CN110195123B - 基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用。该引物对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.60是基于苦蘵叶绿体基因组序列开发获得的，在叶绿体基因组测序的基础上，对大量序列信息进行分析，进而开展cpSSR位点筛选和cpSSR标记引物设计。本专利克服了传统SSR标记开发效率低、周期长、费用高的问题，同时填补了苦蘵目前cpSSR标记信息的空白。通过cpSSR引物的筛选与遗传多样性分析，评价了cpSSR标记引物的多态性和适用性。本专利提供的cpSSR多态性标记引物为苦蘵的遗传多样性评价、种质鉴定、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用。
背景技术
苦蘵(Physalis angulata L.)，为茄科(Solanaceae)酸浆属(Physalis)一年生草本植物，别名炮仔灯、灯笼草、天泡子、天泡草、小酸浆、朴朴草等，分布于世界热带与亚热带地区，常生于海拔500～1500米。在我国主要分布于华东、华中、华南及西南等地。作为传统中药材，蘵以果、根或全草入药，具有清热解毒，利咽化痰，利尿通淋之功效，用于治疗肝炎、哮喘、疟疾、风湿、癌症等疾病。现代医学研究发现苦蘵中的酸浆苦素类(Physalin)和睡茄内酯类(Physagulin)化合物具有很强的醌还原酶诱导、抗炎、免疫调节或抗肿瘤活性。另外，苦蘵果实中的多糖对超氧阴离子自由基和二苯代苦味自由基起抗氧化作用，苦蘵提取液具有抗菌消炎、降血糖、降血脂等疗效。此外，苦蘵果实还被誉为高档的“本草水果”，可以做罐头、蜜饯和沙拉酱汁，不但风味独特，而且具有提高人体肌体免疫力、美容养颜、预防心脑血管病、延缓衰老等效果。由此可见，苦蘵是新型“药食两用”植物资源，具有很高的研究价值和广阔的开发前景。
微卫星分子标记(Microsatellite marker)是根据简单重复序列(simplesequence repeats,SSRs)开发的分子标记，根据简单重复序列两侧的保守序列设计引物，通过检测重复数目的差异反映等位基因间的多态性，该标记类型广泛分布于真核生物的核基因组和细胞器基因组中的不同位置。目前，SSR分子标记被认为是最理想的分子标记之一，在生物的种质鉴定、遗传多样性评价和亲缘关系分析研究中已经有了广泛应用。高等植物叶绿体微卫星(chloroplast microsatellite,cpSSR)是SSR标记的一种，广泛分布于植物叶绿体基因组中，是以单核苷酸A或T为主要重复单元组成的多核苷酸重复串联序列。cpSSR不但具有和基因组SSR标记的共显性、多态性高、等位点多等优点，同时还具备叶绿体基因组的进化速度慢、分子量小、相对保守、结构简单和单亲遗传等特点。迄今为止，尚未有关于苦蘵cpSSR标记开发及应用的研究报道。本发明以通过高通量测序技术获得的苦蘵叶绿体基因组序列信息，开发获得一批苦蘵cpSSR标记引物，将为苦蘵的遗传多样性分析、种质资源鉴定、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究起到重要的推动作用。
发明内容
本发明的目的是针对目前缺乏苦蘵cpSSR标记引物的不足，提取基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
基于叶绿体基因组序列开发获得苦蘵多态性cpSSR标记引物，包括30对引物，其引物核苷酸序列如下所示：
cpSSR2正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
cpSSR2反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
cpSSR4正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；
cpSSR4反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
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cpSSR38正向引物如序列表中SEQ ID NO.35所示；
cpSSR38反向引物如序列表中SEQ ID NO.36所示；
cpSSR39正向引物如序列表中SEQ ID NO.37所示；
cpSSR39反向引物如序列表中SEQ ID NO.38所示；
cpSSR41正向引物如序列表中SEQ ID NO.39所示；
cpSSR41反向引物如序列表中SEQ ID NO.40所示；
cpSSR42正向引物如序列表中SEQ ID NO.41所示；
cpSSR42反向引物如序列表中SEQ ID NO.42所示；
cpSSR44正向引物如序列表中SEQ ID NO.43所示；
cpSSR44反向引物如序列表中SEQ ID NO.44所示；
cpSSR45正向引物如序列表中SEQ ID NO.45所示；
cpSSR45反向引物如序列表中SEQ ID NO.46所示；
cpSSR46正向引物如序列表中SEQ ID NO.47所示；
cpSSR46反向引物如序列表中SEQ ID NO.48所示；
cpSSR47正向引物如序列表中SEQ ID NO.49所示；
cpSSR47反向引物如序列表中SEQ ID NO.50所示；
cpSSR48正向引物如序列表中SEQ ID NO.51所示；
cpSSR48反向引物如序列表中SEQ ID NO.52所示；
cpSSR49正向引物如序列表中SEQ ID NO.53所示；
cpSSR49反向引物如序列表中SEQ ID NO.54所示；
cpSSR50正向引物如序列表中SEQ ID NO.55所示；
cpSSR50反向引物如序列表中SEQ ID NO.56所示；
cpSSR51正向引物如序列表中SEQ ID NO.57所示；
cpSSR51反向引物如序列表中SEQ ID NO.58所示；
