CN113151262B - 调控强度弱化的酵母菌启动子及其在代谢通量调控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控强度弱化的酵母启动子及其应用。本发明具体地公开了一种DNA分子，所述DNA分子是在酵母内源启动子上整合具有阻遏作用的异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。本发明通过整合marO序列可有效下调酵母启动子的强度，从转录水平降低基因表达水平，为酵母代谢工程改造中下调支路途经、分解途径或衍生途径等的代谢通量提供新的工具。将该启动子弱化策略应用于酵母角鲨烯衍生途径的弱化中，可有效降低从角鲨烯到甾醇的代谢通量。本发明提供的产角鲨烯的酵母菌株，可在不额外添加酶抑制剂特比萘芬或其他效应物的条件下，实现角鲨烯的高效积累，降低发酵成本，简化发酵工艺，具有很好的工业化应用前景。

Description

调控强度弱化的酵母菌启动子及其在代谢通量调控中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和代谢工程领域中调控强度弱化的酵母菌启动子及其在代谢通量调控中的应用。

背景技术

酵母菌是现代生物技术领域非常重要的细胞工厂，在生物能源、大宗化学品、精细化学品及生物医药等领域有着非常广泛的应用。以酵母菌为底盘细胞，通过不同策略重构、改造和优化代谢通路，是实现目标代谢产物高效合成的重要手段。

转录调控是控制基因表达水平和相关蛋白质活性的关键调控环节，利用强效启动子增强目标代谢产物合成相关基因的表达是代谢工程改造中最通用和有效的技术手段，因此对不同来源的启动子进行筛选和改造获得调控强度更高的启动子一直是本领域的研究热点。但生物体内的代谢并不是独立的直线型途径，而是存在多个分支、相互依存的复杂网络模式，一味地提高关键基因的表达水平并不一定能实现目标产物产量的持续提高，其合成途径中需要各个基因的相互协调和配合，需要实现各个基因表达水平的平衡。因此除利用强效启动子增强目标产物合成代谢相关基因的表达外，还需要利用合适的启动子降低分支、分解或衍生途径相关基因的表达，通过对多基因表达的协同调控提高代谢工程改造的效率，在不影响底盘细胞生理功能的前提下实现目标代谢产物合成的最大化和有效积累。

目前，在酵母菌启动子改造研究中主要靶向提高启动子调控强度，并且取得了很好的研究进展。但对如何有效降低启动子调控强度的研究还非常有限，在下调支路途经、分解途径或衍生途径的代谢通量方面还缺乏有效的调控工具。因此有必要基于合成途径分支的这一特点，通过弱化启动子的调控强度来抑制或下调目标途径的竞争途径，从而实现目标代谢产物的高效积累。角鲨烯(squalene)是一种具有抗氧化、增强机体免疫力、抗肿瘤等多种生理活性的不饱和三萜化合物，在医药、保健品、食品和化妆品等领域有着广阔的市场前景。角鲨烯是酵母菌甾醇合成途径的中间代谢产物，它在角鲨烯单加氧酶ERG1催化下很快被转化为甾醇合成的前体，因此天然酵母细胞中角鲨烯的含量极低。而ERG1基因是酵母菌生长的必需基因，不能采用敲除ERG1基因的策略阻断角鲨烯向甾醇的代谢通路，因此要在不影响细胞生长的基础上实现角鲨烯的有效积累就必须对角鲨烯单加氧酶ERG1的活性水平进行合理调控。在基因表达调控中，阻遏蛋白能够与靶基因启动子的特定序列发生特异性结合，从而减弱或阻断基因的转录，因此利用阻遏蛋白结合序列对酵母菌启动子进行改造可能是弱化启动子调控强度的有效方法。而为了避免内源阻遏蛋白对调控系统的干扰，异源阻遏系统的调控元件可能更具有优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何有效降低启动子的调控强度，为酿酒酵母代谢工程改造中下调支路途经、分解途径或衍生途径等的代谢通量提供新的工具，从而实现目标代谢产物的高效积累。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA分子，其名称为pSW，所述DNA分子是在酵母内源启动子上整合具有阻遏作用的异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。

所述整合选自下述至少一种：

A1)在所述酵母内源启动子中插入所述异源顺式调控元件，

A2)用所述异源顺式调控元件替换所述酵母内源启动子中的DNA片段。

进一步地，本发明所述异源顺式调控元件具体可为大肠杆菌阻遏蛋白MarR的DNA结合序列marO，所述marO的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述DNA分子中，所述异源顺式调控元件可为一拷贝或多拷贝，如1个或2个拷贝。

上述DNA分子中，所述DNA分子pSW具体可为在所述酵母内源启动子的CAAT box(CAAT框)和TATA box(TATA框)之间插入所述异源顺式调控元件、和/或在所述酵母内源启动子的TATA box的下游插入所述异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。

上述DNA分子中，所述CAAT框可为序列表的SEQ ID No.2的第188位至第192位所示的DNA片段。

上述DNA分子中，所述TATA框可为序列表的SEQ ID No.2第603位至第608位所示的DNA片段和序列表的SEQ ID No.6第406位至第411位所示的DNA片段。

上述DNA分子中，所述DNA分子pSW具体可为用所述异源顺式调控元件替换所述酵母内源启动子中的甾醇响应元件(Sterol response element,SRE)、和/或在所述酵母内源启动子的TATA box(TATA框)下游插入所述异源顺式调控元件、和/或在所述酵母内源启动子的SRE和TATA box(TATA框)之间插入所述异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。

上述DNA分子中，所述甾醇响应元件(Sterol response element,SRE)可为序列表的SEQ ID No.6的第127-152位所示的DNA片段。

进一步地，本发明所述的DNA分子为下述任一种：

P1)所述DNA分子中，所述酵母内源启动子为酿酒酵母角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子ERG1p，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

P2)所述DNA分子为ERG1p(M5)、ERG1p(M4)、ERG1p(M1)、ERG1p(M6)、ERG1p(M3)、或ERG1p(M2)；

所述ERG1p(M5)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.11或SEQ ID No.11的第9-506位的双链DNA分子，

所述ERG1p(M4)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.10或SEQ ID No.10的第9-506位的双链DNA分子，

所述ERG1p(M1)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.7或SEQ ID No.7的第9-494位的双链DNA分子，

所述ERG1p(M6)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.12或SEQ ID No.12的第9-532位的双链DNA分子，

所述ERG1p(M3)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第9-520位的双链DNA分子，

所述ERG1p(M2)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.8或SEQ ID No.8的第9-520位的双链DNA分子，

P3)所述DNA分子中，所述酵母内源启动子为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因ADH1启动子ADH1p，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

P4)所述DNA分子为ADH1p(M3)、ADH1p(M2)或ADH1p(M1)；

所述ADH1p(M3)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.5或SEQ ID No.5的第11-742位的双链DNA分子，

所述ADH1p(M2)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.4或SEQ ID No.4的第11-730位的双链DNA分子，

所述ADH1p(M1)是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第11-730位的双链DNA分子，

P5)与以SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示的核苷酸序列具有70％或更多，80％或更多，85％或更多，或90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％,97％，98％，99％或更多的同一性的具有与所述酵母内源启动子相比调控强度弱化的启动子活性的DNA分子；

P6)所述DNA分子为在所述酵母内源启动子的CAAT框和TATA框之间插入所述异源顺式调控元件、和/或在所述酵母内源启动子的TATA框的下游插入所述异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子；

P7)所述DNA分子为用所述异源顺式调控元件替换所述酵母内源启动子中的甾醇响应元件、和/或在所述酵母内源启动子的TATA框下游插入所述异源顺式调控元件、和/或在所述酵母内源启动子的甾醇响应元件和TATA框之间插入所述异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。

P2)中，所述ERG1p(M1)是由marO替换ERG1p中的SRE序列得到的，其序列如SEQ IDNo.7所示。

所述ERG1p(M2)是将marO插入到ERG1p中的SRE序列及TATA框序列之间得到的，其序列如SEQ ID No.8所示。

所述ERG1p(M3)是将marO插入ERG1p中的TATA框序列下游得到的，其序列如SEQ IDNo.9所示。

所述ERG1p(M4)是由一拷贝marO替换ERG1p中的SRE序列，另一拷贝marO插入SRE序列及TATA框序列之间得到的，其序列如SEQ ID No.10所示。

