CN110079626B - 用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的ssr引物及应用 - Google Patents
用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的ssr引物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物及应用。所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～40所示。本发明还提供了一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒，该引物和试剂盒的开发为研究月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析提供了新的技术方法和手段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物及应用。
背景技术
新月弯孢菌(Curvularia lunata)是一种十分重要的植物病原真菌。它的寄主范围非常广泛，豆科、葫芦科、菊科、茄科、锦葵科和禾本科中的大多数植物均可被新月弯孢侵染。在该病原菌所引起的植物病害中，玉米弯孢霉叶斑病是危害最严重的植物病害之一。该病害是玉米上一种毁灭性的叶部病害，在玉米的整个生育期均可发生，发病高峰期为抽雄至灌浆期，典型症状是在叶片上形成中心灰白色，边缘黄褐色的圆形病斑，外围有淡黄色晕圈。自九十年代以来，该病害在我国11个省的玉米种植区严重发生，特别是在河南、安徽和辽宁3省，危害尤为严重，导致玉米大面积减产，已成为玉米生产上的一个重大威胁。
简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)也称为微卫星，是由2～6个核苷酸组成的基本单位多次串联重复构成的一段DNA，广泛存在于真核生物的基因组中，在基因的编码区和非编码区均有分布。由于SSR分子标记具有基因组广泛分布、共显性遗传、多态性丰富、重复性好等诸多优点，已成为目前最流行的分子标记之一，广泛用于遗传多样性与遗传结构的分析、系统发育分析和遗传图谱的构建。目前在真菌遗传多样性与遗传结构的研究中，大量的SSR分子标记得到开发和应用，但是对于真菌新月弯孢菌，至今还未有该物种SSR分子标记的正式报道，仍在主要利用随机扩增多态性DNA(random amplifiedpolymorphic DNA，RAPD)和简单重复序列区间(inter-simple sequence repeats,ISSR)两种分子标记进行遗传多样性的分析。目前新月弯孢的全基因组测序已经完成，从NCBI网站可以下载完整的基因组序列，这为新月弯孢SSR分子标记的开发提供了非常便利的条件。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物。
本发明的另一目的在于提供一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒，该试剂盒包含上述用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物。
本发明的再一目的在于提供上述SSR引物和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物，选自如下引物对中的至少十对：CL-SSR1、CL-SSR2、CL-SSR6、CL-SSR7、CL-SSR8、CL-SSR10、CL-SSR11、CL-SSR17、CL-SSR19、CL-SSR20、CL-SSR21、CL-SSR24、CL-SSR27、CL-SSR29、CL-SSR33、CL-SSR35、CL-SSR37、CL-SSR38、CL-SSR42、CL-SSR45，其核苷酸序列如下所示：
CL-SSR1-F：5'-GGGCTATGTGCTCTGGATGTG-3'；
CL-SSR1-R：5'-ATGTTCGGAGGCTGGTGGAT-3'；
CL-SSR2-F：5'-GCCCACCGATGGTTTGTTCT-3'；
CL-SSR2-R：5'-CTCTATCCGCGTGTCCCACA-3'；
CL-SSR6-F：5'-AGCCCACCAGGCCCAGAATA-3'；
CL-SSR6-R：5'-AGGAATGGTCGTCGCGGTTT-3'；
CL-SSR7-F：5'-ATGGATGACTGGCGGGTTGA-3'；
CL-SSR7-R：5'-TGAAGGGCAGGTTGGTAGGC-3'；
CL-SSR8-F：5'-TGAAGAAAGGGCTGGAGGTG-3'；
CL-SSR8-R：5'-GGGTGGCTGTTGTTGATTGC-3'；
CL-SSR10-F：5'-ACGCTTATGCTGGATAAATT-3'；
CL-SSR10-R：5'-CGAGGCAGTGAAGAGTAGTG-3'；
CL-SSR11-F：5'-GAGAACGAGGAACAACGAGG-3'；
CL-SSR11-R：5'-CAAGGAACGAAGGGAGGTAT-3'；
CL-SSR17-F：5'-CTGTTGATTGCGGATCTTTA-3'；
CL-SSR17-R：5'-GCCTAGCCTGCACGTCTTAT-3'；
CL-SSR19-F：5'-GGATCGTCCAACAGGGTAAA-3'；
CL-SSR19-R：5'-GGGAGGCTTTGTTTCGTTTA-3'；
CL-SSR20-F：5'-TCTGCGACATTCTTGTTCTG-3'；
CL-SSR20-R：5'-TAAGGGTTGGTATTGTGGAG-3'；
CL-SSR21-F：5'-TACAGAGGGAGGGAGCAATC-3'；
CL-SSR21-R：5'-TTACGCTACCCAACACCAAG-3'；
CL-SSR24-F：5'-TTTTCCTTTGTTGCCTTGTTTC-3'；
CL-SSR24-R：5'-ATGCTACCTCCGCTCCCTAC-3'；
CL-SSR27-F：5'-GAACGCATGTGAAATGTTTA-3'；
