CN112481335A - 一种鼠李糖脂发酵方法 - Google Patents

一种鼠李糖脂发酵方法 Download PDF

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CN112481335A CN201910859981.8A CN201910859981A CN112481335A CN 112481335 A CN112481335 A CN 112481335A CN 201910859981 A CN201910859981 A CN 201910859981A CN 112481335 A CN112481335 A CN 112481335A
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Abstract

本发明公开了一种鼠李糖脂发酵方法，其包括如下步骤：(A)选用铜绿或恶臭假单胞菌，进行菌种活化；(B)从活化菌种中挑取单菌落接种至种子培养基中培养；(C)将种子液按1‑10％的接种量接种至发酵培养基中培养，其中，根据产物所需的单双鼠李糖脂的比例，发酵培养基选择使用不同的碳源，且发酵培养基包括微量元素，所述微量元素至少包含H3BO4、CuSO4和Na2MoO4。该方法鼠李糖脂对底物的转化率高达90％以上。另外，可通过改变碳源种类和复合碳源配比调控产物中单双鼠李糖脂比例。同时再通过向发酵培养基中添加少量特定组成的微量元素溶液，可有效提高假单胞菌产鼠李糖脂的速率，明显缩短发酵时间25％，在降低发酵成本的也可大幅度减小发酵罐染菌的概率。