所述ERG1p(M5)是由一拷贝marO替换ERG1p中的SRE序列，另一拷贝marO插入到TATA框序列下游得到的，其序列如SEQ ID No.11所示。

所述ERG1p(M6)是将一拷贝marO插入SRE序列及TATA框序列之间，另一拷贝marO插入TATA框序列下游得到的，其序列如SEQ ID No.12所示。

所述调控强度弱化的启动子可为ERG1p(M1)、ERG1p(M2)、ERG1p(M3)、ERG1p(M4)、ERG1p(M5)或ERG1p(M6)。

所述弱化程度最高的启动子可为ERG1p(M5)。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料为下述B1)至B3)中的任一种：

B1)含有本发明DNA分子的重组DNA分子，

B2)含有本发明DNA分子的重组载体，

B3)含有本发明DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物。

B1)所述重组DNA分子可为下述任一种：

C1)所述重组DNA分子为用于将酵母基因组中的酵母内源启动子替换为pSW的DNA片段，

C2)所述重组DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示,

C3)与SEQ ID No.13所示的序列具有70％或更多，80％或更多，85％或更多，或90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％,97％，98％，99％或更多的同一性且含有本发明DNA分子pSW的用于将酵母基因组中的酵母内源启动子替换为pSW的DNA片段。

本发明生物材料中，C1)所述重组DNA分子中，将酵母基因组中的酵母内源启动子替换为pSW可通过同源重组实现。所述载体可为质粒。所述重组微生物可为酵母。所述重组微生物具体可为将酿酒酵母基因组中的角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子ERG1p替换为本发明所述的DNA分子pSW得到的重组菌。

本发明还提供了本发明所述DNA分子pSW在作为启动子中的应用。

本发明还提供了本发明所述DNA分子pSW或所述重组DNA分子在制备重组生物中的应用。

本发明还提供了一种制备角鲨烯的方法，所述方法使用重组酵母生产角鲨烯，所述重组酵母为将酿酒酵母基因组中的角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子ERG1p替换为本发明所述的DNA分子pSW得到的重组菌。

本发明还提供了本发明所述DNA分子pSW在酵母代谢工程改造中的应用。

本发明中，所述启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能与RNA聚合酶等转录相关蛋白准确结合，并具有转录起始的特异性。

可以根据几种技术的目前研究(诸如定向进化技术或定点诱变技术)在一定程度上修饰本发明的DNA分子。例如，与以SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ IDNo.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示的核苷酸序列具有70％或更多，80％或更多，85％或更多，或90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％,97％，98％，99％或更多的同一性的具有与所述酵母内源启动子相比调控强度弱化的启动子活性的DNA分子也包括在本发明的范围内。

如本文中使用的，术语“同一性”指多核苷酸序列间的序列同一性的程度(以百分比表示)。在本说明书中，与给定多核苷酸序列相同的序列或与给定多核苷酸序列具有相似活性的序列的同一性按照“％同一性”表示。例如，可以通过使用标准软件(例如BLAST 2.0)计算诸如得分、同一性和相似性等参数来测定多核苷酸序列的同一性。或者，可以通过根据在限定的严格条件下进行的杂交方法比较序列鉴定多核苷酸序列的同一性。可以考虑本领域技术人员公知的方法确定杂交方法的限定且适合的条件。

根据一个或多个例示性的实施方案，提供了调控靶基因表达的重组DNA分子，所述重组DNA分子指这样的调控序列，其可以包含近端和多个远端上游元件和/或下游元件，其与宿主生物体中的DNA序列可操作连接，其包括但不限于影响RNA加工或稳定性的序列，如增强子、上游启动子元件、启动子、5'-UTR和/或3'-UTR。它们包括天然序列和合成序列、以及可能是合成序列和天然序列的组合序列。

本发明所述调控可为转录调控。所述重组启动子的调控强度低于或弱于所述酵母内源启动子。

本领域技术人员已知的任何酵母表达系统均可根据本发明使用。或者，可使用任何适合蛋白质表达的酵母物种或酵母表达系统，包括酵母物种，例如酵母属物种(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。在另一个实施方案中，本发明使用的酵母可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YEH-56。本文中所述调控可为转录调控。

本发明所述异源顺式调控元件可为一拷贝或多拷贝。

本发明所述酵母可为酿酒酵母。所述代谢工程改造可为下调支路途经代谢通量、分解途径代谢通量或衍生途径代谢通量。

本发明针对酵母菌代谢工程改造中缺乏有效的下调支路途经、分解途径或衍生途径等代谢通量工具的问题，以及内源调控元件可能产生的调控干扰问题，利用异源阻遏调控系统改造酵母菌内源启动子，获得调控强度被不同程度弱化的新型启动子，为代谢工程改造中多基因的协同调控提供了有效调控工具。将该启动子弱化策略应用于酵母菌角鲨烯衍生途径的弱化中，降低了从角鲨烯到甾醇的代谢通量，实现了酵母细胞中角鲨烯的高效积累。本发明提供的产角鲨烯的酵母菌株，可在不额外添加酶抑制剂特比萘芬或其他效应物的条件下，实现角鲨烯的高效积累，降低发酵成本，简化发酵工艺，因此该菌株具有很好的工业化应用前景。

附图说明

图1为不同启动子结构示意图。

图2为ERG1p系列启动子序列比对图。

具体实施方式

本发明提供了一组调控强度弱化的酿酒酵母启动子，为酿酒酵母代谢工程改造中下调支路途经、分解途径或衍生途径等的代谢通量提供新的工具。

本发明提供的调控强度弱化的酿酒酵母启动子，是将具有阻遏作用的异源顺式调控元件整合到酿酒酵母内源启动子中，具体包括如下步骤：在酿酒酵母内源启动子的不同位置插入不同拷贝的异源顺式调控元件，获得调控强度有不同程度降低的启动子。所述异源顺式调控元件marO来源于大肠杆菌，是大肠杆菌阻遏蛋白MarR的结合位点，其核心为一段12bp的假回文重复序列，其DNA序列如序列表的SEQ ID No.1所示。

所述酿酒酵母内源启动子可以是酿酒酵母任意启动子。

本发明利用调控强度弱化的启动子下调衍生途径代谢通量，实现目标代谢产物的高效积累。

所述目标代谢产物具体可为角鲨烯。

本发明利用大肠杆菌来源的顺式调控元件marO改造酿酒酵母甾醇合成途径中的角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子ERG1p，获得六种改造后的启动子ERG1p(M1)、ERG1p(M2)、ERG1p(M3)、ERG1p(M4)、ERG1p(M5)和ERG1p(M6)，从中筛选弱化程度最高的启动子ERG1p(M5)替换基因组中原始ERG1p，以降低角鲨烯到甾醇的代谢通量，提高酵母细胞中间代谢产物角鲨烯的积累。具体实施方式如下。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

PrimeSTAR Max Premix(2x)为TaKaRa公司产品，产品目录号为R045A。

质粒YCp50记载于如下文献中：Kuo CL,Campbell JL.Cloning of Saccharomycescerevisiae DNA replication genes:isolation of the CDC8 gene and two genesthat compensate for the cdc8-1 mutation.Mol Cell Biol,1983,3:1730-1737。公众可从中国科学院微生物研究所获得。

质粒YEp352记载于如下文献中：Hill JE,Myers AM,Koerner TJ，TzagoloffA.Yeast/E.coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast,1993,2:163-167。公众可从中国科学院微生物研究所获得。

质粒pEBCMZC记载于如下文献中：Song P,Liu S,Guo X,Bai X,He X,ZhangB.Scarless gene deletion in methylotrophic Hansenula polymorpha by using mazFas counter-selectable marker.Anal Biochem,2015,468:66-74。公众可从中国科学院微生物研究所获得。

