CN104450825A - 双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，该方法步骤如下：1)初步驯化；2)二次驯化；3)三次驯化；4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中发酵，获得铜绿假单胞菌发酵液；5)碳源优化测定；6)温度优化测定；7)pH优化测定；8)接种量优化。本发明的有益效果是：双相发酵技术，降低了表面活性剂鼠李糖脂的生产工艺成本，优化发酵条件，发酵生产的鼠李糖脂发酵液，液体呈透明状态，培养底物残留低，彻底改变了原来鼠李糖脂发酵液乳化严重的状态，所产生的表面活性剂对煤油乳化效果较好，抗硬水能力强，发泡效果和泡沫稳定。
Description
技术领域
本发明涉及领域，更具体地说涉及一种双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法。
背景技术
生物表面活性剂是由细菌、霉菌、酵母产生的两亲性化合物，它可降低表面张力和界面张力，生物表面活性剂在许多方面都优于化学合成的表面活性剂，如低毒性、高生物降解性、生态兼容性以及在极端的温度、pH和盐度等环境下的性能稳定性，这些特性使生物表面活性剂成为一种多用途的产品，可应用到环境修复、制药、化妆品、洗涤剂和食品等领域。
鼠李糖脂是由微生物在特定的生长条件下分泌的一种具有优良表面活性的代谢产物，是一种对环境无害的天然表面活性剂。近年来，随着鼠李糖脂在石油、农业、污染环境治理以及要求更高的日化、医药、食品等领域的成功实验应用，针对鼠李糖脂的研究也越来越广泛和深入。从生产菌种的选育、培养基配方的优化、发酵工艺及精制工艺的设计等，使鼠李糖脂在实验室水平的研究上日益成熟，提取的最高纯度可达95％以上，这些研究为鼠李糖脂的品质提高和应用领域的拓展提供了大量的科学依据。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，该方法步骤如下：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中发酵，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在一定条件下，分别选用淀粉、葡萄糖、乳糖为碳源，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养，测定得出不同碳源对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
6)温度优化测定：在步骤5)中确定的优化条件下，在30-40℃的温度范围中选取不同的培养温度，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养一定时间，测定得出不同温度下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
7)pH优化测定：在步骤6)中确定的优化条件下，将发酵培养基的初始pH调整至5-9，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养一定时间，测定得出不同pH值下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
8)接种量优化：在步骤7)中确定的优化条件下，选取1％－8％的接种量进行接种发酵培养一定时间，测定得出不同接种量下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
9)分析比较步骤5)、步骤6)、步骤7)，步骤8)中得到的不同条件下表面张力值结果，获得双相发酵制备鼠李糖脂的优化发酵条件。
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤1)与步骤2)中培养的条件为24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min。
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤3)中发酵培养时间为48h。
所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤4)中发酵条件为转速为130r/min摇床培养20h。
所述双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤5)中发酵培养的条件为浓度为20-40g/L、培养温度30℃、摇床转速130r/min。
所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤5)、步骤6)、步骤7)、步骤8)中培养时间均为20h。
本发明的有益效果为：双相发酵技术，降低了表面活性剂鼠李糖脂的生产工艺成本，优化发酵条件，发酵生产的鼠李糖脂发酵液，液体呈透明状态，培养底物残留低，彻底改变了原来鼠李糖脂发酵液乳化严重的状态，所产生的表面活性剂对煤油乳化效果较好，抗硬水能力强，发泡效果和泡沫稳定。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，该方法步骤如下：
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，该方法步骤如下：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中发酵，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在一定条件下，分别选用淀粉、葡萄糖、乳糖为碳源，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养，测定得出不同碳源对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
6)温度优化测定：在步骤5)中确定的优化条件下，在30-40℃的温度范围中选取不同的培养温度，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养一定时间，测定得出不同温度下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
7)pH优化测定：在步骤6)中确定的优化条件下，将发酵培养基的初始pH调整至5-9，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养一定时间，测定得出不同pH值下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
