CN114196716A - 一种生产鼠李糖脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化工领域，提供一种生产鼠李糖脂的方法，包括：以能够生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌作为生产菌，在发酵培养过程中，以产油酵母以原料。本发明的方法能给有效缓解鼠李糖脂发酵过程的起泡问题，并且鼠李糖脂产量得到提高。

Description

一种生产鼠李糖脂的方法
技术领域
本发明属于化工领域，涉及鼠李糖脂的生产。
背景技术
鼠李糖脂是糖脂类生物表面活性剂，主要由铜绿假单胞菌和相关菌株产生，由一个或两个鼠李糖分子以及最多三个包含8-14个碳的羟基脂肪酸分子组成。鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，能显著降低水的表面张力，改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、发泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。因此，鼠李糖脂在化工、生物医学和制药行业领域广泛的应用。
现行鼠李糖脂发酵生产工艺以植物油为碳源。在鼠李糖脂发酵过程中，特别是在鼠李糖脂发酵后期，由于植物油和鼠李糖脂共同作用，发酵液起泡严重，pH不稳定极易导致乳化。因此，如何控制发酵泡沫和pH成为鼠李糖脂工业化生产的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产鼠李糖脂的方法，以解决上述问题。
本发明的生产鼠李糖脂的方法包括：以能够生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌作为生产菌，在发酵培养过程中，以产油酵母以原料。
在一种实施方式中，所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)编号为CICC21100，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
在一种实施方式中，所述产油酵母为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)；优选地，所述产油酵母的油脂含量占酵母干重的45％～65％，如50％。
在一种实施方式中，所述产油酵母为粘红酵母，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 2.703。
在一种实施方式中，所述产油酵母先用酸处理，方法为：用体积含量1-5％的酸与产油酵母充分混合后，在70-90℃下反应30-50min，冷却至室温后，调节pH至7-8；优选地，所述酸为硫酸或盐酸；优选地，所述酸与产油酵母的混合物中，产油酵母的质量含量为35％～45％，优选40％。
在一种具体实施方式中，所述方法包括步骤：
1)产油酵母处理：用体积含量1-5％的硫酸与产油酵母充分混合，在70-90℃下反应30-60min，冷却至室温后，调节pH至7-8；所述硫酸与产油酵母的混合物中，产油酵母的质量含量为35％～45％，优选40％；
2)发酵：将铜绿假单胞菌的种子菌接入至发酵培养基中，接种量为5％～15％，优选10％，发酵温度为28～32℃，优选30℃，搅拌转速为330～360rpm，优选350rpm，初始通气量为0.8v/v/m，将发酵液的pH控制在7-7.5，发酵罐压力控制在0.12MPa；发酵时间为100～140h，优选120h；
其中，所述发酵培养基包括：产油酵母(油脂含量占酵母干重的45-65％)150-200g/L、0.8～1.2g/L NaNO3、0.8～1.2g/L KCl、0.09～0.12g/L CaCl2·2H2O、6～7g/LKH2PO4、10～12g/L Na2HPO4·12H2O、0.2～0.3g/L MgSO4和1.5～2.5mL/L痕量元素，所述痕量元素包括：0.07～0.1g/L FeCl3·6H2O、0.7～0.8g/LZnSO4·7H2O、0.07～0.09g/LCoCl2·6H2O、0.07～0.08g/L CuSO4·5H2O、0.7～0.8g/L MnSO4·H2O、0.1～0.2g/L H3BO3和0.02～0.1g/L Na2MoO4·2H2O；
优选地，所述发酵培养基包括：产油酵母(油脂含量占酵母干重的45-65％)150-200g/L、1.0g/L NaNO3、1.0g/L KCl、0.1g/L CaCl2·2H2O、6.5g/L KH2PO4、11.0g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L MgSO4和2mL/L痕量元素，所述痕量元素包括：0.08g/L FeCl3·6H2O、0.75g/L ZnSO4·7H2O、0.08g/L CoCl2·6H2O、0.075g/L CuSO4·5H2O、0.75g/LMnSO4·H2O、0.15g/L H3BO3和0.05g/LNa2MoO4·2H2O。