质粒YCp-GA为本研究组前期构建的带有GFP编码序列和ADH1终止子序列的质粒，构建方法记载于如下专利中：一种调节启动子强度和表达模式的特异DNA分子，专利号201610113009.2、公开号为CN105647924A的第0071-0086段。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58记载于如下文献中：Teunissen AW,Van den Berg JA，Steensma HY.Physical localization of the flocculation geneFLO1 on chromosome I of Saccharomyces cerevisiae.Yeast,1993,9:1-10.以下简称酿酒酵母YS58，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YEH-56是本研究组保藏的菌株，记载于如下文献中：He X,Huai W,Tie C,Liu Y,Zhang B.Breeding of high ergosterol-producing yeast strains.J Ind Microbiol Biotechnol，2000,25:39-44，以下简称酿酒酵母YEH-56，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

实施例中用到的各种培养基：

YPD培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨和葡萄糖，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖；自然pH。

SC完全培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母氮源基础(YeastNitrogen Base,YNB)、葡萄糖、组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10g/L葡萄糖、40mg/L的组氨酸、40mg/L色氨酸、40mg/L亮氨酸和20mg/L尿嘧啶；自然pH。

SC选择培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母氮源基础(YeastNitrogen Base,YNB)、葡萄糖、组氨酸、亮氨酸和色氨酸，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10g/L葡萄糖、40mg/L的组氨酸、40mg/L色氨酸和40mg/L亮氨酸；自然pH。

SC诱导培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母氮源基础(YeastNitrogen Base,YNB)和半乳糖，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、20g/L半乳糖；自然pH。

以上培养基的固体培养基由添加20g/L琼脂粉制成，其余成分以及浓度与液体培养基相同。

实施例1、整合异源顺式调控元件构建不同调控强度的启动子

一、异源顺式调控元件的筛选

基于异源、作用机制和DNA结合位点明确、阻遏蛋白效应物廉价易得及在酿酒酵母中不存在或含量低于阈值的筛选原则，初步确定了来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的阻遏蛋白MarR的DNA结合序列marO为用于改造酵母菌启动子的异源顺式调控元件。

来源于大肠杆菌的MarR属于多重耐药泵家族阻遏蛋白，其效应物为水杨酸盐。MarR在靶基因启动子上的核心结合位点是一个保守的12bp的假回文重复序列marO，其序列如SEQ ID No.1所示。

二、带有异源顺式调控元件marO的酵母菌启动子的构建

(一)根据GenBank中报道的酿酒酵母乙醇脱氢酶基因ADH1启动子ADH1p的核苷酸序列(GenBank No.Z74828.1)和文献报道的大肠杆菌阻遏蛋白MarR的DNA结合位点序列(Martin RG,Rosner JL.Binding of purified multiple antibiotic-resistancerepressor protein(MarR)to mar operator sequence.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:5456-5460)设计并合成如下引物(下划线部分分别为限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点；小写字母为marO序列)：

ADH1p-F：5’-CCCCAAGCTTGATATCCTTTTGTT-3’

ADH1p-R：5’-CGGGATCCAGTTGATTGTATGCTTGGTATAG-3’

ADH1p(CAAT)-1F：5’-AACAAGACTACACCAATttgccagggcaaTACACTGCCTCATTGATG-3’

ADH1p(CAAT)-1R：5’-CATCAATGAGGCAGTGTAttgccctggcaaATTGGTGTAGTCTTGTT-3’

ADH1p(TATA)-1F：5’-GCTATCAAGTATAAATttgccagggcaaAGACCTGCAATTATTAATC-3’

ADH1p(TATA)-1R：5’-TAATAATTGCAGGTCTttgccctggcaaATTTATACTTGATAGCAAG-3’

(二)提取酿酒酵母YS58的基因组DNA，以此为模板，利用不同引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：基因组DNA 50ng，各引物在反应体系中的浓度均为0.3μmol/L，PrimeSTAR Max Premix(2x)25μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。

PCR反应条件：98℃/3min，循环1次；98℃/10sec,53℃/10sec,72℃/10sec,32次循环；72℃/5min。

1、利用引物对ADH1p-F/ADH1p-R扩增得到726bp的DNA片段，命名为ADH1p。其序列如SEQ ID No.2所示。

2、利用引物对ADH1p-F/ADH1p(CAAT)-1R扩增得到222bp的DNA片段ADH1p-1，利用引物对ADH1p(CAAT)-1F/与ADH1p-R扩增得到563bp的DNA片段ADH1p-2，分别回收两个DNA片段，然后等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ADH1p-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到738bp的DNA片段，该DNA片段是在ADH1p的CAAT框下游插入了12bp的marO序列，命名为ADH1p(M1)。其序列如SEQ ID No.3所示。

3、利用引物对ADH1p-F/ADH1p(TATA)-1R扩增得到640bp的DNA片段ADH1p-3，利用引物对ADH1p(TATA)-1F/与ADH1p-R扩增得到145bp的DNA片段ADH1p-4，分别回收两个DNA片段，然后等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ADH1p-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到738bp的DNA片段，该DNA片段是在ADH1p的TATA框下游插入了12bp的marO序列，命名为ADH1p(M2)。其序列如SEQ ID No.4所示。

4、利用引物对ADH1p(CAAT)-1F/ADH1p(TATA)-1R扩增得到474bp的DNA片段ADH1p-5，回收该DNA片段，然后与ADH1p-1和ADH1p-4等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ADH1p-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到732bp的DNA片段，该DNA片段是在ADH1p的CAAT框下游和TATA框下游同时插入了12bp的marO序列，命名为ADH1p(M3)。其序列如SEQ ID No.5所示。

上述启动子的结构示意图见图1。

三、以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的重组质粒构建

(一)利用限制性内切酶HindIII和BamHI分别双酶切PCR扩增到的ADH1p、ADH1p(M1)、ADH1p(M2)、ADH1p(M3)和质粒YCp-GA，分别回收酶切产物。

(二)通过T₄ DNA连接酶连接，分别将ADH1p、ADH1p(M1)、ADH1p(M2)和ADH1p(M3)插入到质粒YCp-GA的HindIII和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒YCp-AGA(含有ADH1p和GFP基因)、YCp-AGA(M1)(含有ADH1p(M1)和GFP基因)、YCp-AGA(M2)(含有ADH1p(M2)和GFP基因)和YCp-AGA(M3)(含有ADH1p(M3)和GFP基因)。

四、不同启动子调控活性分析

(一)酵母菌转化

将质粒YCp50和步骤三构建的重组质粒YCp-AGA、YCp-AGA(M1)、YCp-AGA(M2)和YCp-AGA(M3)通过电转化法(电转条件：1.5kV，50μF，200Ω，3mSec)导入酿酒酵母YS58，然后涂布在SC选择培养基平板上，通过尿嘧啶营养缺陷互补筛选，分别得到空载体对照菌株YS58-V(导入YCp50的重组菌)，重组菌株YS58-AGA(导入YCp-AGA的重组菌)、YS58-AGA(M1)(导入YCp-AGA(M1)的重组菌)、YS58-AGA(M2)(导入YCp-AGA(M2)的重组菌)、YS58-AGA(M3)(导入YCp-AGA(M3)的重组菌)。

(二)绿色荧光蛋白表达水平分析表征启动子活性

将对照菌株YS58-V和重组菌株YS58-AGA、YS58-AGA(M1)、YS58-AGA(M2)、YS58-AGA(M3)分别接种于3ml YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养20h后，5000rpm离心5min收集菌体，再分别将其接种于3ml SC选择培养基中，使接种后的初始OD_600nm为0.4(以SC选择培养基为空白对照)，30℃、200rpm培养24h。

各取1ml菌液，5000rpm离心5min收集菌体，利用0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤两次，然后用1mL磷酸缓冲液悬浮得到悬浮液。

分别取0.2ml菌悬液转移至96孔透明板中，以0.2ml 0.2mol/L磷酸缓冲液作为空白对照，利用TECAN高通量多功能读板仪/酶标仪(型号Tecan Infinite 200PRO)测定OD₆₀₀。

分别取0.2ml菌悬液转移至96孔全黑板中，以0.2ml 0.2mol/L磷酸缓冲液作为空白对照，利用TECAN高通量多功能读板仪/酶标仪(型号Tecan Infinite 200PRO)测定GFP荧光强度(激发波长：488nm，吸收波长：509nm)。