cpSSR53正向引物如序列表中SEQ ID NO.59所示；
cpSSR53反向引物如序列表中SEQ ID NO.60所示；
上述cpSSR引物对是通过高通量测序技术获得的苦蘵叶绿体基因组序列信息进而获得的，具体包括以下步骤：
(1)叶绿体基因组序列的获得
剪取100mg的苦蘵活体样品新鲜叶片，利用液氮快速研磨至粉末状，将粉末快速转移至1.5mL离心管中，采取CTAB方法进行基因组总DNA提取。利用1.0％的琼脂糖凝胶对样品总DNA进行完整性电泳检测，并利用紫外分光光度计进行浓度检测。
采取长PCR扩增(Long-range PCR amplification)技术对提取的样品总DNA进行扩增。将扩增产物混合至总DNA浓度为～6μg/L。利用物理方法打断DNA片段，依据Illumina的技术指南，构建Illumina测序文库，建库片段大小为500bp。然后在Illumina Miseq测序平台进行上样测序，测序策略为两端测序(Paired-end sequencing)，测序长度为250bp。
利用NGSQCToolkit v2.3.3软件(www.nipgr.res.in/ngsqctoolkit.html)对测序原始数据进行质量过滤，过滤掉测序质量较低的序列(PHRED quality score<30)；利用CLCgenomics workbench 8(CLC Bio,Aarhus,Denmark)软件对filtered reads进行从头拼接(de novo assembly)，进而获得一系列的contigs。拼接时，hash length设置为63，用于组装的最小conting长度为1000bp，其余参数取默认值。运用SOAPdenovo软件(http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)对clean reads进行拼接，K-mer长度设置范围63～75。以灯笼果(P.peruviana)叶绿体基因组(GenBank登录号：NC_026570)为参考序列，通过在线BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。然后，通过Geneious 4.83软件选取与参考序列比对上的contigs进行完整叶绿体基因组的组装。
(2)cpSSR位点鉴别及cpSSR引物设计
利用MISA perl脚本软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索苦蘵叶绿体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列(mononucleotide)，重复单元≥10；二核苷酸重复序列(dinucleotides)，重复单元≥5；三核苷酸重复序列(trinucleotides)，重复单元≥4；四(tetranucleotide)、五(pentanucleotide)、六(hexanucleotide)核苷酸重复序列，重复单元≥3。
利用Primer Premier 5软件进行cpSSR引物设计，同时结合人工手动调整。引物设计参数原则：引物长度为18～26个碱基，退火温度为50℃～60℃，扩增产物大小尽可能集中在100～300bp左右。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司生工合成。
本发明的另一个目的是利用上述cpSSR标记引物在苦蘵及近缘种种质资源遗传多样性、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。
为了评价开发的cpSSR引物在苦蘵种质资源群体中的多态性和适用性，同时为了客观、准确的评价苦蘵居群的遗传多样性，本发明利用开发的cpSSR引物对16个苦蘵自然居群的203个样品进行遗传多样性分析。具体步骤如下：
步骤一、基因组DNA提取
采取CTAB方法对苦蘵种质资源的基因组DNA进行提取。
步骤二、cpSSR-PCR反应
cpSSR-PCR体系：总反应体积为10μL，具体包括1μL的10×Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL的dNTPs(10mmol/L)，cpSSR引物上、下游引物各1μL，0.5μL的Taq酶(2U/μL),1μL模板DNA(50ng/μL)，4.7μL的ddH2O。扩增产物在Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应。
cpSSR-PCR程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50min；不同引物Tm值复性50s；72℃延伸1.5min)；最后72℃延伸10min。
步骤三、电泳检测
采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(PAGE)对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳1.5～2.0小时，并且对电泳结果进行拍照记录。
步骤四、数据分析
利用Quantity one软件及人工辅助判读的方法进行电泳图拷带。为了保证结果的准确性，每对引物需进行二次重复PCR扩增和电泳检测，并只统计清晰度高、稳定性好的电泳位点。同一位点有条带记作“l”，无条带记作“0”。利用NTSYS-pc 2.10e软件构建种群间的非加权组算术平均数法(UPGMA)聚类图。
有益效果主要体现为：
(1)利用高通量测序技术，获得了苦蘵叶绿体全基因组序列，极大的增加了引物开发所用的原始数据。
(2)利用开发的cpSSR标记引物分析评价了苦蘵种质资源群体间的多态性。
(3)cpSSR标记不但具有细胞核基因组SSR标记的共显性、高度变异和多态性等特点，还具有叶绿体基因组DNA的单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，另外cpSSR标记具有结构简单、多拷贝及分子量小等特点。因此，丰富了苦蘵SSR分子标记的类型，拓宽了苦蘵分子标记辅助育种的思路和技术选择手段。
