CN115024159A - 一种筛选灵芝耐热品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种筛选灵芝耐热品种的方法，将灵芝进行微波或紫外线处理后，进行35～50℃的温度处理；其中，微波处理的频率为2000～3000Mhz，时间为10～100秒；紫外线处理的波长为200～300nm，时间为10～100分钟。本申请首次研究微波和紫外线处理对菌丝生长的影响，选育出耐热灵芝品种。本申请的试验说明微波和紫外线对诱导灵芝的耐热性具有一定的作用。在分子水平，只有海南灵芝和四川灵芝与对照有差异，在分子水平和温度水平都有差异的灵芝品种中，诱导的海南灵芝菌丝停止生长温度为43℃，诱导的四川灵芝温度为41℃，因此，诱导的海南灵芝菌丝耐热效果最好。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选灵芝耐热品种的方法，属于耐热品种筛选的领域。
背景技术
灵芝为担子菌类多孔菌科灵芝属植物灵芝或紫芝的子实体；别名赤芝、红芝、灵芝草。我国已知野生灵芝分4属，3亚属，103种，其中海南灵芝分布的种类有72种，约占全国灵芝总种数的70％。现知海南岛灵芝有76种，有药用价值的灵芝达15种，其中11种已被我国利用并报道，4种为民间利用。关于灵芝的遗传性和活性成分，遗传多样性是生物多样性的基础，是生物体所携带的遗传信息的总和。到目前为止仅对部分灵芝的多样性进行过研究。目前，国内外学者已经对药用灵芝中活性成分进行不同的研究：灵芝活性蛋白、灵芝多糖、灵芝三萜和灵芝酸。但对灵芝品种的选育和改良研究研究的较少。灵芝菌丝生长的温度范围为25-35℃，最适温度为24-28℃，超过36℃，菌丝停止生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选灵芝耐热品种的方法，通过将灵芝进行微波或紫外线及温度处理，诱导灵芝的耐热性。
根据本申请的一个方面，1、筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，将灵芝进行微波或紫外线处理后，进行35～50℃的温度处理；
其中，微波处理的频率为2000～3000Mhz，时间为10～100秒；紫外线处理的波长为200～300nm，时间为10～100分钟。
在一些具体实施方案中，微波处理的频率为2450Mhz，时间为40～70秒；紫外线处理的波长为253.7nm，时间为60～90分钟。
在一些具体实施方案中，所述灵芝选自海南灵芝、四川灵芝、台湾灵芝和灵芝中的至少一种。
在一些具体实施方案中，将所述灵芝的菌丝进行微波或紫外线处理。
在一些具体实施方案中，将灵芝进行紫外线处理后，放在常温下培养12～36小时，然后进行35～50℃的温度处理。
在一些具体实施方案中，将灵芝进行微波或紫外线及温度处理后，确定灵芝菌丝停止生长的温度。
在一些具体实施方案中，该方法还包括将灵芝进行分子鉴定的步骤。
在优选实施方案中，将灵芝进行PCR分子鉴定。
本发明的有益效果为：
本申请首次研究微波和紫外线处理对菌丝生长的影响，选育出耐热灵芝品种。本申请的试验说明微波和紫外线对诱导灵芝的耐热性具有一定的作用。在分子水平，只有海南灵芝和四川灵芝与对照有差异，在分子水平和温度水平都有差异的灵芝品种中，诱导的海南灵芝菌丝停止生长温度为43℃，诱导的四川灵芝温度为41℃，因此，诱导的海南灵芝菌丝耐热效果最好。
附图说明
图1为耐热灵芝品种PCR分子鉴定结果，其中1为marke、2为台湾灵芝诱变，3为台湾灵芝对照，4为海南灵芝诱变，5为海南灵芝对照，6为四川灵芝诱变，7为四川灵芝对照，8为灵芝诱变，9为灵芝对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1微波和温度共同作用对灵芝生长速度的影响
将海南灵芝(Ganoderma hainanense J.D.Zhao.L.W.H su et X.Q.Zhang)、台湾灵芝(Ganoderma hainanense Chang et Chen)、四川灵芝(Ganoderma hainanenseJ.D.Zhao et X.Q.Zhang)、灵芝(Ganoderma hainanense(Ccrtis:Fr.)P.Karst.)4种灵芝菌种接种到带有PDA培养基的培养皿(直径8cm)中，25℃培养24小时，分别进行微波处理，微波处理的频率为2450Mhz，波长为122mm；微波分别处理0、30、40、50、60、70秒后，然后分别在39℃、40℃、41℃、42℃、43℃和44℃下进行温度培养，在上述温度培养到第8天时，测量菌丝生长速度，每个处理3个重复，分析微波对灵芝菌丝生长速度和诱导耐热品种的影响。