利用比荧光强度(Relative fluorescence unite,RFU)表征GFP的表达水平：

RFU＝(重组菌株的GFP荧光强度/重组菌株的OD_600nm)-(对照菌株的GFP荧光强度/对照菌株的OD_600nm)。

计算相对值时，将菌株YS58-AGA的RFU作为1.0。

实验结果见表1，结果表明，与菌株YS58-AGA相比，带有改造后启动子的菌株YS58-AGA(M1)、YS58-AGA(M1)和YS58-AGA(M1)的GFP表达水平分别降低了18％、50％和80％。可见在酵母菌内源启动子ADH1p中插入异源阻遏蛋白结合序列marO可有效降低启动子的活性，实现弱化启动子调控强度的目的。改造后的启动子ADH1p(M3)、ADH1p(M2)、ADH1p(M1)和内源天然启动子ADH1p调控基因表达的能力呈现2.5、4.1和5.0倍的差异。

表1不同启动子对GFP表达水平的影响

菌株	YS58-AGA	YS58-AGA(M1)	YS58-AGA(M2)	YS58-AGA(M3)
					RFU	537467	441027	268480	107197
相对值	1.0	0.82	0.50	0.20

五、插入marO对酵母菌启动子活性影响的验证

(一)为了验证marO对酵母菌启动子活性影响的普适性，在调控活性明显高于ADH1p的启动子UADH1p中分析了marO的影响。根据GenBank中报道的酿酒酵母翻译延伸因子EF-1编码基因TEF1(GenBank No.KY704476.1)的启动子序列和ADH1p序列设计并合成引物UEE-F(5’-CCAAGCTTCCCCACACACCATAGCT-3’，下划线部分为限制性内切酶HindIII的识别位点)、UEE-R(5’-CCCGGAAACAACAAAAGGATATCGCCTTTTTCGACGAAG-3’)和ADH1p-2F(5’-CTTCGTCGAAAAAGGCGATATCCTTTTGTTGTTTCCGGG-3’)。

(二)PCR扩增构建不同启动子

PCR反应体系：模板DNA 50ng，各引物在反应体系中的浓度均为0.3μmol/L，PrimeSTAR Max Premix(2x)25μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。

PCR反应条件：98℃/3min，循环1次；98℃/10sec,53℃/10sec,72℃/10sec,32次循环；72℃/5min。

1、以酿酒酵母YS58基因组为模板，利用引物对UEE-F/UEE-R扩增到245bp的DNA片段，该DNA片段为TEF1启动子中的上游激活序列，命名为UEE。以质粒YCp-AGA为模板，利用引物对ADH1p-2F/ADH1p-R扩增得到732bp的DNA片段，命名为ADH1p-2。分别回收UEE和ADH1p-2，然后等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对UEE-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到938bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ADH1p的5’端连接了TEF1启动子中的上游激活序列UEE，命名为UADH1p

2、以质粒YCp-AGA(M1)为模板，利用引物对ADH1p-2F/ADH1p-R扩增得到744bp的DNA片段，命名为ADH1p(M1)-2。回收ADH1p(M1)-2，然后与步骤1回收的UEE等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对UEE-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到950bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ADH1p(M1)的5’端连接了TEF1启动子中的上游激活序列UEE，命名为UADH1p(M1)。

3、以质粒YCp-AGA(M2)为模板，利用引物对ADH1p-2F/ADH1p-R扩增得到744bp的DNA片段，命名为ADH1p(M2)-2。回收ADH1p(M2)-2，然后与步骤1回收的UEE等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对UEE-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到950bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ADH1p(M2)的5’端连接了TEF1启动子中的上游激活序列UEE，命名为UADH1p(M2)。

4、以质粒YCp-AGA(M3)为模板，利用引物对ADH1p-2F/ADH1p-R扩增得到756bp的DNA片段，命名为ADH1p(M3)-2。回收ADH1p(M3)-2，然后与步骤1回收的UEE等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对UEE-F/ADH1p-R进行PCR扩增，得到962bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ADH1p(M3)的5’端连接了TEF1启动子中的上游激活序列UEE，命名为UADH1p(M3)。

(三)利用限制性内切酶HindIII和BamHI分别双酶切UADH1p、UADH1p(M1)、UADH1p(M2)和UADH1p(M3)，分别回收酶切产物，并通过T₄ DNA连接酶分别与HindIII和BamHI酶切后的质粒YCp-GA连接，获得重组质粒YCp-UAGA(含有UADH1p和GFP基因)、YCp-UAGA(M1)(含有UADH1p(M1)和GFP基因)、YCp-UAGA(M2)(含有UADH1p(M2)和GFP基因)和YCp-UAGA(M3)(含有UADH1p(M3)和GFP基因))。

(四)如步骤四所述进行酿酒酵母YS58转化，获得重组菌株YS58-UAGA(将YCp-UAGA导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)、YS58-UAGA(M1)(将YCp-UAGA(M1)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)、YS58-UAGA(M2)(将YCp-UAGA(M2)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)、YS58-UAGA(M3)(将YCp-UAGA(M3)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)。如步骤四所述分析比较不同菌株GFP表达水平。结果如表2所示，5’端连接UEE的启动子调控活性显著提高，UADH1p的调控活性是ADH1p的5.44倍；与UADH1p相比，在CAAT框下游插入marO序列对启动子活性没有显著影响，但在TATA框下游插入marO序列可有效降低启动子的活性。

表2不同启动子对GFP表达水平的影响

菌株	YS58-UAGA	YS58-UAGA(M1)	YS58-UAGA(M2)	YS58-UAGA(M3)
					RFU	2921895	2813080	1109361	1059104
相对值	5.44	5.23	2.06	1.97

(六)对不同强度的酵母启动子的分析结果表明插入异源阻遏蛋白结合序列marO可有效降低酵母菌启动子的调控活性，marO对内源启动子调控强度的影响与其整合插入位置密切相关。启动子UADH1p、UADH1p(M1)、UADH1p(M2)、UADH1p(M3)、ADH1p、ADH1p(M1)、ADH1p(M2)和ADH1p(M3)之间调控强度差异可达27倍，为酵母菌代谢通量精确控制提供了有效的调控工具。

实施例2利用marO改造酵母菌ERG1启动子提高细胞角鲨烯含量

一、含有marO的ERG1p系列启动子的构建

(一)根据GenBank中报道的酿酒酵母角鲨烯单加氧酶基因ERG1的启动子ERG1p的核苷酸序列(GenBank No.NC_001139.9)和大肠杆菌阻遏蛋白MarR的DNA结合位点序列设计并合成如下引物(下划线部分分别为限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点；小写字母为marO序列)：

ERG1p-F：5’-CCAAGCTTTGAGCGTGGTTCAGGGCACTCTAC-3’

ERG1p-R：5’-CGGGATCCGACCCTTTTCTCGATATGTTTTTCT-3’

ERG1p(SRE)-1F：5’-GCGATACTGCCGTAGCGGGCCTttgccagggcaaAAAGGCAAGCAGTGTATC-3’ERG1p(SRE)-1R：5’-GATACACTGCTTGCCTTTttgccctggcaaAGGCCCGCTACGGCAGTATCGC-3’ERG1p(SRE)-2F：5’-AGCAGTGTATCGGACAGAttgccagggcaaGCTGATATAACACAATACGC-3’ERG1p(SRE)-2R：5’-GCGTATTGTGTTATATCAGCttgccctggcaaTCTGTCCGATACACTGCT-3’ERG1p(TATA)-F：5’-GTCCAGTATTGAACAATACAttgccagggcaaGGTTATTTCGAACAATTG-3’ERG1p(TATA)-R：5’-CAATTGTTCGAAATAACCttgccctggcaaTGTATTGTTCAATACTGGAC-3’

(二)PCR扩增构建ERG1p系列启动子

提取酿酒酵母YEH-56基因组DNA，以此为模板，利用不同引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：模板DNA 50ng，各引物在反应体系中的浓度均为0.3μmol/L，PrimeSTAR Max Premix(2x)25μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。