(4)cpSSR标记主要分布于叶绿体基因组的非编码区，而叶绿体DNA的非编码区序列在种群间也存在遗传变异，使得该苦蘵cpSSR的多态性引物能够全面的反映苦蘵的遗传信息，可用于苦蘵的种质资源遗传多样性分析、品种鉴定等相关研究。
综上，本发明克服了传统SSR标记开发效率低、周期长、费用高的问题，同时填补了苦蘵目前cpSSR标记信息的空白。通过cpSSR引物的筛选与遗传多样性分析，评价了cpSSR标记引物的多态性和适用性。本发明提供的cpSSR多态性标记引物为苦蘵的遗传多样性评价、种质鉴定、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究奠定了基础。
附图说明
图1为引物cpSSR26对16个苦蘵居群的203样品的PCR扩增后的电泳结果。通道M：20bp DNA ladder标准分子量；通道1～10：HZ居群；通道11～24：XS居群；通道25～37：LA居群；通道38～43：DQ居群；通道44～55：YW居群；通道56～69：PJ居群；通道70～79：NH居群；通道80～91：LH居群；通道92～106：TZ居群；通道107～118：WZ居群；通道119～132：NJZ居群；通道133～144：NJX居群；通道145～158：JJ居群；通道159～173：HG居群；通道174～187：XJ居群；通道188～203：YN居群。
图2为引物cpSSR49对16个苦蘵居群的203样品的PCR扩增后的电泳结果。通道M：20bp DNA ladder标准分子量；通道1～10：HZ居群；通道11～24：XS居群；通道25～37：LA居群；通道38～43：DQ居群；通道44～55：YW居群；通道56～69：PJ居群；通道70～79：NH居群；通道80～91：LH居群；通道92～106：TZ居群；通道107～118：WZ居群；通道119～132：NJZ居群；通道133～144：NJX居群；通道145～158：JJ居群；通道159～173：HG居群；通道174～187：XJ居群；通道188～203：YN居群。
图3为利用30对cpSSR引物构建的16个苦蘵居群UPGMA聚类图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1苦蘵叶绿体基因组序列的获得
(1)基因组总DNA提取。剪取100mg的苦蘵活体样品新鲜叶片，利用液氮快速研磨至粉末状，将粉末快速转移至1.5mL离心管中，采取CTAB方法进行基因组总DNA提取。利用1.0％的琼脂糖凝胶对样品总DNA进行完整性电泳检测，并利用紫外分光光度计进行浓度检测。
(2)Long PCR扩增。采取长PCR扩增(Long-range PCR amplification)技术对提取的样品总DNA进行扩增。将扩增产物混合至总DNA浓度为～6μg/L。利用物理方法打断DNA片段，依据Illumina的技术指南，构建Illumina测序文库，建库片段大小为500bp。然后在Illumina Miseq测序平台进行上样测序，测序策略为两端测序(Paired-end sequencing)，测序长度为250bp。
(3)高通量测序的建库和测序。利用NGSQCToolkit v2.3.3软件(www.nipgr.res.in/ngsqctoolkit.html)对测序原始数据进行质量过滤，过滤掉测序质量较低的序列(PHRED quality score<30)；利用CLC genomics workbench 8(CLC Bio,Aarhus,Denmark)软件对filtered reads进行从头拼接(de novo assembly)，进而获得一系列的contigs。拼接时，hash length设置为63，用于组装的最小conting长度为1000bp，其余参数取默认值。
(4)叶绿体基因组的组装、拼接。运用SOAPdenovo软件(http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)对clean reads进行拼接，K-mer长度设置范围63–75。以灯笼果(P.peruviana)叶绿体基因组(GenBank登录号：NC_026570)为参考序列，通过在线BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。然后，通过Geneious 4.83软件选取与参考序列比对上的contigs进行完整叶绿体基因组的组装。
实施例2 cpSSR位点鉴别及cpSSR引物设计
(1)cpSSR位点筛选
利用MISA perl脚本软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索苦蘵叶绿体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列(mononucleotide)，重复单元≥10；二核苷酸重复序列(dinucleotides)，重复单元≥5；三核苷酸重复序列(trinucleotides)，重复单元≥4；四(tetranucleotide)、五(pentanucleotide)、六(hexanucleotide)核苷酸重复序列，重复单元≥3。
通过cpSSR位点筛选，从该基因组序列中共检测到57个SSR位点(见表1)，其中单碱基重复有39个(A碱基14个，C碱基1个，T碱基24个)；双碱基重复有6个(AT重复3个，TA重复3个)；三碱基重复有5个，四碱基重复有7个。A和T重复数量约占总SSR位点数的66.67％，这说明苦蘵叶绿体基因组中的SSR主要以A和T的单碱基重复为主。
表1苦蘵cpSSR位点信息统计
(2)cpSSR引物设计