优选地，所述pH控制方案为：发酵后，当培养基pH值开始下降时，加入补料培养基，通过补料培养基流量F控制，F＝V/D，D＝OD/(K*exp(7-pH))；其中，V为发酵液初始体积，单位为L，OD为发酵液中菌体OD600，K＝0.302*V/1000，pH为实时pH值；
其中，所述补料培养基组成为：1.5～2.5g/L NaNO3、14.5～15.5g/L KH2PO4、14.5～15.5g/L Na2HPO4和1.8～2.2ml/L痕量元素；优选地，所述补料培养基组成为：2g/LNaNO3、15.1g/L KH2PO4、15.1g/L Na2HPO4和2ml/L痕量元素。
优选地，步骤2)中的种子菌的培养过程为：首先，在平板培养基上接种铜绿假单胞菌并培养，收获菌体后进行摇瓶培养，获得菌种；将菌种接种到发酵种子培养基中继续发酵培养。种子菌的培养过程是本领域公知方法。
其中，平板培养基组成为：10g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、2.5g/L NaCl、1.5g/L琼脂；摇瓶和发酵种子培养基组成为：10g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、2.5g/L NaCl。
利用该发酵方法生产鼠李糖脂有以下优点：
1).利用产油酵母作为碳源，能够将发酵进行到120h，且发酵过程中泡沫得到控制，说明本发明方法有效缓解了鼠李糖脂发酵过程的起泡问题；
2).整个发酵过程中pH可以通过补料速率流量有效控制在7-7.5之间，且发酵液不会乳化；
3).鼠李糖脂产量可达67.7g/L以上，碳源转化率70％以上。
附图说明
图1是不同浓度硫酸处理产油酵母对鼠李糖脂产量的影响；
图2是50L发酵生产鼠李糖脂产量。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的生物学实验方法均参照常规方法，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1：不同浓度酸处理产油酵母对鼠李糖脂积累的影响
1.产油酵母处理：将240g产油酵母Rhodotorula glutinis(油脂含量占酵母干重的50％，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC 2.703)粉，加入至360g硫酸溶液中充分混匀，浓硫酸体积分数分别为1％、2％、5％，于70-85℃处理30min，冷却至室温，将处理后的产油酵母菌悬液调节pH至7。
2.配制培养基。发酵培养基组成：酸处理后的产油酵母180g/L、1.0g/LNaNO3、1.0g/L KCl、0.1g/L CaCl2·2H2O、6.5g/L KH2PO4、11.0g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L MgSO4和2mL/L痕量元素，痕量元素包括：0.08g/LFeCl3·6H2O、0.75g/L ZnSO4·7H2O、0.08g/LCoCl2·6H2O、0.075g/LCuSO4·5H2O、0.75g/L MnSO4·H2O、0.15g/L H3BO3和0.05g/LNa2MoO4·2H2O。补料培养基组成：2g/L NaNO3、15.1g/L KH2PO4、15.1g/L Na2HPO4和2mL/L痕量元素。
3.发酵：将培养好的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC21100)按照10％接种到3L发酵罐中，发酵体积为1.2L，温度为30℃，搅拌转速为350rpm，初始通气量为0.8v/v/m，发酵液的pH通过补料培养基流量F控制在7-7.5，其中，F＝V/D，D＝OD/(K*exp(7-pH))，V表示发酵液体积，单位为L，即V取值1.2，OD发酵液中菌体OD600，K＝0.302*V/1000。发酵培养罐压力控制在0.12mPa，发酵120h。
4.蒽酮法测定鼠李糖脂：在比色管中加入1mL离心后样品以及5ml含0.2％蒽酮的硫酸溶液，室温下静置约10min，然后测定620nm处的吸光光度值。
结果如图1所示，以1％硫酸处理的产油酵母作为培养基成分时，鼠李糖脂产量达到40g/L；随着酸浓度的提高，鼠李糖脂产量也增加；当以5％酸处理时，鼠李糖脂产量可达52g/L，发酵液总体积为1.36L，碳源转化率65.5％。
实施例2：不同处理温度和时间对鼠李糖脂积累的影响
1.产油酵母预处理：将240g产油酵母(同实施例1)，加入至360g的体积分数为5％的硫酸中，分别于70℃、80℃、90℃处理30min、60min，将处理后的产油酵母菌悬液调节pH至7-8。
2.培养基的组成如实施例1。
