭菌，将优势热带灵芝菌种在无菌环境下接入不同碳源的平板中培养7天，观察菌丝的长势，做好记录和拍照。

(2)中，设置不同的温度梯度，每个梯度至少4个重复，配制相同的培养基，灭菌后，在无菌条件下接入优势热带棕榈灵芝菌种，在不同温度下黑暗培养7天，做好结果的观察和记录；

优选的，(2)中，设置温度梯度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，每个梯度至少4个重复，配制相同的培养基，灭菌后，在无菌条件下接入优势热带棕榈灵芝菌种，在不同温度下黑暗培养7天，做好结果的观察和记录。

(3)设置以下的湿度梯度：50％、55％、60％、65％、70％；每个梯度5个重复，配制干料比相同的木屑试管培养基，调至不同的湿度，灭菌冷却后将优势热带棕榈灵芝菌种接入木屑试管培养基中，培养 14天，每两天观察结果记录生长状况。

(4)设置pH梯度：5、6、7、8、9、10；每个梯度4个重复；配制相同的培养基调节为上述梯度的pH，灭菌后，在无菌条件下接入优势热带棕榈灵芝菌种，在不同温度下黑暗培养7天，做好结果的观察和记录。

热带棕榈灵芝的人工栽培方法，按照如下步骤进行：

(1)热带棕榈灵芝的驯化

选取权利要求1中的优势热带棕榈灵芝作为种源，提取野生灵芝内的母体，经过对母体的驯化培育，将野生灵芝的原母体驯化培育成新的灵芝栽培种；

(2)按照培养料配方拌料后装入菌袋中灭菌后，待冷却后放入接菌室中；

(3)紫外照射同时臭氧处理；结束后打开超净台的通风装置，然后接种步骤(1)得到的灵芝栽培种；

(4)接种后在黑暗条件下培养，将上述步骤中所获得的最佳的碳源、温度、湿度和pH作为培养条件，同时监控培养料；

(5)待灵芝菌丝生长满菌袋后进行出菇。

具体的，(1)热带棕榈灵芝的驯化包括以下的步骤：

S1:选择外形良好，颜色鲜艳，未霉变的热带棕榈野生灵芝子实体，将其菌柄基部切断，取回用无菌水冲洗数遍，然后放进种接箱中用75％酒精浸泡4～7min，再用HgC1溶液处理12min，用无菌水冲洗，在超净工作台用手术刀削去子实体皮壳，将其菌肉切成1cm³大小粒，经火焰消毒移接到母种培养基试管斜面上；

S2:先将马铃薯洗净去皮，去除芽，再称取400克切成薄片，加水 1000ml煮沸20～30min，用5～8层纱布过滤，过滤液补足至1000ml，加入20克葡萄糖，3克磷酸二氢钾,1克七水硫酸镁，搅拌均匀，加热，最后再加50克琼脂，继续加热搅拌混匀，之后再配上20％的热带棕榈灵芝子实体煮出液的过滤液，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，100～ 115℃灭菌20min后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用，将接入野生灵芝的试管置于25℃恒温箱中培养，待菌丝成熟后挑选无污染，菌丝洁白粗壮，生长清晰的斜面，挑取菌丝前端部份进行扩管，作为热带棕榈灵芝母种；

S3:将热带棕榈灵芝母种取出，接入原种培养基，其培养基配方为：杂木屑70～80份，麸皮10～15份，玉米粉，5～6份，菇耳壮， 0.5～0.8份，石膏粉2份，pH＝5，含水量50-60％，之后置25℃培养室内培养，培养时间35～40天，即得灵芝原种；

S4:将灵芝原种接入栽培种培养基，其培养基配方为：杂木屑 70-80份，麸皮10～15份，玉米粉，5～6份，菇耳壮，0.5～0.8份，石膏粉2份，pH＝5，含水量50～60％，之后置25℃培养室内培养，培养时间35～40天，可长满全瓶，选取菌丝洁白粗壮、生活力强的菌种作为热带棕榈灵芝栽培种；以上均为重量份。

