CN107557353A - 一种纤维素酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，添加了种子液的扩大生产，a.培养至发酵液OD600到达0.8‑1.0；b.流加培养，优选的，流加培养时发酵液的OD600为0.8‑1.0；或取出部分发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD600到达0.8‑1.0，c.枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。提高生产效率和设备利用率；减少设备投入及能耗、降低生产成本；提高了发酵种子液中成活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种纤维素酶的制备方法。
背景技术
纤维素酶(cellulase)是一种重要的酶产品，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，能降解纤维素β-1，4糖苷键生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称，是一种复合的诱导酶，包括多种水解酶。纤维素酶的工业化应用主要集中在生物能源，酿造工业，洗涤工业，造纸工业及纺织工业等行业中。在生物能源方面，纤维素酶将纤维素物质彻底的分解，其水解产物变成单糖，再将其进一步发酵，便可产生生物柴油；在酿造工业中，可用于啤酒的生产，增加发酵糖的产量，也可用于酱油的酿造，增加酱油的产量以及改善其质量；在洗涤工业中，纤维素酶加到洗涤剂中，能将水合纤维素分子彻底破坏，彻底清除封闭在纤维内部的污渍，提升洗涤效果；在造纸工业中，纤维素酶能使纤维表面改性，减少机械打浆的能耗；在纺织工业中，用于棉麻的后整理，纤维素酶能降低反应温度，使反应条件温和，织物整理平滑触感好。
现有技术中发酵种子液的扩大生产很难，发酵菌株在培养过程中，容易发生退化，不能连续进行发酵培养获得发酵种子液，目前生产中还没有一种具有良好稳定性的菌株，以达到连续化豆粕发酵，在豆粕发酵过程中，发酵菌株的退化问题是影响豆粕发酵连续化的一个重要问题。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种纤维素酶的制备方法，解决了纤维素酶制备程中，发酵种子液中菌落发生退化的问题。
为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；
(2)将(1)中的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在10～15℃下培养3～5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；
(3)在10～15℃下，将(2)中的纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为48～72小时；
(4)将(3)中的种子液按发酵液体积3～5％的接种量接种于产酶培养基中，10～15℃培养96～144小时，即里氏木霉发酵生产低温中性纤维素酶结束；将发酵液在4000～6000rpm 离心，收集所得液体为粗酶液；
(5)将(4)得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到1000～2000UI/G的浓缩酶液；
所述(4)中的扩大种子液的制备步骤为：
a.培养至发酵液OD600到达0.8-1.0；
b.流加培养，优选的，流加培养时发酵液的OD600为0.8-1.0；或取出部分发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD600到达0.8-1.0，
c.枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：提高生产效率和设备利用率；减少设备投入及能耗、降低生产成本；提高了发酵种子液中成活性。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的说明。
一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；
(2)将(1)中的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在10～15℃下培养3～5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；
(3)在10～15℃下，将(2)中的纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为48～72小时；
(4)将(3)中的种子液按发酵液体积3～5％的接种量接种于产酶培养基中，10～15℃培养96～144小时，即里氏木霉发酵生产低温中性纤维素酶结束；将发酵液在4000～6000rpm 离心，收集所得液体为粗酶液；
(5)将(4)得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到1000～2000UI/G的浓缩酶液；
步骤(4)中的扩大种子液的制备步骤为：
a.培养至发酵液OD600到达0.8-1.0；
b.流加培养，优选的，流加培养时发酵液的OD600为0.8-1.0；或取出部分发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD600到达0.8-1.0，
c.枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。
所述初筛培养基选用60.0～80.0g马铃薯，0.5gK2HPO4，2.0～2.4g明胶，20.0～25.0
g琼脂和1.0L蒸馏水制备，并将制备好的所述初筛培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。
所述发酵培养基选用3.0～5.0g玉米粉，0.5～1.0g蛋白胨，0.8～1.2g(NH4)2SO4，1.2～ 1.8gKH2PO4，0.1～0.3g尿素，0.1～0.2gCaCl2和1.0L蒸馏水制备，并将制备好的所述发酵培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。
所述产酶培养基选用70.0～80.0g麸皮，15.0～20.0g米糠，0.15～0.2g羧甲基纤维素， 0.05～0.1g(NH4)2SO4，0.05～0.1gMgSO4，0.1～0.15gK2HPO4和1.48～1.52L蒸馏水制备，并将制备好的所述产酶培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。
