CN106282041A - 一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株及利用该突变株进行半固态发酵生产表面素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株及利用该突变株进行半固态发酵生产表面素的方法，所述的突变株命名为B.S.surfactin 1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No.10270。表面素(surfactin)是由含有sfp基因的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisssp.)通过发酵的方式，所生产的一种脂肽类生物表面活性剂，目前表面素的生产大多是以液态发酵来进行，但是由于生产过程中，除泡剂的添加造成后续纯化上的困难，以至于生产成本过高，因此，本发明以泰国海水虾池所分离出的枯草芽孢杆菌进行物理或化学突变，利用sfp基因筛选出高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，再将突变株以半固态发酵方式生产表面素。

Description

一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株及利用该突变株进行半固态发酵生产表面 素的方法
技术领域
本发明涉及一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，以及利用该突变株进行半固态发酵生产表面素的方法。
背景技术
生物表面活性剂是由微生物在一定条件下发酵产生的二次代谢产物，同时具有亲水性和疏水性的两性结构。生物表面活性剂除了具有与化学合成表面活性剂相同或相近的物理及化学性质，亦具有结构复杂、专一性强、低毒性、可生物降解、环境友善及可利用廉价农副产品进行发酵生产等特性。而某些生物表面活性剂具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤…等等药理作用。大多数的脂肽类生物表面活性剂具有抗微生物作用，也被称为抗生素，目前发现的微生物脂肽主要有：表面素(surfactin)、丰原素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。目前，生物表面活性剂已广泛地应用在化妆品、食品、石油及药学等领域。
1968年Arima等人发现枯草芽孢杆菌生产的一种脂肽类生物表面活性剂，其活性极强，并将其命名为表面素(surfactin)，Arima等人当时制造的表面素产量仅有0.04-0.05g/L。1981年Cooper等人采用含4％葡萄糖的基本无机盐培养基培养枯草芽孢杆菌ATCC21332后，收集其泡沫并分离表面素，其产量为0.78g/L。1989年Mulligan等人发现一枯草芽孢杆菌紫外光突变株ATCC51338，其表面素产量为1.124g/L。1997年Kim等人使用一个改良的Cooper培养基，在限氧条件下培养枯草芽孢杆菌C9，其表面素产量为7.0g/L。2002年魏毓宏等人使用一种强化无机盐培养基，以控制pH值方式，使得表面素的产量可以达到约3.5g/L。
目前枯草芽孢杆菌生产表面素的方式主要是以液态发酵为主，由于液态发酵可以调控的发酵参数较多，但主要调控的参数为培养基成份的组成、发酵条件的探讨与高产量菌株筛选。研究结果显示培养基中，不同的碳源确实会影响表面素的产量(Lang,et al.,1999；Wei,et al.,2004；Wei,et al.,2005)；以葡萄糖做为碳源可有效被枯草芽孢杆菌利用，但是培养基中，若含有过多的葡萄糖会造成pH值下降，而表面素产量也下降，因此得知表面素的生成与培养基中pH值有相当密切的关系(Yeh,et al.,2005)；于培养基中添加长链碳也有助于增加表面素的产量(Ghribi andEllouze-Chaabouni,2011)。不同氮源会造成两种影响：1.产量：调整Cooper在1981年提出的培养基配方，改变其氮源成分并培养于无氧的环境下，可提高表面素产量至7g/L(Kim,et al.,1997)；2.表面素结构：在培养液中添加不同的疏水性胺基酸会改变表面素的结构(Peypoux,et al.,1992)。当培养液中的二价及三价铁离子的浓度由μg提升到mg，可有效增加枯草芽孢杆菌ATCC21332的表面素产量，然而铁离子的添加亦会造成培养基中pH值的下降，当pH值小于5时，枯草芽孢杆菌将不分泌表面素，因此添加铁离子需配合调整pH值以利表面素生成(Wei and Chu,1998；Wei and Chu,1998)；于培养基中添加锰离子可以显著提高表面素的产量，亦不会影响到枯草芽孢杆菌的生长(Wei and Chu,2002)；将枯草芽孢杆菌培养于无金属离子镁、钾、锰、铁的培养基中，发现其细胞生长与表面素的产量皆明显下降，因此证明此四种离子虽然为微量元素，但在培养过程中是不可或缺的(Wei,et al.,2007)。除了培养基中的成份会影响表面素的生成外，有学者指出在培养基中添加固体载体能有效增加表面素的产量，由于活性碳在发酵过程中不易分解，易与培养基分离，因此利用活性碳作为载体，能增加细胞量，延缓细胞进入停滞期，提高表面素的产量(Yeh,et al.,2005)。