优选的，(2)中，培养料配方：玉米芯75％、木屑10％、麸皮 10％、石灰5％，料水比1.3～1.4；

优选的，(3)紫外照射同时臭氧处理40min；结束后打开超净台的通风装置，然后接种步骤(1)得到的灵芝栽培种，总共接种800 包；

优选的，(4)接种后在黑暗条件中于25℃下培养，控制湿度50％，监控培养料，控制pH在5±0.2。

控制棕榈树上热带棕榈灵芝生长的方法，是在热带棕榈树上喷洒木霉菌菌丝体提取液，木霉菌为拮抗棕榈灵芝的木霉菌，该木霉菌于 2019年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC NO.17669。

采用本方法和步骤栽培的热带棕榈灵芝，选用的由野生热带棕榈灵芝母种驯化而成的灵芝新品种适合在人工的湿润的环境中生长，生命力旺盛，抗杂菌强，栽培出的灵芝，其菌盖厚实坚硬，品质优越，菌丝呈白色，菌盖硬度降低，孢子粉的产量也大大提高，具有很好的药用保健价值，并且子实体霉变现象的发生。本发明提供的控制热带棕榈灵芝的方法效果好，控制率高，且对棕榈树的生长产生明显影响。

本发明所提供的木霉菌是申请人在生产实践中筛选并保存的木霉菌株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该木霉保藏号为:CGMCC NO.17669。该木霉菌是申请人通过市售木霉菌在热带棕榈灵芝培养过程中通过热带棕榈灵芝胁迫生长条件下筛选获得的，对热带棕榈灵芝具有显著的控制效果，该木霉菌与市售木霉菌相比，对热带棕榈灵芝显示控制效果突出，具有显著的进步。相比于市售普通木霉菌，该木霉菌对热带棕榈灵芝的拮抗更加出色，更有利于棕榈园中灵芝病害的防治。

将上述的木霉菌应用于防治棕榈灵芝病害，具有以下优势：

(1)本发明根据棕榈灵芝、木霉菌的生物学特性，利用木霉菌对于灵芝菌丝拮抗的特点，有效利用木霉的生化控制作用，对灵芝产生拮抗作用，降低棕榈的生产成本，提高经济效益；

(2)本发明所提供的木霉菌株，在生化拮抗方面更加出色，更加有利于棕榈园中灵芝病害的防治；

(3)对木霉进行培养条件的优化，明确最优培养条件，对扩大木霉对灵芝病害的生物防治至关重要。

附图说明

图1为保藏的热带棕榈灵芝菌种的碳源优化中的照片；

图2为保藏的热带灵棕榈芝菌种的氮源优化中的照片；

图3为保藏的热带棕榈灵芝菌种的pH优化时的照片；

图4为热带棕榈灵芝能否在过酸或过碱的条件下正常生长的照片；

图5为热带灵芝菌种菌丝在最适生长湿度下的照片。

具体实施方式

实施例1A

探究实验室保藏的热带棕榈灵芝菌种的最优碳源。

1.实验材料

菌种：热带灵芝菌种

材料：土豆、酵母浸粉、葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、琼脂。

2.实验步骤

基础培养基：每1L水：土豆200克、酵母浸粉5克、葡萄糖20克、琼脂21克。

配制基础培养基1500ml。

分别用等量的乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉替代基础培养基中的葡萄糖，配制其它碳源的培养基各150ml。

将培养基在121℃下灭菌30min。

不同碳源设4个重复平板，接入灵芝菌块。

在25℃下黑暗培养，每隔48小时划线观察菌丝生长状况。

3.实验现象

试验结果如图1所示。

不同碳源下菌种的菌落直径如下表1所示:

表1不同碳源下菌种的菌落直径比较表

碳源	第二天	第四天	第六天	生长状况
					葡萄糖	2.1	4.3	7.0	+++
麦芽糖	2.8	6.0	8.0	++
					果糖	2.5	5.4	7.5	+++
蔗糖	2.3	5.0	7.6	+
					乳糖	1.8	1.8	1.8	+
可溶性淀粉	1.9	4.1	6.5	++