CL-SSR27-R：5'-CCAATACCGATCCGATAGTC-3'；
CL-SSR29-F：5'-GCAGGCTTGGTTGCTGAAGT-3'；
CL-SSR29-R：5'-GCCAGGGACGCATAGAGGAT-3'；
CL-SSR33-F：5'-AAACAACAGAGCCTGAGACA-3'；
CL-SSR33-R：5'-ACGGGTTGATAATGATGTGC-3'；
CL-SSR35-F：5'-ATTCTATGGTGGAGTCTGGC-3'；
CL-SSR35-R：5'-TACATCCCTACTTGTCTTCG-3'；
CL-SSR37-F：5'-TTTGAGGTACGGCCATCCAC-3'；
CL-SSR37-R：5'-AAGGCTCTGACAGCTCTATCTTCC-3'；
CL-SSR38-F：5'-TTTATGAGCGTGTCGGAAGA-3'；
CL-SSR38-R：5'-GTTGAACGGCCATCACTGGA-3'；
CL-SSR42-F：5'-GCGTACAGTTTGGGCTTCGA-3'；
CL-SSR42-R：5'-TTCTTGGTGGTTGCTGGTGC-3'；
CL-SSR45-F：5'-CTGGTGCGATTGTTGGGTTAT-3'；
CL-SSR45-R：5'-GTTGCTGCCGCTCTGAATGA-3'；
一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒，包含上述用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物；
所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒，还包含10×PCR反应缓冲液，2.5mM dNTP，5U/μL Taq DNA聚合酶，无菌超纯水；
所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物或用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒在新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析中的应用；
一种新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的方法，包含如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以步骤(1)提取的待测样品的DNA为模板，以上述用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物为扩增引物，进行PCR扩增，扩增产物进行丙烯酰胺凝胶电泳；
(3)采用常规方法对电泳结果进行遗传多样性分析和亲缘关系分析；
步骤(2)中所述的PCR扩增的体系优选为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5mM dNTP1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，加无菌超纯水至25μL；
步骤(2)中所述的PCR扩增的条件优选为：94℃变性5min，94℃变性30S，50～65℃退火30S，72℃延伸30S，32个循环，72℃延伸5min；
步骤(2)中所述的遗传多样性分析的具体操作优选为：
利用POPGENE32软件计算居群的表观等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数和Shannon信息指数；
步骤(2)中所述的亲缘关系分析的具体操作优选为：
利用NTSYSpc2.10软件计算各个待测样品之间遗传相似系数，并使用UPGMA法聚类构建系统发育树；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明开发了用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物和试剂盒，该引物和试剂盒的开发为研究月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析提供了新的技术方法和手段。
(2)本发明提供的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物和试剂盒可用于建立菌种质资源库，使用方便，能简单快捷的鉴定不同地域来源的新月弯孢菌种质资源，构建遗传图谱和定位功能基因；相较传统方法，可以大大缩短分析周期，提高研究效率。
附图说明
图1是引物CL-SSR23、CL-SSR26和CL-SSR30PCR扩增电泳结果图。
图2是引物CL-SSR17、CL-SSR24和CL-SSR35PCR扩增电泳结果图。
图3是24株新月弯孢菌的系统发育树图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 SSR引物开发
(1)基因组SSR位点的分析与引物设计
从NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站下载新月弯孢菌的全基因组序列，利用MISA软件搜索基因组序列中的2～6个核苷酸的SSR位点，搜索条件为2个核苷酸的重复次数须≥6，3～6个核苷酸的重复次数须≥5。然后提取SSR位点上下游200bp序列，利用Primer 5.0软件设计SSR引物，设置参数为：引物长度20～24bp，退火温度50～65℃，GC含量40～60％，PCR产物长度150～350bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2)DNA的提取与PCR
6株不同地理分布的新月弯孢菌株(CL17-27、CL15-27、CL17-30、CL17-35、CL17-64和CL15-16，具体见表3)培养5d后收集100mg菌丝，使用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)参照试剂盒操作说明提取基因组DNA。利用NanoDrop1000超微量分光光度计(美国Nanodrop公司)将提取的DNA浓度调整到50ng/μL。
PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5mM dNTP 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，加无菌超纯水至25μL。PCR扩增条件：94℃变性5min，94℃变性30S，50～65℃退火30S，72℃延伸30S，32个循环，72℃延伸5min。PCR产物用质量分数为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测扩增条带。
(4)数据处理
将电泳图谱中条带转化为数字矩阵，利用PowerMarker3.25软件计算SSR引物的等位基因数和多态性信息指数；利用POPGENE32软件计算居群的表观等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数和Shannon信息指数；利用NTSYSpc2.10软件计算各个菌株之间遗传相似系数，并使用UPGMA法构建系统发育状。
结果与分析：
(1)基因组SSR的分布
从NCBI网站下载新月弯孢菌CX-3的基因组序列，序列总长34.80Mb，共计2876个Contigs。利用MISA软件搜索基因组中的2～6个核苷酸的SSR位新月弯孢菌点，共发现1469个SSR位点，平均每Mb基因组序列中存在42.21个SSR位点(表1)。其中三核苷酸SSR位点最多，共742个，其次为二核苷酸SSR位点，共563个，分别占SSR位点总数的50.51％和38.32％，四、五和六核苷酸重复位点的数量很少，共164个，仅占11.17％。
表1新月弯孢菌CX-3基因组SSR的分布
(2)多态性SSR引物的筛选
从重复次数≥12的二核苷酸和三核苷酸SSR位点随机挑选出48个，提取SSR位点上下游200bp序列，利用Primer 5.0软件设计SSR引物48对，然后使用6个不同地理来源的菌株(CL17-27、CL15-27、CL17-30、CL17-35、CL17-64和CL15-16)进行PCR，检测48对SSR引物的有效性和多态性。结果发现，从6个菌株中均能扩增出清晰条带的SSR引物23对(图2)，其中3对SSR引物没有多态性(图1)，因此成功筛选出SSR引物20对(表2)，筛选成功率为41.67％。这20对SSR引物包括9对二核苷酸SSR引物和11对三核苷酸SSR引物，重复次数为13～23次，等位基因数2～5个，多态性信息指数在0.3457～0.7438之间，这些SSR引物可用于新月弯孢菌的遗传多样性和遗传结构分析。
表2 20对多态性SSR引物的信息
实施例2利用SSR引物对不同居群新月弯孢菌进行遗传多样性分析
(1)供试菌株与培养基
采用组织分离法从河南省商丘市、周口市和驻马店市玉米田的发病植株上分离24株新月弯孢菌(表3)，然后经过单孢分离进行纯化，转接于PDA斜面上4℃下保存。所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1L。
表3 24株新月弯孢菌的信息
(2)DNA的提取与PCR
具体操作同实施例1，扩增引物为CL-SSR2、CL-SSR6、CL-SSR7、CL-SSR19、CL-SSR24、CL-SSR29、CL-SSR35、CL-SSR37、CL-SSR42和CL-SSR45；
(3)不同居群新月弯孢菌的遗传多样性分析
根据10对SSR引物(CL-SSR2、CL-SSR6、CL-SSR7、CL-SSR19、CL-SSR24、CL-SSR29、CL-SSR35、CL-SSR37、CL-SSR42和CL-SSR45)对24株新月弯孢菌的PCR扩增结果，利用POPGENE32软件计算居群的表观等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数和Shannon信息指数(表4)，这4个参数是衡量遗传多样性水平的重要指标。河南省3个地区的新月弯孢菌居体中，商丘居体的遗传多样性水平最高，其表观等位基因数、有效等位基因数、Nei's基因多样性指数与Shannon信息指数分别为4.4000、3.5882、0.6750和1.3089，驻马店居体的遗传多样性水平最低，其表观等位基因数、有效等位基因数、Nei's基因多样性指数与Shannon信息指数分别为3.5000、2.9485、0.6094和0.6094。
表4河南省3个新月弯孢菌居群的遗传多样性分析
注：Na表示表观等位基因数，Ne表示有效等位基因数，H表示Nei's基因多样性指数，I表示Shannon信息指数。
实施例3利用SSR引物对新月弯孢菌株间的亲缘关系分析
(1)供试菌株与培养基同实施例2；
(2)DNA的提取与PCR具体操作同实施例1，扩增引物为CL-SSR2、CL-SSR6、CL-SSR7、CL-SSR19、CL-SSR24、CL-SSR29、CL-SSR35、CL-SSR37、CL-SSR42和CL-SSR45；
(3)新月弯孢菌株间的亲缘关系分析
根据10对SSR引物(CL-SSR2、CL-SSR6、CL-SSR7、CL-SSR19、CL-SSR24、CL-SSR29、CL-SSR35、CL-SSR37、CL-SSR42和CL-SSR45)对24株新月弯孢菌的PCR扩增结果，利用NTSYSpc2.10软件计算各个菌株之间遗传相似系数(表5)，并使用UPGMA法聚类构建系统发育树(图3)。依据菌株之间遗传相似系数或构建的系统发育树，可以判断各个菌株之间的亲缘关系。可以看出24个菌株之间的遗传相似系数在0.7183～0.9155之间。菌株CL15-19和CL15-26之间的遗传相似系数最大，数值为0.9155，说明这两个菌株之间的亲缘关系最近；很多菌株之间的遗传相似系数为0.7183，是最小值，例如：菌株CL17-21和CL17-30之间，菌株CL17-23和CL17-38之间，说明它们之间的亲缘关系在这个群体内是最远的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物及应用
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<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CL-SSR29-R