8)接种量优化：在步骤7)中确定的优化条件下，选取1％－8％的接种量进行接种发酵培养一定时间，测定得出不同接种量下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
9)分析比较步骤5)、步骤6)、步骤7)，步骤8)中得到的不同条件下表面张力值结果，获得双相发酵制备鼠李糖脂的优化发酵条件。
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤1)与步骤2)中培养的条件为24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min。
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤3)中发酵培养时间为48h。
所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤4)中发酵条件为转速为130r/min摇床培养20h。
所述双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤5)中发酵培养的条件为浓度为20-40g/L、培养温度30℃、摇床转速130r/min。
所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，步骤5)、步骤6)、步骤7)、步骤8)中培养时间均为20h。
实施例1：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养48h；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中，转速为130r/min摇床培养20h，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在浓度分别为20g/L、35g/L、40g/L，培养温度30℃、摇床转速130r/min的条件下，选用淀粉为碳源，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出淀粉对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值，如表1所示：
表1 淀粉对发酵液表面张力的影响
| 淀粉浓度(g/L) | 表面张力(mN/m) |
| 20 | 40 |
| 35 | 43 |
| 40 | 45 |
在本实施例中，淀粉浓度为20g/L时，发酵液表面张力值最小。
实施例2：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养48h；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中，转速为130r/min摇床培养20h，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在浓度分别为20g/L、35g/L、40g/L，培养温度30℃、摇床转速130r/min的条件下，选用葡萄糖为碳源，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出葡萄糖对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值，如表2所示：
表2 葡萄糖对发酵液表面张力的影响
| 葡萄糖浓度(g/L) | 表面张力(mN/m) |
| 20 | 31 |
| 35 | 33 |
| 40 | 35 |
在本实施例中，葡萄糖浓度为20g/L时，发酵液表面张力值最小。
实施例3：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养48h；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中，转速为130r/min摇床培养20h，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在浓度分别为20g/L、35g/L、40g/L，培养温度30℃、摇床转速130r/min的条件下，选用乳糖为碳源，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出乳糖对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值，如表3所示：
表3 乳糖对发酵液表面张力的影响
| 乳糖浓度(g/L) | 表面张力(mN/m) |
| 20 | 34 |
| 35 | 40 |
| 40 | 45 |
本实施例中，乳糖浓度为20g/L时，发酵液表面张力值最小。
比较实施例1、实施例2、实施例3中的表1、表2、表3，可知，20g/L葡萄糖作为碳源时比20g/L淀粉、20g/L乳糖作为碳源时发酵液表面张力更小，并且葡萄糖作为碳源时候溶液表面张力最低值一般在30-35mN/m的范围内，即葡萄糖作为碳源且浓度为20g/L时候，表面活性剂鼠李糖脂具有较高活性。
实施例4：
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于该方法步骤如下：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养48h；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中，转速为130r/min摇床培养20h，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在葡萄糖浓度为20g/L、摇床转速130r/min的条件下，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出葡萄糖对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
6)pH优化测定：在葡萄糖浓度为20g/L、摇床转速130r/min的优化条件下，将发酵培养基的初始pH值为7，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出不同pH值下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
7)温度优化测定：在葡萄糖浓度为20g/L、摇床转速130r/min的优化条件下，在30℃、35℃、40℃的温度范围中选取不同的培养温度，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出不同温度下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值，如表4：
表4 不同温度对发酵液表面张力的影响
| 温度(℃) | 表面张力(mN/m) |
| 30 | 35 |