微波和温度共同作用对海南灵芝生长速度的影响见表1。在39℃的条件下，处理30和40秒之间、50和60秒之间无显著性差异，其他处理之间均存在显著性差异，处理60秒的菌丝停止生长温度为44℃，而对照和其他处理均为43℃，微波处理60秒效果最佳，微波处理70秒时菌丝全部死亡。对照菌丝(微波处理时间0S)停止生长温度为43℃，根据拟合方程y＝-0.0975x+4.19的结果为42.97℃。
表1微波和温度对海南灵芝生长速度的影响
微波和温度共同作用对台湾灵芝生长速度的影响见表2。在39℃的条件下，处理时间为0和30秒之间无存在显著性差异，但无极显著差异，其他处理之间均存在显著性差异。随着微波处理时间的延长和温度的升高菌丝生长速度呈下降趋势，微波处理40秒的菌丝停止温度为43℃，其他所有组合处理的均为42℃，微波处理40秒的效果最佳，能显著提高菌丝的耐热性；微波处理60秒时菌丝所有处理菌丝全部死亡，可能是随着微波炉处理时间的延长，温度越来越高的原因。对照菌丝停止生长温度为42℃，根据拟合方程y＝-0.1325x+5.4893的结果为41.43℃。
表1微波和温度对台湾灵芝生长速度的影响
四川灵芝和灵芝微波处理和对照菌丝停止生长温度均为40℃，对此2个品种，微波处理对菌丝停止生长的温度无影响(数据没有列出)。但在微波作用下台湾灵芝和海南灵芝的耐热性显著提高，说明微波对灵芝耐热性具有一定的诱导性。
实施例2紫外线和温度组合对灵芝生长速度的影响
将海南灵芝(Ganoderma hainanense J.D.Zhao.L.W.H su et X.Q.Zhang)、台湾灵芝(Ganoderma hainanense Chang et Chen)、四川灵芝(Ganoderma hainanenseJ.D.Zhao et X.Q.Zhang)、灵芝(Ganoderma hainanense(Ccrtis:Fr.)P.Karst.)4种灵芝菌种接种到带有PDA培养基的培养皿(直径8cm)中，25℃培养24小时，分别进行紫外线处理(超净工作台中的紫外线灯管单只为UVB-313，波长280nm，辐照强度0.68W/m2；培养皿放置在灯管正下方，灯管与培养皿的距离为47cm)处理0、30、45、60、75、90分钟，然后分别在38℃、39℃、40℃和41℃下进行温度培养，在上述温度培养至第8天时，测量菌丝生长速度(cm/d)，每个处理3个重复；分析紫外线对灵芝菌丝生长速度和诱导耐热品种的影响。
紫外线和温度组合对四川南灵芝生长速度的影响(见表3)。紫外线处理60分钟，菌丝停止生长速度的温度为41℃，比其他所有处理的40℃高出1℃。随着紫外线处理时间的延长和温度的提高，菌丝生长速度均呈下降趋势，紫外线处理60分钟效果最好，菌丝停止生长的温度最高，可能分钟结构发生变化。紫外线处理4小时，菌丝常温培养还没有死亡现象。对照菌丝(紫外线处理0min)，停止生长温度为40℃，根据拟合方程y＝-0.156x+6.177的结果为39.59℃。
表3紫外线和温度对四川灵芝生长速度的影响
紫外线和温度组合对灵芝生长速度的影响(见表4)。随着紫外线处理时间的延长，菌丝的生长速度逐渐减慢，随着温度的升高，生长速度逐渐降低，紫外线处理60分钟的菌丝停止生长温度为41℃，而其他所有处理均为40℃，因此，紫外线处理60分钟效果最好。对照菌丝停止生长温度为40℃，根据拟合方程y＝-0.156x+6.1533的结果为39.44℃。
表4紫外线和温度对灵芝生长速度的影响
紫外线处理后台湾灵芝对照和处理的菌丝停止生长温度相同，均为42℃，而海南灵芝均为43℃，可能紫外线照射对这2个品种提高耐热效果不显著。
实施例3耐热灵芝品种分子鉴定
通过微波处理，诱导出台湾灵芝和海南灵芝两个耐热品种；通过紫外线处理，诱导出四川灵芝和灵芝两个耐热品种。