菌丝较稀疏“+”菌丝稀疏“++”菌丝正常“+++”

4.实验结果与分析

由图表可知此在葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉中灵芝菌种的最优碳源为葡萄糖和果糖，尤其以果糖最优。

实施例1B

探究实验室保藏的热带棕榈灵芝菌种的最优氮源。

1.实验材料

菌种：热带灵芝菌种

材料：土豆、硝酸铵、柠檬酸铵、牛肉膏、蛋白胨、尿素、琼脂。

2.实验步骤

基础培养基：每1L水：土豆200克、蛋白胨5克、葡萄糖20克、琼脂21克。

分别用等量的硝酸铵、柠檬酸铵、牛肉膏、尿素替代基础培养基中的蛋白胨，配制其它氮源的培养基各150ml。

将培养基在121℃下灭菌30min。

不同氮源设4个重复平板，接入灵芝菌块。

在25℃下黑暗培养，每隔48小时划线观察菌丝生长状况。

3.实验现象

实验结果如图2所示

不同氮源下菌种的菌落直径如下表2所示。

表2不同氮源下菌种的菌落直径比较

氮源	第二天	第四天	第六天	生长状况
					蛋白胨	1.50	3.63	5.67	++
牛肉膏	1.50	3.50	6.18	+++
					硝酸铵	1.50	3.50	6.75	++
柠檬酸铵	1.50	3.50	6.58	+++
					尿素	1.50	1.50	1.50	-

菌丝较稀疏“+”菌丝稀疏“++”菌丝正常“+++”

4.实验结果与分析

实验现象表明，在硝酸铵、柠檬酸铵、牛肉膏、蛋白胨、尿素中此灵芝菌种的最有氮源为柠檬酸铵、硝酸铵。

实施例1C

探究此灵芝菌种的最适pH。

1.实验材料

菌种：热带灵芝菌种

材料：土豆、葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、琼脂。

2.实验步骤

基础培养：每1L水：土豆200克、葡萄糖20克、琼脂21克。

配制基础培养基900ml，分装与6个锥形瓶中，每个锥形瓶150ml。

使用盐酸与氢氧化钠将锥形瓶中的基础培养基的PH调节为5、6、 7、8、9、10。

将培养基在121℃下灭菌30min。

每个pH设置4个重复平板，接种灵芝菌块。

在25℃下黑暗培养，每隔48小时进行划线，观察菌丝生长状况。

3.实验现象

实验结果如附图3所示。

不同pH下菌种的菌落直径(cm)如下表3所示。

表3不同pH下菌种的菌落直径比较

pH	第二天	第四天	第六天	生长状况
					5	1.67	4.3	7.65	+++
6	1.55	4.45	7.55	++
					7	1.28	3.78	6.53	++
8	1.43	4.4	7.80	++
					9	1.2	4.55	7.93	++
10	1.3	4.35	7.83	++

菌丝较稀疏“+”菌丝稀疏“++”菌丝正常“+++”

4.实验结果与分析

此灵芝菌种在pH 5、6、7、8、9、10下都能萌发并生长。但其菌丝在pH＝5的培养基中生长速度快且生长状况较好。所以，实验结果得在pH5、6、7、8、9、10中灵芝菌种的最适pH为pH＝5和6，尤其以pH＝5最优。

