CN111118088A - 一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法 - Google Patents

一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法。本发明公开的鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法，包括以下步骤：将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在发酵培养基中进行发酵培养，发酵前期将发酵液的pH控制在5.0‑8.5，发酵罐压力控制在0.01‑0.035MPa，发酵中期将发酵液的pH控制在5.0‑6.5，发酵罐压力控制在0.015‑0.05MPa，发酵后期将发酵液的pH控制在5.0‑7.5，发酵罐压力控制在0.015‑0.04MPa。本发明提供的发酵工艺可以有效解决鼠李糖脂发酵过程中的起泡引起的逃液问题，同时后分离工艺无需考虑消泡剂的去除，该发酵工艺操作简单，适合工业化生产鼠李糖脂。

Description

一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法。
背景技术
鼠李糖脂是一种无毒，无污染，能生物降解，具有良好的选择性和专一性的阴离子表面活性剂，具有良好的表面活性，在医药、食品、化妆品、环境保护等众多工业领域有独特的应用前景。虽然其应用性能良好，但由于它是一种阴离子表面活性剂，需在通气搅拌条件下进行好氧发酵，而在通气搅拌发酵过程中会产生大量泡沫，过多的泡沫是阻碍发酵正常进行的一个重要因素；此外若泡沫控制方法不当，泡沫溢出会带出菌体细胞和发酵液，容易染菌。特别当发酵产物是表面活性剂，发酵过程中产生的泡沫更稳定，限制了整个行业的工业化生产。目前常用的消泡方法有物理消泡法、机械消泡法和化学消泡法。物理消泡法和机械消泡法的消泡效果经多个团队实验发现效果并不明显。化学消泡法即加入消泡剂，消泡剂选用不当可能会影响菌体代谢，而且在后处理过程中消泡剂难以分离，因此需要开发一种抑制泡沫的工艺。
工业上鼠李糖脂产量较高的工艺主要采用植物油为碳源，原因是植物油在作为碳源的同时也可作为消泡剂。但利用植物油作消泡剂存在一定的风险，在大量泡沫存在的情况下，植物油用量增加会导致发酵液含油量提高，发酵液易乳化，难以分离。发酵过程中亦有通过乙醇进行消泡的工艺，但乙醇的加入会导致菌体代谢异常，影响产量。因此，鼠李糖脂发酵过程需要一种可减少泡沫且不影响目标产物产量的方法。
目前，鼠李糖脂主要是利用铜绿假单胞菌通过液态发酵的方法获得。由于鼠李糖脂是一种良好的生物表面活性剂，具有优良的发泡、乳化等作用，因此发酵罐内会产生大量体积微小、结构致密的泡沫，可能造成泡沫逃液现象。降低发酵罐装液量可在一定程度上缓解上述问题，但会降低发酵罐的有效利用体积，影响发酵效率。因此开发一种有效的抑制泡沫方法，可减少鼠李糖脂发酵过程中的起泡量，并能提高设备利用率，提升生产效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是鼠李糖脂发酵过程中起泡严重引起的逃液问题。
为解决上述技术问题，本发明根据鼠李糖脂发酵过程中的起泡情况，将整个发酵周期分为三个阶段，分别为发酵前期、发酵中期和发酵后期，通过在不同的发酵阶段调节发酵液pH大小和发酵罐压力的高低，抑制发酵过程中泡沫的产生。
在对铜绿假单胞菌进行发酵培养生产鼠李糖脂的发酵前期，需要大量通气和高搅拌转速来保证菌种对氧气的需求，利于菌体生长。发酵中期是鼠李糖脂的快速合成阶段，此时鼠李糖脂的存在会导致在搅拌和通气的条件下产生大量泡沫，此外发酵液粘度略有增加，导致产生的泡沫更加稳定。发酵过程中抑制泡沫的工艺一般有两种；通过连接溢流罐或加入化学消泡剂。前者泡沫进入溢流罐液化后再采用蠕动泵将其泵回发酵罐中继续发酵，但此方法泡沫液化慢，因此仍需加入化学消泡剂，并会增加染菌风险。在发酵后期，菌体生长速度降低，鼠李糖脂含量较高，发酵罐的逃液现象更为明显，此时需要控制pH在中性范围，由于菌体处于老化状态，偏酸性或偏碱性环境均可能会引起菌体自溶。
具体地，本发明提供一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法，包括以下步骤：将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在发酵培养基中进行发酵培养，发酵前期将发酵液的pH控制在5.0-8.5，发酵罐压力控制在0.01-0.035MPa，发酵中期将发酵液的pH控制在5.0-6.5，发酵罐压力控制在0.015-0.05MPa，发酵后期将发酵液的pH控制在5.0-7.5，发酵罐压力控制在0.015-0.04MPa。
在优化发酵工艺的过程中发现，发酵前期pH控制在6.0-8.0，菌体生长速度较快，菌体浓度较高。因此，在一些实施方案中，在上述方法中，所述发酵培养中，发酵前期将发酵液的pH控制在6.0-8.0。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵培养中，发酵前期将发酵罐压力控制在0.015-0.025MPa。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵培养中，发酵中期将发酵液的pH控制在5.0-5.8，可明显抑制发酵过程中泡沫的产生，无需加入消泡剂。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵培养中，发酵中期将发酵罐压力控制在0.045-0.05MPa。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵培养中，发酵后期将发酵液的pH控制在6.0-7.0。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵培养中，发酵后期将发酵罐压力控制在0.02-0.03MPa。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵前期为自发酵开始第0-6h。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵中期为自发酵开始第6-96h。