利用Primer Premier 5软件进行cpSSR引物设计，同时结合人工手动调整。引物设计参数原则：引物长度为18～26个碱基，退火温度为55℃±5℃，扩增产物大小尽可能集中在100～300bp左右。根据cpSSR位点，共设计54对cpSSR引物。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司生工合成。通过对54对cpSSR引物筛选，可在苦蘵群体中扩增出稳定性好、多态性高、清晰度的电泳条带的cpSSR引物共有30对。
实施例3苦蘵cpSSR标记引物筛选与遗传多样性分析
为了评价开发的cpSSR引物在苦蘵种质资源群体中的多态性和适用性，同时为了客观、准确的评价苦蘵居群的遗传多样性，本研究利用开发的cpSSR引物对16个苦蘵自然居群进行遗传多样性分析。
(1)基因组DNA提取
采取CTAB方法对16个苦蘵居群的203份种质资源的基因组DNA进行提取。具体的苦蘵样本信息见表2。
表2苦蘵16个居群材料的样本数量和采集地点信息
(2)cpSSR-PCR扩增
cpSSR-PCR体系：总反应体积为10μL，具体包括1μL的10×Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL的dNTPs(10mmol/L)，上、下游引物各1μL，0.5μL的Taq酶(2U/μL),1μL模板DNA(50ng/μL)，4.7μL的ddH2O。扩增产物在Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应。
cpSSR-PCR程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50min；不同引物Tm值复性50s；72℃延伸1.5min)；最后72℃延伸10min。
(3)电泳检测
采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(PAGE)对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳1.5～2.0小时，并且对电泳结果进行拍照记录。
(4)数据分析
利用Quantity one软件及人工辅助判读的方法进行电泳图拷带。为了保证结果的准确性，每对引物需进行二次重复PCR扩增和电泳检测，并只统计清晰度高、稳定性好的电泳位点。同一位点有条带记作“l”，无条带记作“0”。利用NTSYS-pc 2.10e软件构建种群间的非加权组算术平均数法(UPGMA)聚类图。
通过对54对cpSSR引物筛选，可在苦蘵群体中扩增出稳定性好、多态性高、清晰度高的电泳条带的cpSSR引物共有30对(表3)，如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.60所示的苦蘵cpSSR标记的多态性引物。引物扩增电泳条带数量2～12条(表4)，平均每对引物扩增条带5.2条。实际扩增产物长度范围在100～300bp之间。30条cpSSR引物共扩增出156个位点，其中多态性位点数量为132个，多态性位点所占比例为84.62％，平均每对引物多态性位点4.4个。cpSSR多态性位点比例处于25.0％～100.0％之间，平均多态性百分比为81.29％。其中，引物cpSSR26和cpSSR49的电泳检测图如图1、图2所示。
表3苦蘵cpSSR标记的多态性引物信息
表4 30条cpSSR引物遗传多态性统计
cpSSR在种内或种群间存在较好的遗传变异，其结构简单、多拷贝及分子量小，不但有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，还具有叶绿体基因组DNA的单亲遗传模式、且不易发生重组的特点。因此，本发明提供的苦蘵cpSSR标记的多态性引物能够全面的反映苦蘵的遗传信息，可用于苦蘵的种质资源遗传多样性分析、品种鉴定等相关研究。
利用30对多态性cpSSR引物对16个苦蘵居群资源进行聚类分析，UPGMA聚类结果显示(如图3所示)，16个苦蘵居群可以分为4组：HZ、LA、LH、TZ、DQ和YW居群聚为第I组，NJX、XJ、HG、YN居群聚类为第II组，JJ单独聚类为第III组，XS、PJ、NH、WZ、NJZ居群则远离其他苦蘵居群，且相互聚类为第IV组。研究表明本发明开发的cpSSR标记具有较好的多态性，并且具有很好的适用性，可以用于苦蘵种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建、重要基因QTL定位及克隆、以及分子辅助育种等研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用
<130> 1
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
cgtagaaaga cgaaagtgga tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
aaactcttcg ctattgggta aa 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
atagataaat acaccaaaca acaaa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
gatagaagtt aatcagtaat gggaa 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 5
tcaacaatga tccactagac act 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 6
ttttcccctc aaatatgaat act 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 7
aggttcttta aattccgtgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 8