PCR反应条件：98℃/3min，循环1次；98℃/10sec,55℃/10sec,72℃/10sec,32次循环；72℃/5min。

1、利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到516bp的ERG1启动子ERG1p，其序列如SEQID No.6所示，其中127-152为甾醇响应元件(Sterol response element,SRE)序列、406-411为TATA框。

2、利用引物对ERG1p-F/ERG1p(SRE)-1R扩增到156bp的DNA片段，命名为ERG1p-1；利用引物对ERG1p(SRE)-1F/ERG1p-R扩增到399bp的DNA片段，命名为ERG1p-2；分别回收ERG1p-1和ERG1p-2，然后等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到502bp的DNA片段，该DNA片段是利用marO序列替换启动子ERG1p中的SRE序列，命名为ERG1p(M1)。其序列如SEQ ID No.7所示。

3、利用引物对ERG1p-F/ERG1p(SRE)-2R扩增到209bp的DNA片段，命名为ERG1p-3；利用引物对ERG1p(SRE)-2F/ERG1p-R扩增到369bp的DNA片段，命名为ERG1p-4；分别回收ERG1p-3和ERG1p-4，然后等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到528bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ERG1p的SRE序列和TATA框序列之间插入了marO序列，命名为ERG1p(M2)。其序列如SEQ ID No.8所示。

4、利用引物对ERG1p-F/ERG1p(TATA)-R扩增到480bp的DNA片段，命名为ERG1p-5；利用引物对ERG1p(TATA)-F/ERG1p-R扩增到98bp的DNA片段，命名为ERG1p-6；分别回收ERG1p-5和ERG1p-6，然后等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到528bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ERG1p的TATA框下游插入了marO序列，命名为ERG1p(M3)。其序列如SEQ ID No.9所示。

5、以步骤2得到的ERG1p(M1)为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p(SRE)-2R扩增到195bp的DNA片段，命名为ERG1p-7；回收ERG1p-7，然后与步骤3获得的ERG1p-4等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到514bp的DNA片段，该DNA片段是利用marO序列替换启动子ERG1p中的SRE序列，同时在其邻近下游插入另一个拷贝的marO序列，命名为ERG1p(M4)。其序列如SEQ ID No.10所示。

6、以步骤2得到的ERG1p(M1)为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p(TATA)-R扩增到466bp的DNA片段，命名为ERG1p-8；回收ERG1p-8，然后与步骤4获得的ERG1p-6等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到514bp的DNA片段，该DNA片段是利用marO序列替换启动子ERG1p中的SRE序列，同时在TATA框下游插入另一个拷贝的marO序列，命名为ERG1p(M5)。其序列如SEQ ID No.11所示。

7、以步骤3得到的ERG1p(M2)为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p(TATA)-R扩增到492bp的DNA片段，命名为ERG1p-9；回收ERG1p-9，然后与步骤4获得的ERG1p-6等摩尔混合。以混合液为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R扩增到540bp的DNA片段，该DNA片段是在启动子ERG1p的SRE序列下游和TATA框下游分别插入一个拷贝的marO序列，命名为ERG1p(M6)。其序列见序列如SEQ ID No.12所示。

上述启动子序列比对结果如图2所示。

二、ERG1p系列启动子调控强度分析

(一)重组质粒的构建

利用HindIII和BamHI分别双酶切ERG1p、ERG1p(M1)、ERG1p(M2)、ERG1p(M3)、ERG1p(M4)、ERG1p(M5)和ERG1p(M6)，回收相应的酶切产物，然后在T₄ DNA连接酶的作用下分别与HindIII和BamHI酶切后的质粒YCp-GA连接，获得重组质粒YCp-EGA(含有ERG1p和GFP基因)、YCp-EGA(M1)(含有ERG1p(M1)和GFP基因)、YCp-EGA(M2)(含有ERG1p(M2)和GFP基因)、YCp-EGA(M3)(含有ERG1p(M3)和GFP基因)、YCp-EGA(M4)(含有ERG1p(M4)和GFP基因)、YCp-EGA(M5)(含有ERG1p(M5)和GFP基因)和YCp-EGA(M6)(含有ERG1p(M6)和GFP基因)。

(二)酵母菌转化

如实施例1步骤四所述进行酵母菌转化，将重组质粒YCp-EGA、YCp-EGA(M1)、YCp-EGA(M2)、YCp-EGA(M3)、YCp-EGA(M4)、YCp-EGA(M5)和YCp-EGA(M6)分别转化导入酿酒酵母YS58，得到重组菌株YE1(将YCp-EGA导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)，YE(M1)(将YCp-EGA(M1)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)，YE(M2)(将YCp-EGA(M2)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)，YE(M3)(将YCp-EGA(M3)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)，YE(M4)(将YCp-EGA(M4)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)，YE(M5)(将YCp-EGA(M5)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)和YE(M6)(将YCp-EGA(M6)导入酿酒酵母YS58得到的重组菌)。

(三)如实施例1步骤四所述分析比较不同菌株GFP表达水平，用于表征不同ERG1p系列启动子的调控强度，将带有原始启动子ERG1p的质粒YCp-EGA转化的菌株YE1的RFU作为1.0。

结果如表3所示，无论采用替换还是插入的策略在启动子ERG1p的不同位点整合marO序列均可有效降低启动子的活性，其中启动子ERG1p(M4)和ERG1p(M5)活性最低，仅为原始启动子ERG1p的26％。上述结果进一步证明marO序列在下调酵母菌启动子强度的有效性。在ERG1p(M4)和ERG1p(M5)中，原始启动子的SRE序列被marO序列替换，不但可以从转录水平降低基因的表达水平，而且可以解除甾醇合成代谢通量降低对ERG1转录的反馈激活，因此在降低甾醇合成代谢通量中具有更大的应用优势。

表3 ERG1p系列启动子强度分析

三、启动子ERG1p(M5)替换酵母菌基因组上ERG1p提高细胞角鲨烯含量

(一)质粒YEp-GMZC的构建

1、根据GenBank中报道的酿酒酵母半乳糖激酶基因GAL1启动子GAL1p的核苷酸序列(GenBank No.Z35889.1)及质粒pEBCMZC的核苷酸序列分别设计如下引物(下划线部分为限制性内切酶SacI和BamHI的识别位点，小写字母为同源臂序列)：

GAL1p-F：5’-CGGAGCTCTGCTCATTGCTATAT-3’

GAL1p-R：5’-atcgggtacgtatcggcttaccatCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGT-3’

mazF-F：5’-acctctatactttaacgtcaaggagATGGTAAGCCGATACGTACCCGAT-3’

AOX1t-R：5’-acattttgaagctatggtgtgtgggGCACAAACGAAGGTCTCACTTAATC-3’

TEF1p-F：5’-gattaagtgagaccttcgtttgtgcCCCACACACCATAGCTTCAAAATGT-3’

CYC1t-R：5’-CGGGATCCGCAAATTAAAGCCTTCG-3’

2、分别以酿酒酵母YS58的基因组DNA和质粒pEBCMZC为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系：基因组DNA 50ng，各引物在反应体系中的浓度均为0.3μmol/L，PrimeSTAR Max Premix(2x)25μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。

PCR反应条件：98℃/3min，循环1次；98℃/10sec,55℃/10sec,72℃/20sec,32次循环；72℃/5min。

利用引物对GAL1p-F/GAL1p-R从酿酒酵母YS58的基因组PCR扩增到478bp的GAL1启动子序列，命名为GAL1p。

以质粒pEBCMZC为模板，利用引物对mazF-F/AOX1t-R扩增得到791bp DNA片段，命名为mazF；利用引物对TEF1p-F/CYC1t-R扩增得到1200bp DNA片段，命名为zeoR。

DNA片段GAL1p、mazF和zeoR等摩尔混合，以此为模板，利用引物对GAL1p-F/CYC1t-R扩增得到2370bp DNA片段,命名为G-mazF-zeoR。