实施例1D

探究热带棕榈灵芝能否在过酸或过碱的条件下正常生长。

由于过低pH的培养基中的琼脂不能溶解完全，因此采用木屑试管来测定热带灵芝试管能否在过酸或过碱的条件下正常生长。

1、材料

菌种：热带灵芝菌种

材料：木屑、麸皮、葡萄糖。

2、实验步骤、

培养料配方：木屑75％、麸皮24％、葡萄糖1％

①称取木屑30克、麸皮9.6克、葡萄糖0.4克，料水比1：1.4混合拌匀。

②用盐酸与氢氧化钠溶液将培养料的pH调至pH＝1。

③将调节好的培养料塞入18x180的试管中，培养料占试管的一半左右。

④重复以上步骤分别配制pH＝1、2、3、4、11、12、13、14的木屑试管。

⑤将配制好的木屑试管在121℃下灭菌2个小时。

⑥灭菌冷却后接入相同的灵芝菌种。

⑦在25℃下黑暗培养14天，每隔两天观察菌丝生长状况。

一、实验现象

实验结果如图4所示。

不同pH的灵芝菌丝生长状况如下表4所示。

表4不同pH的灵芝菌丝生长状况

pH	菌丝颜色	生长速度
			1	-	-
2	-	-
			3	++	+
4	+++	+++
			11	++	++
12	+	++
			13	+	++
14	+	+

菌丝不生长为“-”明显变黄为“+”轻微变黄为“++”不变黄为“+++”

3、实验结果与分析

此灵芝菌丝pH＝1、2的木屑试管培养基中不生长，说明pH＝1、2 不适合此灵芝菌丝的生长。其菌丝在除pH＝4的木屑试管培养基之外都有菌丝变黄的情况产生，所以在pH3、4、11、12、13、14中PH＝4 最适易灵芝菌丝生长。pH＝3、11、12、13、14均能抑制热带菌丝体的生长。其中pH＝12条件温和，且抑制效果明显。

实施例1E

探究热带灵芝菌种菌丝的最适生长湿度。

1.实验材料

菌种：热带灵芝菌种

材料：木屑、麸皮、葡萄糖。

2.实验步骤

基础培养料：木屑75％、麸皮23％、葡萄糖1％、石灰1％

称取木屑30克、麸皮9.2克、葡萄糖0.4克、石灰0.4克，以料水比1:1混合均匀。

将混合均匀地木屑培养料塞入20x200试管中，培养料约占试管长度的一半。

重复上述步骤，分别以水料比1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.9、1:2.4 (湿度50％、55％、60％、65％、70％)配制木屑试管。

将配制好的木屑试管在121℃下灭菌2个小时。

将灭完菌的木屑试管冷却至室温，接入相同大小的菌块。

在25℃下培养14天，每隔两天观察菌丝生长状况。

3.实验现象

实验结果如图5所示。

不同湿度的灵芝菌丝生长状况如下表5所示。

表5不同湿度的灵芝菌丝生长状况

菌丝较稀疏“+”菌丝稀疏“++”菌丝正常“+++”

4、实验结果与分析

由实验得灵芝菌丝生长的最适是湿度为50％～60％。

实施例1F

探究热带灵芝菌种菌丝的最适生长温度。

1、实验材料

菌种：热带灵芝菌种

材料：木屑、麸皮、葡萄糖。

2、实验步骤

基础培养料：木屑75％、麸皮23％、葡萄糖1％、石灰1％；

重复上述步骤，分别以水料比1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.9、1:2.4 (温度15℃、20℃、35℃、30℃、35℃)配制木屑试管。

将配制好的木屑试管在121℃下灭菌2个小时。

将灭完菌的木屑试管冷却至室温，接入相同大小的菌块。

在25℃下培养14天，每隔两天观察菌丝生长状况。

3、实验现象

表6不同温度和时间下菌丝生长状况

温度℃	第二天	第四天	第六天	第八天	第十天	第十二天	生长状况
								15	0.66	1.8	2.72	3.78	4.82	6.02	+++
20	0.78	1.96	2.96	3.94	5.04	6.12	+++
								25	0.9	2.22	3.38	4.64	6.06	7.02	+++
30	0.74	2.26	3.5	4.98	6.40	7.64	++
								35	0.9	2.3	3.9	5.10	6.95	8.30	++

菌丝较稀疏“+”菌丝稀疏“++”菌丝正常“+++”

4、实验结果与分析

由实验得灵芝菌丝生长的最适温度为23～25℃，尤其以25℃最优。

实施例2

热带棕榈灵芝的驯化方法，包括如下步骤:

(1)菌种选择选在25℃培养箱中菌丝雪白、生长旺盛、长势较好的此热带棕榈灵芝菌种。设置葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉这6个变量，每个变量4个平板重复。配制培养基，灭菌后，将优选出的灵芝菌种在无菌环境下接入不同碳源的平板中培养7天，观察菌丝的长势，做好记录和拍照；

(2)设置温度梯度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃每个梯度至少4个重复。配制相同的培养基，灭菌后，在无菌条件下接入此热带棕榈灵芝菌种，在不同温度下黑暗培养7天，做好结果的观察和记录；

(3)设置湿度梯度50％、55％、60％、65％、70％每个梯度5个重复。配制干料比相同的木屑试管培养基，调至不同的湿度。灭菌冷却后将此热带棕榈灵芝菌种接入木屑试管培养基中，培养14天，每两天观察结果记录生长状况；

(4)设置pH梯度5、6、7、8、9、10每个梯度4个重复。配制相同的培养基调节为上述梯度的pH，灭菌后，在无菌条件下接入此热带棕榈灵芝菌种，在不同温度下黑暗培养7天，做好结果的观察和记录；

(5)得到适合此热带棕榈灵芝生长的最适环境条件和抑制其生长的环境条件；

(6)得到其最适的环境条件，进行栽培实验。

实施例3

热带棕棕榈灵芝驯化方法，按照如下步骤进行：

1)选择外形良好，颜色鲜艳，未霉变的热带棕榈野生灵芝子实体，将其菌柄基部切断，取回用无菌水冲洗数遍，然后放进种接箱中用75％酒精浸泡4～7min，再用HgC1溶液处理12min后，用无菌水冲洗，在超净工作台用手术刀削去子实体皮壳，将其菌肉切成1cm³大小粒，经火焰消毒移接到母种培养基试管斜面上；

2)先将马铃薯洗净去皮，去除芽，再称取400克切成薄片，加水 1000ml煮沸20～30min，用5～8层纱布过滤，过滤液补足至1000ml，加入20克葡萄糖，3克磷酸二氢钾，1克七水硫酸镁，搅拌均匀，加热，最后再加50克琼脂，继续加热搅拌混匀，之后再配上20％的热带棕榈灵芝子实体煮出液的过滤液，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，100～ 115℃灭菌20min后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用，将接入野生灵芝的试管置于25℃恒温箱中培养，待菌丝成熟后挑选无污染，菌丝洁白粗壮，生长清晰的斜面，挑取菌丝前端部份进行扩管，作为热带棕榈灵芝母种；

3)将热带棕榈灵芝母种取出，接入原种培养基，其培养基配方为：杂木屑70～80份，麸皮10～15份，玉米粉，5～6份，菇耳壮， 0.5～0.8份，石膏粉2份，PH＝5，含水量50～60％，之后置25℃培养室内培养，培养时间35～40天，即得灵芝原种；

4)将灵芝原种接入栽培种培养基，其培养基配方为：杂木屑70～ 80份，麸皮10～15份，玉米粉，5～6份，菇耳壮，0.5～0.8份，石膏粉2份，PH＝5，含水量50～60％，之后置25℃培养室内培养，培养时间35～40天，可长满全瓶，选取菌丝洁白粗壮、生活力强的菌种作为热带棕榈灵芝栽培种。