<400> 28
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CL-SSR33-F
<400> 29
aaacaacaga gcctgagaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CL-SSR33-R
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acgggttgat aatgatgtgc 20
<210> 31
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<213> Artificial
<220>
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attctatggt ggagtctggc 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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tacatcccta cttgtcttcg 20
<210> 33
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 33
tttgaggtac ggccatccac 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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aaggctctga cagctctatc ttcc 24
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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ttcttggtgg ttgctggtgc 20
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<213> Artificial
<220>
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ctggtgcgat tgttgggtta t 21
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<213> Artificial
<220>
<223> CL-SSR45-R
<400> 40
gttgctgccg ctctgaatga 20
Claims (7)
1. 一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物，其特征在于包括如下引物：CL-SSR1、CL-SSR2、CL-SSR6、CL-SSR7、CL-SSR8、CL-SSR10、CL-SSR11、CL-SSR17、CL-SSR19、CL-SSR20、CL-SSR21、CL-SSR24、CL-SSR27、CL-SSR29、CL-SSR33、CL-SSR35、CL-SSR37、CL-SSR38、CL-SSR42、CL-SSR45，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~40 所示。
2.一种用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物。
3. 根据权利要求2所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒，其特征在于还包含10×PCR反应缓冲液，2.5mM dNTP，5U/μL Taq DNA聚合酶，无菌超纯水。
4.权利要求1所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物或权利要求2~3任一项所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的试剂盒在新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析中的应用。
5.一种新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）提取待测样品的DNA；
（2）以步骤（1）提取的待测样品的DNA为模板，以权利要求1所述的用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的SSR引物为扩增引物，进行PCR扩增，扩增产物进行丙烯酰胺凝胶电泳；
（3）采用常规方法对电泳结果进行遗传多样性和亲缘关系分析；步骤（3）中所述的遗传多样性分析的具体操作为：
利用POPGENE32软件计算居群的表观等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数和Shannon信息指数；
步骤（3）中所述的亲缘关系分析的具体操作为：
利用NTSYSpc2.10软件计算各个待测样品之间遗传相似系数，并使用UPGMA法聚类构建系统发育树。
6.根据权利要求5所述的新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的PCR扩增的体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5mM dNTP 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，加无菌超纯水至25μL。
7.根据权利要求5所述的新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃变性30S，50～65℃退火30S，72℃延伸30S，32个循环；72℃延伸5min。
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