3、重组质粒的构建

利用限制性内切酶BamHI和SacI分别双酶切PCR扩增到的G-mazF-zeoR和质粒YEp352，分别回收酶切产物。

通过T₄ DNA连接酶连接，将G-mazF-zeoR插入到质粒YEp352的BamHI和SalI酶切位点之间，得到重组质粒YEp-GMZC。

(二)ERG1p(M5)替换盒的构建

1、依据GenBank中酿酒酵母角鲨烯单加氧酶基因ERG1的启动子ERG1p的核苷酸序列(GenBank No.NC_001139.9)和质粒YEp-GMZC中的筛选标记G-mazF-zeoR序列，分别设计合成如下引物：

5Arm-F：5’-GACAATGACAAGTTTTGGAGT-3’

5Arm-R：5’-gctcgaattcgtaatcatggtcatCCCGCTACGGCAGTATCGCATT-3’

MZ-F：5’-atgaccatgattacgaattcgagc-3’

MZ-R：5’-GCAAATTAAAGCCTTCGAGC-3’

ERG1p-1F：5’-GCTCGAAGGCTTTAATTTGCTGAGCGTGGTTCAGGGCACTCTAC-3’

ERG1p-1R：5’-GACCCTTTTCTCGATATGTTTTTCT-3’

ERG1p-SRE：5’-TATAGCTCGGCCGAGCTCG-3’

2、通过PCR构建ERG1p(M5)替换盒

PCR反应体系及反应条件如实施例1所述。

以酿酒酵母YEH-56基因组DNA为模板，利用引物对5Arm-F/5Arm-R扩增到464bp的DNA序列，该序列为ERG1p上游序列，命名为E1UP。

以质粒YEp-GMZC为模板，利用引物对MZ-F/MZ-R扩增到2416bp的DNA序列，该序列为半乳糖诱导启动子GAL1p调控的mazF表达盒和zeoR表达盒，命名为GMZ。其中zeoR表达盒可以使酵母菌产生Zeocin抗性，用作酵母菌转化的正向筛选标记；而半乳糖诱导的mazF表达盒可以使酵母菌产生致死效应，用作敲除筛选标记的反向筛选。

以质粒YCp-EGA(M5)为模板，利用引物对ERG1p-1F/ERG1p-1R扩增到518bp的DNA序列，该序列具有20bp与GMZ重叠的序列及498bp的ERG1p(M5)(SEQ ID No.13的第2857-3354位核苷酸，SEQ ID No.11的第9-506位核苷酸)，命名为Z-ERG1p(M5)。将PCR扩增到的ERG1p-UP、GMZ和Z-ERG1p(M5)等摩尔混合，以此混合物为模板，利用引物对5Arm-F/ERG1p-1R扩增到3354bp的DNA片段，即ERG1p(M5)替换盒，命名为E1UP-GMZ-ERG1p(M5)。其中筛选标记GMZ与上下游的E1UP和ERG1p(M5)之间有115bp的重叠序列。E1UP-GMZ-ERG1p(M5)的序列如SEQID No.13所示。SEQ ID No.13的第326-440位和第2857-2971位为上述115bp的重叠序列。

(三)基因组上启动子ERG1p的替换

1、按实施例1步骤四所述电击转化法，将ERG1p(M5)替换盒E1UP-GMZ-ERG1p(M5)导入到酿酒酵母YEH-56，转化后菌液涂布在含200μg/mL Zeocin的YPD培养基平板上，30℃静置培养。只有通过双交换同源重组使基因组上的ERG1启动子序列被E1UP-GMZ-ERG1p(M5)替换才能使酵母细胞获得Zeocin抗性形成单菌落。

2、将Zeocin抗性单菌落接种于2ml SC诱导培养基中，30℃、200rpm培养6h，将菌液涂布于SC诱导培养基固体平板上，30℃静置培养。培养基中的半乳糖诱导mazF表达产生毒性蛋白MazF对酵母菌产生致死效应，因此只有其上下游的E1UP和ERG1p(M5)之间通过115bp的重叠序列发生同源重组将基因组上的GMZ敲除后的酵母细胞才能生长。

3、提取SC诱导培养基平板上生长的单菌落的基因组，以此为模板，利用引物对ERG1p-SRE/ERG1p-1R进行PCR分析，所检测的单菌落均没有PCR产物，而以酿酒酵母YEH-56基因组为模板可以扩增到379bp的DNA片段，表明检测的单菌落基因组中引物ERG1p-SRE对应的序列发生了缺失。

分别以其中三个单菌落的基因组及酿酒酵母YEH-56的基因组为模板，利用引物对ERG1p-F/ERG1p-R进行PCR扩增，均得到约0.5kb的DNA片段。序列分析表明来源于酿酒酵母YEH-56的DNA片段为ERG1p，来源于三个单菌落的DNA片段具有与ERG1p(M5)完全相同的序列。上述结果表明筛选到的单菌落基因组上的ERG1启动子已被替换为带有marO序列的ERG1p(M5)，相应的重组菌株命名为YEH56-E(M5)。

(四)改造ERG1启动子对酵母细胞角鲨烯含量的影响

1、将步骤(二)制备的重组菌株YEH56-E(M5)和对照菌株酿酒酵母YEH-56分别接种于5ml YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养20h，按体积比10％的接种量分别转接至45mlYPD液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，收集发酵液。分别测定细胞生物量和角鲨烯含量。实验设三次重复，计算平均值。

2、准确取40mL发酵液，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗涤2次后5000rpm离心5min收集菌体，称重，计算湿菌体重量。准确称取0.5g湿菌体，在65℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算菌体的干湿比，细胞生物量为每升发酵液中干菌体的克数(g/L)。结果如表4所示，与对照菌株酿酒酵母YEH-56相比，重组菌株YEH56-E(M5)的细胞生物量降低了25.5％，表明利用改造后启动子ERG1p(M5)降低角鲨烯单加氧酶基因ERG1的表达，对细胞生长产生了一些不利的影响。

3、角鲨烯标准曲线：将角鲨烯标准品溶解于丙酮中，并配置成浓度分别为0.03mg/mL，0.07mg/mL，0.13mg/mL，0.27mg/mL，0.4mg/mL，0.54mg/mL的标准溶液。利用Aglient1260infinity对标准品进行高效液相色谱(HPLC)分析(色谱柱Plus-C18，柱温40℃；流动相为乙腈，流速1mL/min；检测器为UV/VIS，195nm；进样量10μL)。实验重复三次，计算平均值，绘制峰面积与角鲨烯浓度之间的标准曲线，获得函数公式如下：

角鲨烯浓度(mg/mL)＝1.34×10^-5×峰面积

4、准确称取0.1g湿菌体于7mL离心管中，加入2mL 3M HCl混匀，95℃水浴处理5min，再冰浴10min，12000rpm离心3min，沉淀的菌体用无菌水洗2次后12000rpm离心3min收集菌体；向菌体中加入1ml丙酮，震荡萃取10min，12000rpm离心3min收集上清液；上清液用0.22μm滤膜过滤，过滤后样品按照制作标准曲线所述方法进行HPLC分析，计算角鲨烯含量。细胞角鲨烯含量为每克干细胞所含角鲨烯的毫克数(mg/g)。结果如表4所述,重组菌株YEH56-E(M5)的细胞角鲨烯含量是对照菌株酿酒酵母YEH-56的45.28倍，利用本发明所述启动子ERG1p(M5)控制ERG1表达可以显著提高酵母细胞角鲨烯含量。

5、上述发酵培养和分析条件下，重组菌株YEH56-E(M5)角鲨烯产量达到420.29mg/L发酵液，是对照菌株YEH-56的33.76倍。菌株YEH56-E(M5)具有很好的工业化应用前景。

表4重组菌株SQE(M5)与对照菌株细胞生长及角鲨烯含量分析

菌株	生物量(g/L)	细胞角鲨烯含量(g/L)	角鲨烯产量(mg/L)
				YEH-56	6.52	1.91	12.45
YEH56-E(M5)	4.86	86.48	420.29