tcctttttca aatcctgctg 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 9
tgatcgtgac cttgaacctg tt 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 10
tccctctctc tccttttttg ct 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 11
tttttcctat tttgacttct atg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 12
atctgtcatt acgtgcgact atc 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 13
acaaggaatg aaaagaaaaa aga 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 14
aataatagat agtaaatggg tcg 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 15
gggatgaatt ggataaatat acag 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 16
tagatgattg ataatgttcc tttg 24
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 17
gaataaaaaa aagaataggg aa 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 18
tagaattgtg ataaatcgaa a 21
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 19
ttctcctgtt tctcttgttt tttt 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 20
ctcttctatt tgattacttg ttct 24
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 21
ctttgcgttt ttctttcttt t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 22
acccaatttt tattttttac c 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 23
gagtttttga ctttcattat tttg 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 24
ttttcttccc cgcatttatc 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 25
aaaagaaaaa gaaatccatt tt 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 26
gttgggttca tccctgtagt aa 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 27
ctctacaaga aaattgaccc cc 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 28
tgctgaatca cagacaaaaa aa 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 29
gataaagtcg gttgattagg gt 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 30
attgaaaaat cgaagaaaag cc 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 31
cccattacca tttctttttg t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 32
tgaagtatcc aggctccgtt t 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 33
tttgttttgt aatggatagt tgc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 34
tttttgttat tgggataggt gaa 23
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 35
tctttgtttt gtaatggata gttg 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 36
gtttttttgt tattgggata ggtg 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 37
ttggctgtta ttcaaaaggt c 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 38
acaatcaaca tacggttcct t 21
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 39