实施例4

热带棕榈灵芝的人工栽培方法，按照如下步骤进行：

1)热带棕榈灵芝的驯化

选取热带棕榈灵芝作为种源，提取野生灵芝内的母体，经过对母体的驯化培育，将野生灵芝的原母体驯化培育成新的灵芝栽培种；

2)按照培养料配方拌料后装入菌袋中灭菌后，待冷却后放入接菌室中，培养料配方：玉米芯75％、木屑10％、麸皮10％、石灰5％，料水比1.3～1.4；

3)紫外照射同时打开臭氧40min，结束后打开超净台的通风装置，然后接种步骤1)得到的灵芝栽培种，总共接种800包；

4)接种后在黑暗条件下25℃培养，控制湿度50％，监控培养料，控制pH在5±0.2(即条件实施例1A～1F中获得的最适生长条件)；

5)待灵芝菌丝生长满菌袋后进行出菇。

比较例1

比较木霉菌CGMCC NO.17669和市售木霉菌相比对热带棕榈灵芝的抑制效果。

一、1、材料

菌种：热带灵芝菌种、木霉菌CGMCC NO.17669和市售木霉菌材料：木屑、麸皮、葡萄糖。

2、实验步骤

培养料配方：木屑75％、麸皮24％、葡萄糖1％

(1)称取木屑30克、麸皮9.6克、葡萄糖0.4克，料水比1：1.4 混合拌匀；

(2)用盐酸与氢氧化钠溶液将培养料的pH调至pH＝5；

(3)将调节好的培养料塞入18×180的试管中，培养料占试管的一半左右；

(4)将配制好的木屑试管在121℃下灭菌2个小时；

(5)灭菌冷却后接入相同的灵芝菌种；

(6)在25℃下黑暗培养10天，每隔两天观察菌丝生长状况；

(7)采用常规提取方法制备木霉菌提取液，喷洒木霉菌CGMCC NO.17669提取液和市售木霉菌提取液于热带棕榈灵芝菌丝体上，观察4天后的生长情况。

实验现象

实验结果如图4所示。

不同pH的灵芝菌丝生长状况如下表7所示。

表7本发明的木霉菌与市售木霉菌的菌丝颜色及生长速度比较

3、实验结果与分析

此灵芝菌丝在的NO.17669木霉菌的木屑试管培养基中不生长，说明NO.17669木霉菌对热带棕榈灵芝具有抑制效果，且抑制效果显著。

实施例5

以定陶灵芝为例，其检测项目及结果如下：

检测方法：常规的氨基酸检测方法；

表8不同灵芝中氨基酸含量检测结果

表9其它营养成分含量检测结果

(以上表格中的棕榈灵芝为采用实施例4中的方法所获得的灵芝)

表8、9中，是关于定陶灵芝、林下灵芝和棕榈灵芝这三种灵芝作为检测对象所进行的相关营养成分及活性成分含量的检测，从上述的检测中可以看出，定陶灵芝是常规的栽培灵芝，其中的天冬氨酸含量为1295.42mg/kg；谷氨酸的含量仅1829.48mg/kg；胱氨酸含量为 3737.08mg/kg，脯氨酸6792.43mg/kg；苯丙氨酸767.00mg/kg；粗多糖0.48mg/kg；Se未检出；

以仿野生林下灵芝为检测对象，检测结果如下：天冬氨酸含量为 1765.54mg/kg；谷氨酸的含量仅1921.97mg/kg；胱氨酸含量为 3810.27mg/kg，脯氨酸6941.67mg/kg；苯丙氨酸1138.83mg/kg；粗多糖0.35g/100g；Se为4.39mg/kg；

本发明中的棕榈灵芝，天冬氨酸含量为2247.42mg/kg；谷氨酸的含量仅3454.59mg/kg；胱氨酸含量为6433.16mg/kg，脯氨酸 12867.98mg/kg；苯丙氨酸1552.50mg/kg；粗多糖1.36g/100g；Se 8.75 mg/kg。

以上的检测结果表明，本发明中的棕榈灵芝，无论是天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的含量均要远远高于定陶灵芝和林下灵芝；从粗多糖以及微量元素方面的比较来看，本发明中的棕榈灵芝的粗多糖以及微量元素含量也远远高于定陶灵芝和林下灵芝。这说明本发明的棕榈灵芝经过本发明特定的人工栽培方法，其活性成分显著的高于普通的灵芝品种。

Claims

1.一种控制棕榈树上热带棕榈灵芝生长的木霉菌，其特征在于：所述木霉菌为拮抗棕榈灵芝的木霉菌，该木霉菌于2019年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.17669。