| 35 | 30 |
| 40 | 38 |
在本实施例中，不改变其他发酵条件，温度控制在35℃时，发酵液表面张力最小。
实施例5：
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于该方法步骤如下：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养48h；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中，转速为130r/min摇床培养20h，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)pH优化测定：在葡萄糖浓度为20g/L、培养温度35℃、摇床转速130r/min的优化条件下，将发酵培养基的初始pH值分别调整至5、6、7、8、9，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，测定得出不同pH值下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值，如表5：
表5 不同的pH对发酵液表面张力的影响
| pH | 表面张力(mN/m) |
| 5 | 40 |
| 6 | 36 |
| 7 | 34 |
| 8 | 42 |
| 9 | 48 |
发酵液表面张力与发酵培养基的起始pH有关系，本实施例中，发酵培养基的起始pH控制在7时效果最佳。
实施例6：
双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于该方法步骤如下：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养48h；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中，转速为130r/min摇床培养20h，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)接种量优化：在葡萄糖浓度为20g/L、培养温度35℃、发酵培养基的pH＝7、摇床转速130r/min的优化条件下，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养20h，选取1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的接种量进行接种发酵培养，测定得出不同接种量下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值，如表6：
表6 不同的接种量对发酵液表面张力的影响
| 接种量 | 表面张力(mN/m) |
| 1％ | 55 |
| 2％ | 49 |
| 3％ | 46 |
| 4％ | 42 |
| 5％ | 35 |
| 6％ | 40 |
| 7％ | 42 |
| 8％ | 43 |
本实施例中，接种量在5％的时候发酵液表面张力最小。
通过本实施例对双相发酵制备鼠李糖脂条件的优化，得到优化后的培养配方及培养条件，培养基配方为：葡萄糖20g/L,酵母膏2g/L，NH4NO30.5g/L,Na2HPO40.5g/L，无机盐溶液5mL，培养条件为：接种量5％，培养温度35℃，初始发酵培养基pH＝7.0，再次优化条件下，双相制备鼠李糖脂的乳化性能、抗硬水性能及其起泡性能最优。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (6)
1.双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于该方法步骤如下：
1)初步驯化：将铜绿假单胞菌CICC10204活化培养，将活化培养过的所述铜绿假单胞菌转接至驯化培养基中培养；
2)二次驯化：将培养后所述铜绿假单胞菌的菌液以3％-5％的接种量接种至已灭菌的驯化培养基中培养；
3)三次驯化：将经二次驯化培养产出的菌液以3％-5％的接种量接种至新配制并灭菌的驯化培养基中驯化培养；
4)将步骤3)中驯化得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，将菌落接种于发酵培养基中发酵，获得铜绿假单胞菌发酵液；
5)碳源优化测定：在一定条件下，分别选用淀粉、葡萄糖、乳糖为碳源，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养，测定得出不同碳源对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
6)温度优化测定：在步骤5)中确定的优化条件下，在30-40℃的温度范围中选取不同的培养温度，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养一定时间，测定得出不同温度下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
7)pH优化测定：在步骤6)中确定的优化条件下，将发酵培养基的初始pH调整至5-9，将所述铜绿假单胞菌发酵液培养一定时间，测定得出不同pH值下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
8)接种量优化：在步骤7)中确定的优化条件下，选取1％－8％的接种量进行接种发酵培养一定时间，测定得出不同接种量下对应的铜绿假单胞菌发酵液的表面张力值；
9)分析比较步骤5)、步骤6)、步骤7)，步骤8)中得到的不同条件下表面张力值结果，获得双相发酵制备鼠李糖脂的优化发酵条件。
2.根据权利要求1所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于：步骤1)与步骤2)中培养的条件为24-60h，培养温度32-37℃，转速150-200r/min。
3.根据权利要求1所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于：步骤3)中发酵培养时间为48h。
4.根据权利要求1所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于：步骤4)中发酵条件为转速为130r/min摇床培养20h。
5.根据权利要求1所述双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于：步骤5)中发酵培养的条件为浓度为20-40g/L、培养温度30℃、摇床转速130r/min。
6.根据权利要求1所述的双相发酵制备鼠李糖脂条件优化的方法，其特征在于：步骤5)、步骤6)、步骤7)、步骤8)中培养时间均为20h。
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