ttcttattta atggttaggt ccg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 40
aaagcatcaa tacgcattca tac 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 41
attgtgggta taatggtaga tgc 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 42
tggaagaaga agtagaaaaa gga 23
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 43
aaaatggaaa gttcgacaca a 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 44
gaagagaagc aaatgaaagg c 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 45
gtgacgatac tgtaggggag g 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 46
atttcgggtt aagaagatgt g 21
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 47
aggtcgtgtc atctttcttc cat 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 48
cacaaaaccc ctttctactc aat 23
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 49
ggaaagaaac aaaaaaaaga aa 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 50
tgagaaagga gaataggaat ga 22
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 51
caattttcag attcagtttg acta 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 52
aagaaaccaa agaatggctt atca 24
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 53
gccattcttt ggtttctttt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 54
tccttttttg agcccatttt 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 55
atcaatgaag gtaatagaat a 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 56
caaacaaaaa gagaagagaa a 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 57
cgaggtgtga agtgggagag a 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 58
cgacgccagg atgataaaaa g 21
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 59
gtaatttcat agagtcattc ggtc 24
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 60
ccaaactgta caagcttctt ccaa 24
Claims (5)
1.基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物，其特征在于由30对多态性引物构成，其引物核苷酸序列信息如下：
cpSSR2正向引物如SEQ ID NO.1 所示；
cpSSR2反向引物如SEQ ID NO.2 所示；
cpSSR4正向引物如SEQ ID NO.3 所示；
cpSSR4反向引物如SEQ ID NO.4 所示；
cpSSR17正向引物如SEQ ID NO.5所示；
cpSSR17反向引物如SEQ ID NO.6 所示；
cpSSR18正向引物如SEQ ID NO.7所示；
cpSSR18反向引物如SEQ ID NO.8 所示；
cpSSR19正向引物如SEQ ID NO.9所示；
cpSSR19反向引物如SEQ ID NO.10 所示；
cpSSR21正向引物如SEQ ID NO.11所示；
cpSSR21反向引物如SEQ ID NO.12 所示；
cpSSR23正向引物如SEQ ID NO.13所示；
cpSSR23反向引物如SEQ ID NO.14所示；
cpSSR24正向引物如SEQ ID NO.15所示；
cpSSR24反向引物如SEQ ID NO.16所示；
cpSSR25正向引物如SEQ ID NO.17所示；
cpSSR25反向引物如SEQ ID NO.18所示；
cpSSR26正向引物如SEQ ID NO.19所示；
cpSSR26反向引物如SEQ ID NO.20所示；
cpSSR29正向引物如SEQ ID NO.21所示；
cpSSR29反向引物如SEQ ID NO.22所示；
cpSSR30正向引物如SEQ ID NO.23所示；
cpSSR30反向引物如SEQ ID NO.24所示；
cpSSR31正向引物如SEQ ID NO.25所示；
cpSSR31反向引物如SEQ ID NO.26所示；
cpSSR34正向引物如SEQ ID NO.27所示；