Description

一种鼠李糖脂发酵方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鼠李糖脂发酵方法。
背景技术
鼠李糖脂由于其具有增溶、乳化、润湿、发泡等性能，而且具有低毒、对环境友好等特点，因而在石油开采、医药、食品、日化和环保等领域具有很大的应用潜力，成为近年来研究较为广泛的生物表面活性剂，近年来，鼠李糖脂在抗菌、抗病毒和抗肿瘤等方面也表现出一定的生物活性，进一步促进了它的研究热度。鼠李糖脂是一种微生物的次级代谢产物，有两种类型，分别为含有一个鼠李糖环的单鼠李糖脂和含有两个鼠李糖环的双鼠李糖脂，鼠李糖脂结构中同时含有亲水基团和疏水基团，由于疏水基团饱和或不饱和脂肪酸中碳原子数的不同，鼠李糖脂含有多种结构，常见的碳原子数目一般为8、10、12或14，梁生康等在铜绿假单胞菌O-2-2的发酵产物中共检出21种鼠李糖脂的同系物，其中最常见的是RhaC10C10、Rha2C10C10、RhaC10、Rha2C104四种结构。另外，由于双鼠李糖脂中亲水基团的亲水性更强，导致具有更低的界面张力，在促进石油采收和油田化学用品中更有优势。因此，通过调节发酵液中的单双鼠李糖脂的比例，可以根据发酵液的性能更具有针对性将其应用于不同的方向和领域。
鼠李糖脂发酵是好氧发酵，发酵过程中的搅拌和通气使得发酵液以泡沫形式溢出，不仅会损失培养基中的营养和菌体，而且极易导致后续发酵染菌。目前，限制鼠李糖脂在工业上广泛应用的主要因素是其过高的生产成本以及发酵过程中泡沫难以控制，目前控制泡沫主要采用化学消泡法。因此，如何降低鼠李糖脂的生产成本成为目前研究的热点，为了降低其生产成本，很多研究通过优化发酵过程，提高发酵产率，缩短发酵时间，从而降低发酵成本。
发明内容
本发明目的之一是优选一种发酵工艺，提高碳源转化率，降低鼠李糖脂工业化成本。
本发明目的之二在于可根据需要通过改变原料种类和配比调节产物中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂比例，而不降低产量。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案，
一种鼠李糖脂发酵方法，包括如下步骤：
(A)选用铜绿或恶臭假单胞菌，进行菌种活化；
(B)从活化菌种中挑取单菌落接种至种子培养基中培养，得到种子液；
(C)将种子液按1-10vol％的接种量接种至发酵培养基中进行培养，其中根据产物所需的单双鼠李糖脂的比例，发酵培养基选择使用不同的碳源，且发酵培养基与微量元素混合使用，所述微量元素至少包含H3BO4、CuSO4和Na2MoO4。
本发明中，种子培养基可以采用现有的用于鼠李糖脂发酵的种子培养基，例如LB种子培养基：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；NaCl 10.0g/L。
本发明中，发酵培养基可以采用现有的用于鼠李糖脂发酵的发酵培养基，例如包括：酵母膏5g/L；尿素5g/L；硝酸钠10g/L；Na2HPO4 4g/L；KH2PO4 4g/L；CaCl2 0.4g/L；MgSO42g/L。
进一步地，所述微量元素包括H3BO4 0.12-0.18g/L，CuSO4 0.065～0.085g/L和Na2MoO4 0.03～0.07g/L，优选H3BO4 0.15g/L，CuSO4 0.075g/L和Na2MoO4 0.05g/L，配成微量元素溶液，将其和发酵培养基按0.05-0.15％的体积比例混合(是指微量元素溶液与发酵培养基的体积比为0.05-0.15％)。
进一步地，上述微量元素溶液中还包括ZnSO4 0.65-0.85g/L，优选约0.75g/L，MnSO4 1.3-1.7g/L，优选约1.5g/L。
进一步地，发酵培养基中的碳源为葡萄糖、甘油、植物油中的一种或几种；所述植物油选自菜籽油、花生油、大豆油、玉米油、橄榄油、棉籽油、椰子油和棕榈油中的一种或几种。当使用植物油时，植物油的用量范围为20-130g/L。
进一步地，当所需产物中单鼠李糖脂为比例高达70％以上的优势产物时，单独采用20-130g/L发酵培养基的橄榄油作碳源；当所需产物中双鼠李糖脂为占比60％以上的优势产物时，采用10-90g/L发酵培养基的甘油作唯一碳源。
进一步地，选用20-130g/L植物油和10-90g/L甘油作混合碳源，根据植物油种类的不同来改变单双鼠李糖脂的比例，如选用40g/L菜籽油和20g/L甘油作混合碳源，在一个实施例中，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例分别为64％和36％，而当换用40g/L橄榄油和20g/L甘油时，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例分别为48％和52％，可选用其他不同植物油改变单鼠李糖脂和双鼠李糖脂比例。
菌种活化可以采用本领域已知的方式进行，例如，菌种活化包括选用一株铜绿或恶臭假单胞菌，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃±1℃水浴或室温融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃±1℃恒温培养箱培养12-20h，即可观察到单菌落。
在一个实施方案中，种子液培养包括挑取固体平板上的单菌落接种至已经灭菌处理(例如121℃灭菌处理20min)的种子培养基中培养15-24h。
在一个实施方案中，发酵包括将种子液按1-10vol％的接种量接种至发酵培养基中(是指种子液体积与种子液和发酵培养基体积之和的比例为1-10％)，自然pH条件下，28-37℃，200-400rpm，培养6-10天。
本发明人出乎意料地发现，通过加入特定微量元素，可以提高发酵速率，缩短发酵时间约2天，从而降低发酵的公用工程成本，同时可减小发酵罐染菌的概率。分别按H3BO40.15g/L，CuSO4 0.075g/L和Na2MoO4 0.05g/L的量，依次称取几种无机盐，将其配成微量元素溶液，其中微量元素溶液和发酵培养基按0.05-0.15％的比例混合。
在一个进一步的实施方案中，包括向发酵培养基中按0.5-1.5mL/L比例加入微量元素溶液，优选1mL/L的比例加入前述微量元素溶液，灭菌处理(例如121℃灭菌处理20min)，按1-10％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，自然pH条件下，30-37℃，200-400rpm，培养6-10天。
本发明具有发酵效率高、产物结构可调等优点，有利于针对性的进行工业应用；并且通过加入微量元素，提高发酵速率，明显缩短发酵时间2天，大幅度节约生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但并不限定本技术发明。
以下实施例和对比例中所涉及的培养基：
琼脂培养基：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；NaCl 10.0g/L；琼脂粉20g/L。
LB种子培养基：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；NaCl 10.0g/L。
发酵培养基：酵母膏5g/L；尿素5g/L；硝酸钠10g/L；Na2HPO4 4g/L；KH2PO44g/L；CaCl2 0.4g/L；MgSO4 2g/L。其中碳源按照实施例中规定的用量加入到发酵培养基中。
微量元素溶液1：按照浓度(w/v)为H3BO4 0.15g/L，CuSO4 0.075g/L和Na2MoO40.05g/L，依次称取几种无机盐，配成微量元素溶液待用；
微量元素溶液2：按照浓度(w/v)为ZnSO4 0.75g/L，MnSO4 1.5g/L，H3BO4 0.15g/L，CuSO4 0.075g/L和Na2MoO4 0.05g/L，依次称取几种无机盐，配成微量元素溶液待用；