3.发酵：将培养好的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(编号为CICC21100)按照10％接种到3L发酵罐中，发酵体积为1.2L，温度为30℃，搅拌转速为350rpm，初始通气量为0.8v/v/m，发酵液的pH通过联锁补料培养基流量如实施例1控制在7-7.5，发酵罐压力控制在0.12MPa。发酵120h，鼠李糖脂产量最低为42g/L，最高可达59g/L，碳源转化率在69.5％以上，说明上述条件下用硫酸处理产油酵母后，都可以使鼠李糖脂产量得到提高。具体结果如表1所示。
表1：不同处理条件对鼠李糖脂产量的影响
Figure BDA0003418701650000041
实施例3：50L发酵罐生产鼠李糖脂
1.产油酵母预处理：将3200g产油酵母(同实施例1)，加入至4800g体积分数为2％硫酸中，于90℃处理30min，将处理后的产油酵母菌悬液调节pH至8。
2.配制培养基。发酵培养基组成：处理后的产油酵母150g/L、1.0g/LNaNO3、1.0g/LKCl、0.1g/L CaCl2·2H2O、6.5g/L KH2PO4、11.0g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L MgSO4和2mL/L痕量元素，痕量元素包括：0.08g/LFeCl3·6H2O、0.75g/L ZnSO4·7H2O、0.08g/L CoCl2·6H2O、0.075g/LCuSO4·5H2O、0.75g/L MnSO4·H2O、0.15g/L H3BO3和0.05g/L Na2MoO4·2H2O。补料培养基组成：2g/L NaNO3、15.1g/L KH2PO4、15.1g/L Na2HPO4和2mL/L痕量元素。
3.发酵：将培养好的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(编号为CICC21100)按照10％接种到50L发酵罐中，初始发酵体积为20L，温度为30℃，搅拌转速为350rpm，初始通气量为0.8v/v/m，全过程将发酵液的pH控制在7-7.5，发酵罐压力控制在0.12MPa。pH通过补料培养基流量控制：F＝V/D，D＝OD/(K*exp(7-pH))，K＝0.302*V/1000，V表示初始发酵体积，单位为L，即取值20。发酵前7h，OD值每15min测一次。结果如图2所示，发酵120h，鼠李糖脂最高产量67.7g/L，碳源转化率75％。
实施例4：1000L发酵罐生产鼠李糖脂
1.产油酵母预处理：将60000g产油酵母(同实施例1)，加入至90000g体积分数为2％的硫酸中，于90℃处理30min，将处理后的产油酵母菌悬液调节pH至7.5。
2.发酵培养基和补料培养基同实施例3。
3.发酵方式：将培养好的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(编号为CICC21100)按照10％接种到1000L发酵罐中，初始发酵体积为400L，温度为30℃，搅拌转速为350rpm，初始通气量为0.8v/v/m，全过程将发酵液的pH控制在7-7.5，发酵罐压力控制在0.12MPa。通过补料培养基流量F控制pH值，F＝V/D,D＝OD/(K*exp(7-pH))，K＝0.302*V/1000，V表示初始发酵体积，单位为L，即取值400。发酵前7h，OD值每15min测一次。发酵120h，鼠李糖脂最高产量65.5g/L，碳源转化率70％。
对比例1：采用大豆油进行鼠李糖脂发酵
1.发酵培养基。初始培养基组成：大豆油75g/L、酵母粉75g/L、1.0g/LNaNO3、1.0g/L KCl、0.1g/L CaCl2·2H2O、6.5g/L KH2PO4、11.0g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L MgSO4和2mL/L痕量元素，痕量元素包括:0.08g/LFeCl3·6H2O、0.75g/L ZnSO4·7H2O、0.08g/L CoCl2·6H2O、0.075g/LCuSO4·5H2O、0.75g/L MnSO4·H2O、0.15g/L H3BO3和0.05g/L Na2MoO4·2H2O。补料培养基组成：2g/L NaNO3、15.1g/L KH2PO4、15.1g/L Na2HPO4和2mL/L痕量元素。
2.泡沫控制：当泡沫液位达到发酵罐液位的80％，流加3g消泡剂(消泡剂204A6426，购自sigma)。
3.发酵方式：按照10％接种到50L发酵罐中，初始发酵体积为20L，温度为30℃，搅拌转速为150rpm，初始通气量为0.08v/v/m，全过程将发酵液的pH控制在7-7.5，发酵罐压力控制在0.12MPa。
4.pH控制方式：补料培养基流量F＝V/D，D＝OD/(K*exp(7-pH))，V为初始发酵体积，单位为L，即取值20，OD为发酵液中菌体OD600，K＝0.302*V/1000，pH为实时pH值。发酵前7h，OD值每15min测一次。
5.发酵120h，鼠李糖脂最高产量35.6g/L，碳源转化率40％。全程共消泡30次，消泡剂用量90g。
对比例2：采用氢氧化钠调节pH
1.发酵培养基和补料培养基同实施例3。