在一些实施方案中，在上述任一所述的方法中，所述发酵后期为自发酵开始第96-240h。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵前期的工艺参数如下：自发酵开始第0-6h，发酵液pH 5.0-8.5，发酵罐压力0.01-0.035MPa。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵中期的工艺参数如下：自发酵开始第6-96h，pH 5.0-6.5，发酵罐压力0.015-0.05MPa。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵后期的工艺参数如下：自发酵开始第96-240h，pH 5.0-7.5，发酵罐压力0.015-0.04MPa。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵前期的工艺参数如下：自发酵开始第0-6h，发酵液pH 6.0-8.0，发酵罐压力0.015-0.025MPa。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵中期的工艺参数如下：自发酵开始第6-96h，pH 5.0-5.8，发酵罐压力0.045-0.05MPa。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵后期的工艺参数如下：自发酵开始第96-240h，pH 6.0-7.0，发酵罐压力0.02-0.03MPa。
对于整个发酵工艺，可以采用7L发酵罐，装液量50％，发酵温度30℃，搅拌转速为200-400rpm，初始通气量为0.5-1.5vvm，接种后发酵液的初始OD600为3-5。发酵培养基可以为任何适于培养铜绿假单胞菌的培养基，例如可以具有如下组成：菜籽油70g/L、甘油20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、硝酸钠10g/L、Na2HPO4 4g/L、KH2PO4 4g/L、CaCl2 0.4g/L、MgSO42g/L，余量为水。
本发明的鼠李糖脂的产率可维持在0.5g/L/h以上。
本发明根据菌体代谢阶段所需的最适pH不同，分阶段调控发酵过程中的pH值，同时结合起泡量调整发酵罐压力，通过两者的协同作用，可明显减少发酵过程中的起泡量，提高发酵罐利用效率。而且整个发酵过程中无需加入化学消泡剂，解决了后期产品难以分离的问题。同时也无需连接溢流罐，可避免碳源等疏水性底物随着泡沫溢出，粘附于溢流罐内壁，造成营养物质流失，并降低发酵过程中染菌的风险。采用本发明技术，在不影响目标产物产量的同时，有效解决鼠李糖脂发酵过程中的起泡引起的逃液问题，该工艺操作简单，适合工业化生产鼠李糖脂。
附图说明
图1为鼠李糖脂标准品的高效液相色谱图。
图2为实施例1的发酵液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KT1115是保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC的菌株，保藏号为CCTCC M2016686。
鼠李糖脂标准品为SIGMA公司产品，产品目录号为R90。
下述实施例中的消泡剂为泡敌，为南通锦莱化工有限公司产品，产品目录号为FAG375。
下述实施例中的pH调节使用10％的磷酸或5％(5g/100ml)的氢氧化钠水溶液进行。
实施例1
1、采用接种环从琼脂固体平板上挑取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KT1115的单菌落接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养21h，得到种子液。
上述种子培养基组成如下：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，余量为水。
2、将步骤1培养好的种子液按10％(体积比)的接种量接种于7L发酵罐(装液量50％)的发酵培养基中开始进行发酵培养，接种后的初始OD600为4.2，发酵条件为：温度30℃，通气量1vvm，搅拌转速300rpm。发酵过程中在不同阶段同时调控发酵液pH和发酵罐压力，具体为：0-6h，控制pH为6.5，发酵罐压力为0.015MPa；6-96h，控制pH为5.5，发酵罐压力为0.035MPa；96h之后，控制pH为6.2，发酵罐压力为0.02MPa。
上述发酵培养基组成如下：菜籽油70g/L、甘油20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、硝酸钠10g/L、Na2HPO4 4g/L、KH2PO4 4g/L、CaCl2 0.4g/L、MgSO4 2g/L，余量为水。
共发酵10天，发酵过程无需加入消泡剂，得到发酵液。
将发酵液和鼠李糖脂标准品分别进行高效液相色谱检测。
高效液相色谱检测条件如下：色谱柱：Diamonsil C18柱，规格为150mm×4.6mm×5μm；柱温为30℃；进样量为1μL；检测波长为UV 207nm；流动相A：0.5％甲酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件:0min，50％B；5min，50％B；30min，60％B；50min，100％B；60min，100％B。流速为0.4mL/min。
鼠李糖脂标准品的高效液相色谱图如图1所示，发酵液的高效液相色谱图如图2所示，鼠李糖脂标准品中双糖脂和单糖脂的保留时间分别为8.7min和10.861min，发酵液中目的峰的保留时间为8.722min和10.872min，证实目的产物为鼠李糖脂。经过外标标准曲线法计算，鼠李糖脂产率达到0.59g/L/h。
以下实施例中的发酵液同样进行了高效液相色谱检测，证实发酵液中的目的产物为鼠李糖脂。
实施例2