将上述四个耐热品种进行DNA的提取:按照试剂盒提取DNA的方法，取适量菌丝于2ml离心管中，并加入钢珠压在样品上方，然后加入400ul缓冲液和6ul的RNaseA(10mg/ml)，漩涡震荡1min，室温放置10min；加入130ul缓冲液FP，充分混匀，漩涡震荡1min；3.12000rpm离心5min，将上清液转移至新的离心管中；重复第3步一次；取500ul的上清液，加入0.7体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组dna，12000rpm离心2min，弃上清，保留沉淀；加入600ul70％的乙醇，漩涡震荡5sec，12000rmp离心2min，弃上清；7.重复第5步一次；开盖倒置，室温5-10min彻底晾干乙醇；加入适量洗脱缓冲液TE，65°水浴10-60min溶解DNA，其间数次颠倒助溶，最终得到DNA溶液。
引物：全长基因PCR扩增所用的特异引物根据基因两端的序列设计，5'端引物为028-1F:5'-TCTTCACGTGCTGCCACCAA-3',3'端引物为028-1R:5'-TTTTTTTTTTAAAAGGCCCA-3'。
以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
PCR扩增：以上述提取的DNA为模板,用基因两端特异引物028-1F和028-1R进行PCR扩增,退火温度52℃。PCR结束后，在135V的电压下进行30min的凝胶电泳以确定扩增条带。统计分析采用stst和excel软件。
PCR结果如图1，结果显示：台湾灵芝对照和处理均为3个条带，无差异；海南灵芝对照1个条带，而处理的3个条带，多出2条；四川灵芝对照无条带，而处理的3个条带，多出3条；灵芝对照和处理的均为3个条带，无差异。因此，诱导的耐热品种台湾灵芝和灵芝与对照在分子结构上相同，无差异；而海南灵芝比对照多出2条，四川灵芝比对照多出3条，诱导的和对照在分子水平上存在差异。诱导的海南灵芝菌丝停止生长温度为43℃，诱导的四川灵芝温度为41℃，因此，诱导的海南灵芝菌丝耐热效果最好。
台湾灵芝、海南灵芝、四川灵芝和灵芝菌丝生长停止温度分别为42、43、40、40℃，微波诱导后台湾灵芝、海南灵芝分别为43、44℃，紫外线诱导后四川灵芝和灵芝分别为41、41℃，这说明微波和紫外线对诱导灵芝的耐热性具有一定的作用。在分子水平，只有海南灵芝和四川灵芝与对照有差异，在分子水平和温度水平都有差异的灵芝品种中，诱导的海南灵芝菌丝停止生长温度为43℃，诱导的四川灵芝温度为41℃，因此，诱导的海南灵芝菌丝耐热效果最好。
以上对本发明所提供的一种诱导灵芝耐热品种的方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，将灵芝进行微波或紫外线处理后，进行35～50℃的温度处理；
其中，微波处理的频率为2000～3000Mhz，时间为10～100秒；紫外线处理的波长为200～300nm，时间为10～100分钟。
2.根据权利要求1所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，微波处理的频率为2450Mhz，时间为40～70秒；紫外线处理的波长为253.7nm，时间为60～90分钟。
3.根据权利要求1所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，所述灵芝选自海南灵芝、四川灵芝、台湾灵芝和灵芝中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，将所述灵芝的菌丝进行微波或紫外线处理。
5.根据权利要求1所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，将灵芝进行紫外线处理后，放在常温下培养12～36小时，然后进行35～50℃的温度处理。
6.根据权利要求1所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，将灵芝进行微波或紫外线及温度处理后，确定灵芝菌丝停止生长的温度。
7.根据权利要求1所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，该方法还包括将灵芝进行分子鉴定的步骤。
8.根据权利要求7所述的筛选灵芝耐热品种的方法，其特征在于，将灵芝进行PCR分子鉴定。
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