cpSSR34反向引物如SEQ ID NO.28所示；
cpSSR35正向引物如SEQ ID NO.29所示；
cpSSR35反向引物如SEQ ID NO.30所示；
cpSSR36正向引物如SEQ ID NO.31所示；
cpSSR36反向引物如SEQ ID NO.32所示；
cpSSR37正向引物如SEQ ID NO.33所示；
cpSSR37反向引物如SEQ ID NO.34所示；
cpSSR38正向引物如SEQ ID NO.35所示；
cpSSR38反向引物如SEQ ID NO.36所示；
cpSSR39正向引物如SEQ ID NO.37所示；
cpSSR39反向引物如SEQ ID NO.38所示；
cpSSR41正向引物如SEQ ID NO.39所示；
cpSSR41反向引物如SEQ ID NO.40所示；
cpSSR42正向引物如SEQ ID NO.41所示；
cpSSR42反向引物如SEQ ID NO.42所示；
cpSSR44正向引物如SEQ ID NO.43所示；
cpSSR44反向引物如SEQ ID NO.44所示；
cpSSR45正向引物如SEQ ID NO.45所示；
cpSSR45反向引物如SEQ ID NO.46所示；
cpSSR46正向引物如SEQ ID NO.47所示；
cpSSR46反向引物如SEQ ID NO.48所示；
cpSSR47正向引物如SEQ ID NO.49所示；
cpSSR47反向引物如SEQ ID NO.50所示；
cpSSR48正向引物如SEQ ID NO.51所示；
cpSSR48反向引物如SEQ ID NO.52所示；
cpSSR49正向引物如SEQ ID NO.53所示；
cpSSR49反向引物如SEQ ID NO.54所示；
cpSSR50正向引物如SEQ ID NO.55所示；
cpSSR50反向引物如SEQ ID NO.56所示；
cpSSR51正向引物如SEQ ID NO.57所示；
cpSSR51反向引物如SEQ ID NO.58所示；
cpSSR53正向引物如SEQ ID NO.59所示；
cpSSR53反向引物如SEQ ID NO.60所示。
2.权利要求1所述的基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物的制备方法，其特征在于，所述引物通过以下步骤获得：
（1）通过高通量测序技术获取苦蘵叶绿体基因组序列；
（2）cpSSR位点鉴别及cpSSR引物设计；
步骤（1）具体为：
采取长PCR扩增Long-range PCR amplification技术对利用CTAB方法提取的苦蘵样品基因组总DNA进行扩增；将扩增产物混合至总DNA浓度为～6 µg/L；利用物理方法打断DNA片段，构建Illumina测序文库，建库片段大小为500 bp；然后在Illumina Miseq测序平台进行上样测序，测序策略为两端测序Paired-end sequencing，测序长度为250 bp；然后，对测序获得原始数据进行质量过滤；最后，经过从头拼接、序列比对及组装，获得完整的苦蘵叶绿体基因组序列。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：
j利用MISA perl脚本软件搜索苦蘵叶绿体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列，重复单元≥10；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥4；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3；
k利用Primer Premier 5软件进行cpSSR引物设计，同时结合人工手动调整；引物设计参数原则：引物长度为18~26个碱基，退火温度为50℃～60℃，扩增产物大小集中在100~300bp。
4.如权利要求1所述的苦蘵cpSSR标记引物在苦蘵及近缘种种质资源遗传多样性、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于遗传多样性分析具体应用包括如下：
步骤一、基因组DNA提取
采取CTAB方法对苦蘵种质资源的基因组DNA进行提取；
步骤二、cpSSR-PCR反应
cpSSR- PCR体系：总反应体积为10 μL，具体包括1 μL的10×Buffer ，0.8 μL的10mmol/L dNTPs，cpSSR引物上、下游引物各1 μL，0.5 μL2 U/μL的Taq酶, 1 μL50 ng/μL模板DNA ，4.7 μL的ddH2O；扩增产物在Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；所述的10×Buffer包括200 mM pH 8.8 Tris–HCl，100 mM KCl，100 mM (NH4)2SO4，20 mM MgCl2，1% TritonX-100；
cpSSR-PCR程序为：94℃预变性5 min；32个循环，其中每个循环包括94℃变性50 min，不同cpSSR引物Tm值复性50 s，72℃延伸1.5 min；最后72℃延伸10 min；
步骤三、电泳检测
采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳PAGE对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳1.5~2.0小时；
步骤四、数据分析
利用Quantity one软件及人工辅助判读的方法进行电泳图拷带；为了保证结果的准确性，每对引物需进行二次重复PCR扩增和电泳检测，并只统计清晰度高、稳定性好的电泳位点；同一位点有条带记作“l”，无条带记作“0”；利用NTSYS-pc 2.10e软件构建种群间的非加权组算术平均数法聚类图。
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