除了在发酵过程中按照如下方法在不同阶段同时调控发酵液pH和发酵罐压力之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液：
0-6h，控制pH为5，发酵罐压力为0.02MPa；6-96h，控制pH为6.5，发酵罐压力为0.04MPa；96h之后，控制pH为5，发酵罐压力为0.015MPa。
经检测，鼠李糖脂产率达到0.52g/L/h。
实施例3
除了在发酵过程中按照如下方法在不同阶段同时调控发酵液pH和发酵罐压力之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液：
0-6h，控制pH为8.5,发酵罐压力为0.035MPa；6-96h，控制pH为5.3，发酵罐压力为0.015MPa；96h之后，控制pH为7.5，发酵罐压力为0.04MPa。
经检测，鼠李糖脂产率达到0.54g/L/h。
实施例4
除了在发酵过程中按照如下方法在不同阶段同时调控发酵液pH和发酵罐压力之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液：
0-6h，控制pH为7，发酵罐压力为0.01MPa；6-96h，控制pH为5，发酵罐压力为0.02MPa；96h之后，控制pH为6.5，发酵罐压力为0.035MPa。
经检测，鼠李糖脂产率达到0.53g/L/h。
实施例5
除了在发酵过程中按照如下方法在不同阶段同时调控发酵液pH和发酵罐压力之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液：
0-6h，控制pH为6，发酵罐压力为0.015MPa；6-96h，控制pH为5.8，发酵罐压力为0.045MPa；96h之后，控制pH为7，发酵罐压力为0.02MPa。
经检测，鼠李糖脂产率达到0.57g/L/h。
实施例6
除了在发酵过程中按照如下方法在不同阶段同时调控发酵液pH和发酵罐压力之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液：
0-6h，控制pH为8，发酵罐压力为0.025MPa；6-96h，控制pH为5，发酵罐压力为0.05MPa；96h之后，控制pH为6，发酵罐压力为0.03MPa。
经检测，鼠李糖脂产率达到0.54g/L/h。
对比例1
除了对发酵过程中的pH不进行调控，将发酵罐压力控制在0.035MPa之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液。
发酵过程中泡沫无法控制，发酵约8h左右开始大量起泡，之后每间隔1-2h加入一次消泡剂，以避免泡沫充满发酵罐。大量消泡剂的加入给目标产物的分离造成了困难。
经检测，鼠李糖脂产率为0.40g/L/h。
对比例2
除了对发酵过程中的pH不进行调控，将发酵罐压力进行如下控制之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液：
0-6h，控制发酵罐压力为0.015MPa；6-96h，控制发酵罐压力为0.035MPa；96h之后，控制发酵罐压力为0.02MPa。
仅通过分阶段控制发酵过程中的发酵罐压力，而不分阶段调控发酵过程中的pH，发酵约8h开始起泡，需每间隔2-3h加入一次消泡剂，单独调控发酵过程的发酵罐压力可在一定程度上减少泡沫的产生，但无法从根本上解决起泡问题。
经检测，鼠李糖脂产率为0.41g/L/h。
对比例3
除了控制发酵过程中的pH为5.0，发酵罐压力为0.035MPa之外，重复实施例1的步骤，得到发酵10天的发酵液。
对发酵过程pH和发酵罐压力不进行分阶段调控，发酵约8h开始起泡，需每间隔4-5h加入一次消泡剂。
经检测，鼠李糖脂产率明显降低，仅为0.34g/L/h。

Claims (10)

1.一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法，包括以下步骤：将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在发酵培养基中进行发酵培养，发酵前期将发酵液的pH控制在5.0-8.5，发酵罐压力控制在0.01-0.035MPa，发酵中期将发酵液的pH控制在5.0-6.5，发酵罐压力控制在0.015-0.05MPa，发酵后期将发酵液的pH控制在5.0-7.5，发酵罐压力控制在0.015-0.04MPa。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养中，发酵前期将发酵液的pH控制在6.0-8.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养中，发酵前期将发酵罐压力控制在0.015-0.025MPa。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养中，发酵中期将发酵液的pH控制在5.0-5.8。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养中，发酵中期将发酵罐压力控制在0.045-0.05MPa。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养中，发酵后期将发酵液的pH控制在6.0-7.0。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养中，发酵后期将发酵罐压力控制在0.02-0.03MPa。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵前期为自发酵开始第0-6h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵中期为自发酵开始第6-96h。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵后期为自发酵开始第96-240h。
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