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 调控强度弱化的酵母菌启动子及其在代谢通量调控中的应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

ttgccagggc aa 12

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccaagctt gatatccttt tgttgtttcc gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg 60

gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat aataccttcg ttggtctccc taacatgtag 120

gtggcggagg ggagatatac aatagaacag ataccagaca agacataatg ggctaaacaa 180

gactacacca attacactgc ctcattgatg gtggtacata acgaactaat actgtagccc 240

tagacttgat agccatcatc atatcgaagt ttcactaccc tttttccatt tgccatctat 300

tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt 360

tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt 420

aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa 480

gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca cgcacactac tctctaatga gcaacggtat 540

acggccttcc ttccagttac ttgaatttga aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca 600

agtataaata gacctgcaat tattaatctt ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt 660

tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt tcaagctata ccaagcatac aatcaactgg 720

atcccg 726

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccaagctt gatatccttt tgttgtttcc gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg 60

gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat aataccttcg ttggtctccc taacatgtag 120

gtggcggagg ggagatatac aatagaacag ataccagaca agacataatg ggctaaacaa 180

gactacacca atttgccagg gcaatacact gcctcattga tggtggtaca taacgaacta 240

atactgtagc cctagacttg atagccatca tcatatcgaa gtttcactac cctttttcca 300

tttgccatct attgaagtaa taataggcgc atgcaacttc ttttcttttt ttttcttttc 360

tctctccccc gttgttgtct caccatatcc gcaatgacaa aaaaatgatg gaagacacta 420

aaggaaaaaa ttaacgacaa agacagcacc aacagatgtc gttgttccag agctgatgag 480

gggtatctcg aagcacacga aactttttcc ttccttcatt cacgcacact actctctaat 540

gagcaacggt atacggcctt ccttccagtt acttgaattt gaaataaaaa aaagtttgct 600

gtcttgctat caagtataaa tagacctgca attattaatc ttttgtttcc tcgtcattgt 660

tctcgttccc tttcttcctt gtttcttttt ctgcacaata tttcaagcta taccaagcat 720

acaatcaact ggatcccg 738

<210> 4

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccccaagctt gatatccttt tgttgtttcc gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg 60

gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat aataccttcg ttggtctccc taacatgtag 120

gtggcggagg ggagatatac aatagaacag ataccagaca agacataatg ggctaaacaa 180

gactacacca attacactgc ctcattgatg gtggtacata acgaactaat actgtagccc 240

tagacttgat agccatcatc atatcgaagt ttcactaccc tttttccatt tgccatctat 300

tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt 360

tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt 420

aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa 480

gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca cgcacactac tctctaatga gcaacggtat 540

acggccttcc ttccagttac ttgaatttga aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca 600

agtataaatt tgccagggca aagacctgca attattaatc ttttgtttcc tcgtcattgt 660

tctcgttccc tttcttcctt gtttcttttt ctgcacaata tttcaagcta taccaagcat 720

acaatcaact ggatcccg 738

<210> 5

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccccaagctt gatatccttt tgttgtttcc gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg 60

gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat aataccttcg ttggtctccc taacatgtag 120

gtggcggagg ggagatatac aatagaacag ataccagaca agacataatg ggctaaacaa 180

gactacacca atttgccagg gcaatacact gcctcattga tggtggtaca taacgaacta 240

atactgtagc cctagacttg atagccatca tcatatcgaa gtttcactac cctttttcca 300

tttgccatct attgaagtaa taataggcgc atgcaacttc ttttcttttt ttttcttttc 360

tctctccccc gttgttgtct caccatatcc gcaatgacaa aaaaatgatg gaagacacta 420

aaggaaaaaa ttaacgacaa agacagcacc aacagatgtc gttgttccag agctgatgag 480

gggtatctcg aagcacacga aactttttcc ttccttcatt cacgcacact actctctaat 540

gagcaacggt atacggcctt ccttccagtt acttgaattt gaaataaaaa aaagtttgct 600

gtcttgctat caagtataaa tttgccaggg caaagacctg caattattaa tcttttgttt 660

cctcgtcatt gttctcgttc cctttcttcc ttgtttcttt ttctgcacaa tatttcaagc 720

tataccaagc atacaatcaa ctggatcccg 750

<210> 6

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggccttcgt atagctcggc cgagctcgta caaaaggcaa gcagtgtatc ggacagagct 180

gatataacac aatacgctcg tagtcgatgc atgccgtggc tgctctcggt cgggtataag 240

tcttagacaa tagtcttacc tcgcatgtat aataaatctt ttgtatttaa tctattatat 300

gtttctatgc ttttttttcc tattgttgtt tgcttttcct tttccttatt tctttctagc 360

ttctaatttt ctttcttttt tttttttttt tcattgaaaa ttatatataa atatatatat 420

cagaacaatt gtccagtatt gaacaataca ggttatttcg aacaattgaa aaaaaaaaat 480

cacagaaaaa catatcgaga aaagggtcgg atcccg 516

<210> 7

<211> 502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggcctttgc cagggcaaaa aggcaagcag tgtatcggac agagctgata taacacaata 180

cgctcgtagt cgatgcatgc cgtggctgct ctcggtcggg tataagtctt agacaatagt 240

cttacctcgc atgtataata aatcttttgt atttaatcta ttatatgttt ctatgctttt 300

ttttcctatt gttgtttgct tttccttttc cttatttctt tctagcttct aattttcttt 360

cttttttttt tttttttcat tgaaaattat atataaatat atatatcaga acaattgtcc 420

agtattgaac aatacaggtt atttcgaaca attgaaaaaa aaaaatcaca gaaaaacata 480

tcgagaaaag ggtcggatcc cg 502

<210> 8

<211> 528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggccttcgt atagctcggc cgagctcgta caaaaggcaa gcagtgtatc ggacagattg 180

ccagggcaag ctgatataac acaatacgct cgtagtcgat gcatgccgtg gctgctctcg 240

gtcgggtata agtcttagac aatagtctta cctcgcatgt ataataaatc ttttgtattt 300

aatctattat atgtttctat gctttttttt cctattgttg tttgcttttc cttttcctta 360

tttctttcta gcttctaatt ttctttcttt tttttttttt tttcattgaa aattatatat 420

aaatatatat atcagaacaa ttgtccagta ttgaacaata caggttattt cgaacaattg 480

aaaaaaaaaa atcacagaaa aacatatcga gaaaagggtc ggatcccg 528

<210> 9

<211> 528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggccttcgt atagctcggc cgagctcgta caaaaggcaa gcagtgtatc ggacagagct 180

gatataacac aatacgctcg tagtcgatgc atgccgtggc tgctctcggt cgggtataag 240

tcttagacaa tagtcttacc tcgcatgtat aataaatctt ttgtatttaa tctattatat 300

gtttctatgc ttttttttcc tattgttgtt tgcttttcct tttccttatt tctttctagc 360

ttctaatttt ctttcttttt tttttttttt tcattgaaaa ttatatataa atatatatat 420

cagaacaatt gtccagtatt gaacaataca ttgccagggc aaggttattt cgaacaattg 480

aaaaaaaaaa atcacagaaa aacatatcga gaaaagggtc ggatcccg 528

<210> 10

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggcctttgc cagggcaaaa aggcaagcag tgtatcggac agattgccag ggcaagctga 180

tataacacaa tacgctcgta gtcgatgcat gccgtggctg ctctcggtcg ggtataagtc 240

ttagacaata gtcttacctc gcatgtataa taaatctttt gtatttaatc tattatatgt 300

ttctatgctt ttttttccta ttgttgtttg cttttccttt tccttatttc tttctagctt 360

ctaattttct ttcttttttt tttttttttc attgaaaatt atatataaat atatatatca 420

gaacaattgt ccagtattga acaatacagg ttatttcgaa caattgaaaa aaaaaaatca 480

cagaaaaaca tatcgagaaa agggtcggat cccg 514

<210> 11

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggcctttgc cagggcaaaa aggcaagcag tgtatcggac agagctgata taacacaata 180

cgctcgtagt cgatgcatgc cgtggctgct ctcggtcggg tataagtctt agacaatagt 240

cttacctcgc atgtataata aatcttttgt atttaatcta ttatatgttt ctatgctttt 300

ttttcctatt gttgtttgct tttccttttc cttatttctt tctagcttct aattttcttt 360

cttttttttt tttttttcat tgaaaattat atataaatat atatatcaga acaattgtcc 420

agtattgaac aatacattgc cagggcaagg ttatttcgaa caattgaaaa aaaaaaatca 480

cagaaaaaca tatcgagaaa agggtcggat cccg 514

<210> 12

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccaagctttg agcgtggttc agggcactct acgggatcgt ggcgaatggg aatcgttctg 60