2.发酵方式：按照10％接种到50L发酵罐中，初始发酵体积为20L，温度为30℃，搅拌转速为150rpm，初始通气量为0.08v/v/m，全过程通过1mol/L氢氧化钠控制发酵液pH＝7.2，发酵罐压力控制在0.12MPa。
3.发酵82h，发酵液乳化，发酵停止，鼠李糖脂含量42g/L，碳源转化率43％。乳化后的发酵液无法采用常规的蝶式离心进行分离。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种生产鼠李糖脂的方法，包括：以能够生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为生产菌，在发酵培养过程中，以产油酵母以原料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述产油酵母为粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)；优选地，所述产油酵母的油脂含量占酵母干重的45％～65％，如50％。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述铜绿假单胞菌编号为CICC21100；所述产油酵母为粘红酵母，编号为CGMCC 2.703。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述产油酵母先用酸处理，方法为：用体积含量1-5％的酸与产油酵母充分混合后，在70-90℃下反应30-50min，冷却至室温后，调节pH至7-8；优选地，所述酸为硫酸或盐酸；优选地，所述酸与产油酵母的混合物中，产油酵母的质量含量为35％～45％，优选40％。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，包括步骤：
1)产油酵母处理：用体积含量1-5％的硫酸与产油酵母充分混合，在70-90℃下反应30-60min，冷却至室温后，调节pH至7-8；所述硫酸与产油酵母的混合物中，产油酵母的质量含量为35％～45％，优选40％；
2)发酵：将铜绿假单胞菌的种子菌接入至发酵培养基中，接种量为5％～15％，优选10％；发酵温度为28～32℃，优选30℃；搅拌转速为330～360rpm，优选350rpm；初始通气量为0.8v/v/m，将发酵液的pH控制在7-7.5，发酵罐压力控制在0.12MPa；发酵时间为100～140h，优选120h；
其中，所述发酵培养基包括：产油酵母150-200g/L、0.8～1.2g/L NaNO3、0.8～1.2g/LKCl、0.09～0.12g/L CaCl2·2H2O、6～7g/L KH2PO4、10～12g/L Na2HPO4·12H2O、0.2～0.3g/L MgSO4和1.5～2.5mL/L痕量元素，所述痕量元素包括：0.07～0.1g/L FeCl3·6H2O、0.7～0.8g/L ZnSO4·7H2O、0.07～0.09g/L CoCl2·6H2O、0.07～0.08g/L CuSO4·5H2O、0.7～0.8g/L MnSO4·H2O、0.1～0.2g/L H3BO3和0.02～0.1g/L Na2MoO4·2H2O。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵培养基包括：产油酵母150-200g/L、1.0g/L NaNO3、1.0g/L KCl、0.1g/L CaCl2·2H2O、6.5g/L KH2PO4、11.0g/L Na2HPO4·12H2O、0.25g/L MgSO4和2mL/L痕量元素，所述痕量元素包括：0.08g/L FeCl3·6H2O、0.75g/LZnSO4·7H2O、0.08g/L CoCl2·6H2O、0.075g/L CuSO4·5H2O、0.75g/L MnSO4·H2O、0.15g/LH3BO3和0.05g/L Na2MoO4·2H2O。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述pH控制方案为：发酵后，当培养基pH值开始下降时，加入补料培养基，通过补料培养基流量F控制，F＝V/D，D＝OD/(K*exp(7-pH))；其中，V为发酵液初始体积，单位为L，OD为发酵液中菌体OD600，K＝0.302*V/1000，pH为实时pH值。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述补料培养基组成为：1.5～2.5g/L NaNO3、14.5～15.5g/L KH2PO4、14.5～15.5g/L Na2HPO4和1.8～2.2ml/L痕量元素；优选地，所述补料培养基组成为：2g/L NaNO3、15.1g/L KH2PO4、15.1g/L Na2HPO4和2ml/L痕量元素。
9.根据权利要求5～8任一项所述的方法，其中，步骤2)中的种子菌的培养过程为：首先，在平板培养基上接种铜绿假单胞菌并培养，收获菌体后进行摇瓶培养，获得菌种；将菌种接种到发酵种子培养基中继续发酵培养。
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