微量元素溶液3：按照浓度(w/v)为ZnSO4 0.75g/L，MnSO4 1.5g/L，H3BO4 0.15g/L，CoCl2 0.15g/L，依次称取几种无机盐，配成微量元素溶液待用；
微量元素溶液4：按照浓度(w/v)为CuCl2 0.75g/L，H3BO4 0.15g/L和Na2MoO40.05g/L，依次称取几种无机盐，配成微量元素溶液待用。
对比例1
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，其中包括0.1mL的微量元素溶液3，按60g/L的添加量加入菜籽油，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵10天，采用高效液相色谱-质谱联用技术将不同碳原子数的单鼠李糖脂和双鼠李糖脂通过面积归一法计算发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
对比例2
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，其中包括0.1mL的微量元素溶液4，按60g/L的添加量加入菜籽油，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵10天，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
实施例1
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，其中包括0.1mL的微量元素溶液1，按60g/L的添加量加入橄榄油，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵6天，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
向发酵培养基中分别加入0.5mL/L、1mL/L和1.5mL/L微量元素溶液1，发现加入1mL/L和1.5mL/L的微量元素溶液1与对比例1和对比例2发酵8天的产量接近，因此向发酵培养基中加入微量元素溶液1发酵6天即可结束发酵，而不加入微量元素溶液时，在此条件下进行发酵，得到相同的产量需发酵10天甚至更久。橄榄油作唯一的碳源时，单糖双脂和双糖双脂的比例分别为78％和22％。
实施例2
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，包括0.15mL的微量元素溶液1，按60g/L的添加量加入甘油作碳源，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵6天，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
向发酵培养基中添加入微量元素溶液1后，发现发酵6天的实施例2与对比例1和对比例2发酵8天的产量接近，因此向发酵培养基中加入微量元素溶液1发酵6天即可结束发酵，而不加入微量元素溶液时，在此条件下进行发酵，得到相同的产量需发酵10天甚至更久。甘油作唯一碳源时，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例分别为33％和67％。
实施例3
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，包括0.15mL的微量元素溶液1，按40g/L的添加量加入菜籽油和20g/L的添加量加入甘油，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵6天，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
向发酵培养基中添加入微量元素溶液1后，发现发酵6天的实施例3与对比例1和对比例2发酵8天的产量接近，因此向发酵培养基中加入微量元素溶液1发酵6天即可结束发酵，而不加入微量元素溶液时，在此条件下进行发酵，得到相同的产量需发酵10天甚至更久。菜籽油和甘油作混合碳源，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例分别为64％和36％。
与40g/L菜籽油和20g/L甘油作混合碳源的实验结果接近，当采用60g/L的菜籽油作碳源时，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂比例变化不大，在60％和40％左右。
当仅加入菜籽油作碳源，同时加入微量元素溶液1，分别按20g/L、60g/L和90g/L的添加量加入菜籽油，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于30℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵6天，测定发酵液中鼠李糖脂含量，计算碳源转化率。菜籽油添加量为20g/L、60g/L和90g/L时，对应的鼠李糖脂产量依次为14.28g/L、55.26g/L和37.96g/L，计算得碳源转化率分别为71.4％、92.1％和42.18％，根据产量和碳源转化率可知，在不影响鼠李糖脂产量的情况下，其中60g/L的菜籽油添加量，碳源转化率可达到90％以上，通过筛选最佳的植物油用量和鼠李糖脂产量，保证菌体的高碳源利用率，可明显提高碳源转化率。
实施例4
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，包括0.15mL的微量元素溶液2，按40g/L的添加量加入菜籽油和20g/L的添加量加入甘油，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵6天，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
向发酵培养基中添加入微量元素溶液2后，发现发酵6天的实施例4与对比例1、和对比例2发酵8天的产量接近，因此向发酵培养基中加入微量元素溶液2发酵6天即可结束发酵，而不加入微量元素溶液时，在此条件下进行发酵，得到相同的产量需发酵10天甚至更久。添加微量元素溶液2后，菜籽油和甘油作混合碳源的单双鼠李糖脂比例与微量元素1接近，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例分别为64％和36％。
实施例5
选用一株铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCCM 2016686)，实验室所用菌种一般保藏在-80℃中，取出冻存管后放置在37℃水浴或室温融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃恒温培养箱培养18h，即可观察到单菌落。
挑取固体平板上的单菌落接种至已经121℃灭菌处理20min的种子培养基中培养24h。
采用500mL锥形瓶，装入发酵培养基100mL，包括0.1mL微量元素溶液1，按40g/L的添加量加入橄榄油和20g/L的添加量加入甘油，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至室温，按6％的接种量接种已准备好的种子培养液，用无菌过滤封口膜封口后置于37℃恒温摇床，转速为200rpm，发酵6天，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定发酵液中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
向发酵培养基中添加入微量元素溶液后，发现发酵6天的实施例5与对比例1和对比例2发酵8天的产量接近，因此向发酵培养基中加入微量元素溶液1发酵6天即可结束发酵，而不加入微量元素溶液时，在此条件下进行发酵，得到相同的产量需发酵10天甚至更久。使用橄榄油和甘油作为混合碳源时，单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例分别为48％和52％。