caagctcttc taccaaacca tcggcgaatt tgcgtcgctt taatgcgata ctgccgtagc 120

gggccttcgt atagctcggc cgagctcgta caaaaggcaa gcagtgtatc ggacagattg 180

ccagggcaag ctgatataac acaatacgct cgtagtcgat gcatgccgtg gctgctctcg 240

gtcgggtata agtcttagac aatagtctta cctcgcatgt ataataaatc ttttgtattt 300

aatctattat atgtttctat gctttttttt cctattgttg tttgcttttc cttttcctta 360

tttctttcta gcttctaatt ttctttcttt tttttttttt tttcattgaa aattatatat 420

aaatatatat atcagaacaa ttgtccagta ttgaacaata cattgccagg gcaaggttat 480

ttcgaacaat tgaaaaaaaa aaatcacaga aaaacatatc gagaaaaggg tcggatcccg 540

<210> 13

<211> 3354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacaatgaca agttttggag tcttgtcgaa tactactatg accgcttttt agaatcgtac 60

gacaacggtg accacttgat tggtctgggg gtcctacaac ttgattttat cgttgaaaac 120

aagaatatag acagccttct tgccaactct tatttgcacc agcaaagagg cggtgcaatc 180

atcagtaata caggacttgt ctcgcaagat acgaccaagc cgtactacgt tcgggattta 240

atcttctcgc agtctgcagg cgccttgaga tttgcgttcg gcctaaacgt ttgctccaca 300

aacgtgaatg gtatgaacat ggacatgagc gtggttcagg gcactctacg ggatcgtggc 360

gaatgggaat cgttctgcaa gctcttctac caaaccatcg gcgaatttgc gtcgctttaa 420

tgcgatactg ccgtagcggg atgaccatga ttacgaattc gagctcgcat gcccgcggtg 480

ctcattgcta tattgaagta cggattagaa gccgccgagc gggtgacagc cctccgaagg 540

aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt tcctgaaacg cagatgtgcc 600

tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac tagcttttat ggttatgaag 660

aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa tgaacgaatc aaattaacaa 720

ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc tggggtaatt aatcagcgaa 780

gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa aactgcataa ccactttaac 840

taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc aaatgtaata aaagtatcaa 900

caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg agatggtaag ccgatacgta 960

cccgatatgg gcgatctgat ttgggttgat tttgacccga caaaaggtag cgagcaagct 1020

ggacatcgtc cagctgttgt cctgagtcct ttcatgtaca acaacaaaac aggtatgtgt 1080

ctgtgtgttc cttgtacaac gcaatcaaaa ggatatccgt tcgaagttgt tttatccggt 1140

caggaacgtg atggcgtagc gttagctgat caggtaaaaa gtatcgcctg gcgggcaaga 1200

ggagcaacga agaaaggaac agttgcccca gaggaattac aactcattaa agccaaaatt 1260

aacgtactga ttgggtagtc tagaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc 1320

cgtcgaccat catcatcatc atcattgagt tttagcctta gacatgactg ttcctcagtt 1380

caagttgggc acttacgaga agaccggtct tgctagattc taatcaagag gatgtcagaa 1440

tgccatttgc ctgagagatg caggcttcat ttttgatact tttttatttg taacctatat 1500

agtataggat tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg agcttgctcc tgatcagcct 1560

atctcgcagc tgatgaatat cttgtggtag gggtttggga aaatcattcg agtttgatgt 1620

ttttcttggt atttcccact cctcttcaga gtacagaaga ttaagtgaga ccttcgtttg 1680

tgcggatccc ccacacacca tagcttcaaa atgtttctac tcctttttta ctcttccaga 1740

ttttctcgga ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca gcatactaaa 1800

ttttccctct ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga 1860

aaaaagagac cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag gcaataaaaa tttttatcac 1920

gtttcttttt cttgaaattt ttttttttag tttttttctc tttcagtgac ctccattgat 1980

atttaagtta ataaacggtc ttcaatttct caagtttcag tttcattttt cttgttctat 2040

tacaactttt tttacttctt gttcattaga aagaaagcat agcaatctaa tctaagggcg 2100

gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga 2160

actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg 2220

gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact 2280

tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg 2340

tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt 2400

ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg 2460

gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact 2520

tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtcc gacggcggcc cacgggtccc aggcctcgga 2580

gatccgtccc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca 2640

cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag 2700

gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt 2760

tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt 2820

gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgctgag cgtggttcag ggcactctac 2880

gggatcgtgg cgaatgggaa tcgttctgca agctcttcta ccaaaccatc ggcgaatttg 2940

cgtcgcttta atgcgatact gccgtagcgg gcctttgcca gggcaaaaag gcaagcagtg 3000

tatcggacag agctgatata acacaatacg ctcgtagtcg atgcatgccg tggctgctct 3060

cggtcgggta taagtcttag acaatagtct tacctcgcat gtataataaa tcttttgtat 3120

ttaatctatt atatgtttct atgctttttt ttcctattgt tgtttgcttt tccttttcct 3180

tatttctttc tagcttctaa ttttctttct tttttttttt tttttcattg aaaattatat 3240

ataaatatat atatcagaac aattgtccag tattgaacaa tacattgcca gggcaaggtt 3300

atttcgaaca attgaaaaaa aaaaatcaca gaaaaacata tcgagaaaag ggtc 3354

Claims (8)

1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为在酵母内源启动子的CAAT框和TATA框之间插入异源顺式调控元件、和/或在所述酵母内源启动子的TATA框的下游插入异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子；或者

所述DNA分子为用异源顺式调控元件替换所述酵母内源启动子中的甾醇响应元件、和/或在所述酵母内源启动子的TATA框下游插入异源顺式调控元件、和/或在所述酵母内源启动子的甾醇响应元件和TATA框之间插入异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子；

所述异源顺式调控元件是大肠杆菌阻遏蛋白MarR的DNA结合序列marO，所述marO的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为下述P1)、P2)、P3)、P4)的任一种：

P1)所述DNA分子中，所述酵母内源启动子为酿酒酵母角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子ERG1p，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

P2)所述DNA分子为ERG1p-M5、ERG1p-M4、ERG1p-M1、ERG1p-M6、ERG1p-M3或ERG1p-M2；

所述ERG1p-M5的序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.11的第9-506位所示，

所述ERG1p-M4的序列如SEQ ID No.10或SEQ ID No.10的第9-506位所示，

所述ERG1p-M1的序列如SEQ ID No.7或SEQ ID No.7的第9-494位所示，

所述ERG1p-M6的序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.12的第9-532位所示，

所述ERG1p-M3的序列如SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第9-520位所示，

所述ERG1p-M2的序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.8的第9-520位所示，

P3)所述DNA分子中，所述酵母内源启动子为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因ADH1启动子ADH1p，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

P4)所述DNA分子为ADH1p-M3、ADH1p-M2或ADH1p-M1；

所述ADH1p-M3的序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.5的第11-742位所示，

所述ADH1p-M2的序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.4的第11-730位所示，

所述ADH1p-M1的序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第11-730位所示。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1)至B3)中的任一种：

B1)含有权利要求1-2中任一所述的DNA分子的重组DNA分子，

B2)含有权利要求1-2中任一所述的DNA分子的重组载体，

B3)含有权利要求1-2中任一所述的DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述重组DNA分子的核苷酸序列如SEQID No.13所示。

5.权利要求1-2中任一所述的DNA分子在作为启动子中的应用。

6.权利要求1-2中任一所述的DNA分子或权利要求3-4所述的生物材料中所述的重组DNA分子在制备重组微生物中的应用。

7.一种制备角鲨烯的方法，其特征在于，所述方法使用重组酵母生产角鲨烯，所述重组酵母为将酿酒酵母基因组中的角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子ERG1p替换为权利要求2中P1)或P2)所述的DNA分子得到的重组菌。

8.权利要求1-2中任一所述的DNA分子在酵母代谢工程改造中的应用。

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