液态发酵的缺点，由于发酵过程中，需要添加除泡剂，进而导致后续纯化的困难，故需改变发酵方式来增加表面素的生产。
除了液态发酵方式之外，亦还有固态发酵方式，其基质成本较低，在发酵工业上是一种重要的发酵方式。文献指出枯草芽孢杆菌ATCC 21332以马铃薯加工后废弃物发酵，低固体含量的组别其表面素产量较高固体含量组别佳(Nitschke,et al.,2004)；枯草芽孢杆菌MI113以豆腐加工后所产生的副产品与废弃物于37℃发酵48小时后，其表面素产量为2g/kg(Ohno,et al.,1995)；枯草芽孢杆菌(Bacilluspolyfermenticus KJS-2)以黄豆发酵所生产的表面素，具有抗菌活性，其最小抑菌活性为0.05mg/mL(Kim,et al.,2009)。
固态发酵的缺点，包括：1.水分低限制了物质与能量的传递速率，发酵时产生的热能不易消除，营养物质会形成浓度梯度，导致发酵不平均；2.发酵参数不易侦测(如pH质、生物量)，再现性差；3.基质搅拌不易，容易导致微生物的生长环境被破坏；4.发酵时间较液态发酵长。
表面素是目前所知表面活性最强的生物表面活性剂之一，自从被发现以来，受到持续的关注，但是由于产量很低以及生产成本过高的问题，一直是脂肽类生物表面活性剂达不到商业化用途的原因，截至目前为止，仍无法实现表面素的工业化大规模生产，因此，许多发明者致力于提高表面素的产量。除此之外，由于生物发酵过程本身的不稳定性，从实验室技术向工业化生产技术转化是一个很难的问题。
如何降低生产成本是目前研发的主要目标，这需要选育优良的高产量菌株、合适且廉价的培养基以降低发酵成本并提高单位产量。此外，发酵后的基质的再利用与开发高附加值产品，这正是本发明要解决的技术问题。
本发明旨在于克服现有技术的不足，提供了一种脂肽类生物表面活性剂的商业化制备方法。此方法基于改善固态发酵的部分缺点采用半固态发酵。因为半固态发酵含水量较固态发酵高，可以改善物质与能量的传递速率，减少发酵时产生的热能，加快发酵时间等问题，此外，藉由改变半固态发酵方式的含水量、发酵基质等发酵基本条件，并额外添加油脂与胺基酸补充其碳氮源，以提高半固态发酵时表面素的产量。这种生产技术具有产量高、效率高、发酵周期短、制程简易，使得生产成本大量降低，适合商业化用途及工业化大规模生产，有助于脂肽类生物表面活性剂的推广及应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株。
本发明的目的之二是提供一种利用所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株进行半固态发酵生产表面素的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
筛选高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，该方法包括以下步骤：
步骤一：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ssp.)接种至营养液体培养基(Nutrientbroth)，得到一活化菌液；其中该营养液体培养基包括蛋白胨(peptone A)5.0g/L、氯化钠(NaCl)5.0g/L、牛肉萃取物(beef extract)1.5g/L、酵母萃取物(yeast extract)1.5g/L、pH值为7.4±0.2。
步骤二：将活化菌液以物理或化学方法突变处理，得到一混合菌液；其中该物理方法是以紫外光(UV)波长254nm，3,500-4,500μW/cm2，处理1-50秒；该化学方法是以15-20μg/ml溴化乙锭(EtBr)于25-30℃处理20-28小时。
步骤三：将该混合菌液接种于一营养固体培养基(Nutrient agar)，于25-30℃培养12-20小时，取得单一菌落；其中该营养固体培养基是包括0.5％蛋白胨(peptone A)、0.3％牛肉萃取物(beef extract)、0.3％酵母萃取物(yeast extract)、0.5％氯化钠(NaCl)、1.5％琼脂(agar)、pH值为6.8。
步骤四：将该单一菌落接种于一无机盐液体培养基(Mineral salt medium)，于25-30℃培养20-28小时后，由该单一菌落筛选出高产表面素的突变菌株；其中该突变菌株是sfp蛋白表达量较高者，当sfp蛋白表达量越高，其表面素生成量越多；该无机盐液体培养基包括2-6％(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氢钠(Na2HPO4)、25-35mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、45-55mM硝酸铵(NH4NO3)、5-10mM氯化钙(CaCl2)、2-6mM乙二胺四乙酸钠(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化镁(MgSO4.7H2O)、1-3mM含水硫化铁(FeSO4.7H2O)。