Claims (10)

1.一种鼠李糖脂发酵方法，其包括如下步骤：
(A)选用铜绿或恶臭假单胞菌，进行菌种活化；
(B)从活化菌种中挑取单菌落接种至种子培养基中培养得到种子液；
(C)将种子液按1-10vol％的接种量接种至发酵培养基中培养，其中，根据产物所需的单双鼠李糖脂的比例，发酵培养基选择使用不同的碳源，且发酵培养基包括微量元素，所述微量元素至少包含H3BO4、CuSO4和Na2MoO4。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述微量元素以溶液的形式与发酵培养基混合，微量元素溶液中包括H3BO4 0.12-0.18g/L，CuSO40.065～0.085g/L和Na2MoO40.03～0.07g/L，优选H3BO4 0.15g/L，CuSO4 0.075g/L和Na2MoO4 0.05g/L，微量元素溶液和发酵培养基按0.05-0.15％的比例混合。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述微量元素溶液中还包括ZnSO40.65-0.85g/L，优选约0.75g/L，MnSO4 1.3-1.7g/L，优选约1.5g/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的发酵方法，其特征在于，发酵培养基中的碳源为葡萄糖、甘油、植物油中的一种或几种作为复合碳源；所述植物油选自菜籽油、花生油、大豆油、玉米油、橄榄油、棉籽油、椰子油和棕榈油中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，当所需产物中单鼠李糖脂为比例高达70％以上的优势产物时，单独采用20-130g/L的橄榄油作碳源；当所需产物中双鼠李糖脂为占比60％以上的优势产物时，采用10-90g/L甘油作唯一碳源。
6.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，选用20-130g/L植物油和10-90g/L甘油作混合碳源，根据植物油种类的不同来改变单双鼠李糖脂的比例。
7.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，菌种活化包括选用一株铜绿或恶臭假单胞菌，取出冻存管后放置在37℃±1℃水浴或室温融化，接种环挑取一环接种至琼脂培养基上，30℃±1℃恒温培养箱培养12-20h，即可观察到单菌落。
8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，种子液培养包括挑取固体平板上的单菌落接种至已经灭菌处理的种子培养基中培养15-24h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的发酵方法，其特征在于，发酵包括将种子液按1-10％的接种量接种至发酵培养基中，自然pH条件下，28-37℃，200-400rpm，培养6-10天。
10.根据权利要求1-9任一项所述的发酵方法，其特征在于，发酵包括向发酵培养基中按0.5-1.5mL/L的比例加入微量元素溶液，灭菌处理，按1-10％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，自然pH条件下，30-37℃，200-400rpm，培养6-10天。
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