所述浓缩酶液与表面活性物质、防腐剂、稳定剂中的一种或多种组分进行复配，其质量百分比分别为：浓缩酶液10～50％，表面活性物质5～10％，防腐剂0.1～1％，稳定剂 1～30％，其它：去离子水，即复配成低温中性纤维素酶制剂。
所述表面活性物质由脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧丙烯醚以及烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种物料组成；所述防腐剂由布罗波尔、戊二醛、卡松以及苯氧乙醇中的一种或几种物料组成；所述稳定剂由氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠以及聚乙烯醇中的一种或几种物料组成。
菌种活化：从-80℃冰箱中取出枯草芽孢杆菌B3甘油管，放在冰上解冻，用接种环蘸取少量菌液，划于蛋白胨培养基斜面上，37℃培养16h；
一级种子液制备：从斜面上挑取一环，接到LB培养基中，37℃200rpm培养14h，吸取1ml菌液在无菌水中稀释10倍，当OD600达到0.8-1.0时，培养结束获得一级种子液。
种子液制备：将一级种子液以0.5％接种量，与种子培养基混合，接种至发酵罐中。发酵过程调控：通气量调至3.5vvm，搅拌调至500rpm，待发酵系统稳定后，将DO调至 100％；发酵4h后，每隔2h取样一次，测定OD600，当OD600到达0.8时，进入恒浊培养阶段；
连续化培养：通气量设为4.5vvm，搅拌设至600rpm，发酵液流出速度为400ml/min，培养基补加速度为400ml/min，使得发酵液OD600保持在0.8-0.9；发酵至96h后，每隔2h 取样一次，显微镜观察和OD600分析，若观察到发酵液中有大量细胞碎片、细胞形态由短粗状变为细长时，且OD600≥1.5时，停止发酵，全部放出发酵液；
接种：调整蠕动泵的流速为400ml/min，螺旋输送机内部均匀分布有喷雾分散器，调节螺旋输送机的转速，将种子液以1:10(m/m)的配比与含水量为50％混匀，使得接种后活细胞数达到(1-9)×107cfu/g。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；
(2)将(1)中的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在10～15℃下培养3～5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；
(3)在10～15℃下，将(2)中的纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为48～72小时；
(4)将(3)中的种子液按发酵液体积3～5％的接种量接种于产酶培养基中，10～15℃培养96～144小时，即里氏木霉发酵生产低温中性纤维素酶结束；将发酵液在4000～6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；
(5)将(4)得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到1000～2000UI/G的浓缩酶液；
其特征在于：步骤(4)中的扩大种子液的制备步骤为：
a.培养至发酵液OD600到达0.8-1.0；
b.流加培养，优选的，流加培养时发酵液的OD600为0.8-1.0；或取出部分发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD600到达0.8-1.0，
c.枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述初筛培养基选用60.0～80.0g马铃薯，0.5gK2HPO4，2.0～2.4g明胶，20.0～25.0g琼脂和1.0L蒸馏水制备，并将制备好的所述初筛培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。
3.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基选用3.0～5.0g玉米粉，0.5～1.0g蛋白胨，0.8～1.2g(NH4)2SO4，1.2～1.8gKH2PO4，0.1～0.3g尿素，0.1～0.2gCaCl2和1.0L蒸馏水制备，并将制备好的所述发酵培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。
4.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述产酶培养基选用70.0～80.0g麸皮，15.0～20.0g米糠，0.15～0.2g羧甲基纤维素，0.05～0.1g(NH4)2SO4，0.05～0.1gMgSO4，0.1～0.15gK2HPO4和1.48～1.52L蒸馏水制备，并将制备好的所述产酶培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。
5.一种采用如权利要求1～4中任一项所述的的制备方法获得的低温中性纤维素酶的复配方法，其特征在于：所述浓缩酶液与表面活性物质、防腐剂、稳定剂中的一种或多种组分进行复配，其质量百分比分别为：浓缩酶液10～50％，表面活性物质5～10％，防腐剂0.1～1％，稳定剂1～30％，其它：去离子水，即复配成低温中性纤维素酶制剂。
6.根据权利要求5所述的纤维素酶的复配方法，其特征在于：所述表面活性物质由脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧丙烯醚以及烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种物料组成；所述防腐剂由布罗波尔、戊二醛、卡松以及苯氧乙醇中的一种或几种物料组成；所述稳定剂由氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠以及聚乙烯醇中的一种或几种物料组成。
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|---|---|---|---|---|
| CN108841811A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-11-20 | 杭州园泰生物科技有限公司 | 一种混合发酵产酶工艺 |
| CN113136358A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-07-20 | 重庆大学 | 一种提高人参皂苷产量的好氧共培养益生菌发酵工艺 |
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