经筛选得到一株高产表面素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株，命名为B.S.surfactin 1，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC No.10270，保藏日期为2014年12月31日。
进一步的，本发明还提出了一种利用所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株进行半固态发酵生产表面素的方法，该方法包括以下步骤：
A、将该高产表面素的枯草芽孢杆菌突变菌株接种至含无机盐液体培养基与黄豆的混合物，进行半固态发酵，得到一发酵物；
B、将该发酵物进行粗产物萃取，得到一黄色沉淀物；
C、将该黄色沉淀物纯化，即得到纯化的表面素。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的无机盐液体培养基包括2-6％(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氢钠(Na2HPO4)、25-35mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、45-55mM硝酸铵(NH4NO3)、5-10mM氯化钙(CaCl2)、2-6mM乙二胺四乙酸钠(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化镁(MgSO4.7H2O)、1-3mM含水硫化铁(FeSO4.7H2O)。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变菌株的接种体积与该混合物中黄豆体积的比例为5:100-10:100。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的无机盐液体培养基(Mineral saltmedium)的体积与该混合物中黄豆体积的比例为25:100-35:100。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤A的半固态发酵是于温度30-40℃，湿度80-90％，发酵2-3天。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤B的粗产物萃取，其步骤包括：
A、将步骤A的一发酵物以纯水清洗、进行固液分离；
B、将该固液分离的液体以低温离心，取其上清液后，再以低温离心，收集沉淀物；
C、将该沉淀物悬浮于二氯甲烷(dichloromethane)中，取其有机层，得到一黄色沉淀物。
在本发明所述的方法中，该黄色沉淀物为一粗表面素。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤C的纯化是以磁吸搅拌式超过滤装置(Amicon magnetically stirred ultrafiltration cell)及中空纤维超滤滤芯(Hollow fiberultrafiltration cartridges)进行纯化。
本发明提供了一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，以及利用该高产量枯草芽孢杆菌突变株进行半固态发酵生产表面素的方法，其表面素生产量可以达到7.11g/kg。
附图说明
图1是比较半固态发酵与固态发酵方式的表面素生成量。
图2是粗表面素的HPLC图谱。
图3是枯草芽孢杆菌生长曲线与表面素产量关系。
图4是筛选sfp基因表达量高者为sfp高量产表面素枯草芽孢杆菌突变株的标准。
图5是表面素的表面张力测定。
图6是表面素的乳化活性测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例一、筛选高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株
将泰国海水虾池所分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ssp.)以营养液体培养基(Nutrient broth)活化后，以20μg/ml溴化乙锭，于30℃突变处理24小时，再将突变处理后的菌液，以营养固态培养基(Nutrient agar)于30℃培养16小时，取单一菌落；将单一菌落以无机盐液体培养基于30℃培养24小时，抽取其RNA，以引物(primers)(见表一)分析sfp基因与rpo基因的相对定量，与对照组(未经溴化乙锭处理的菌株)做比较，筛选sfp基因表达量高者为高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株命名为B.S.surfactin 1，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC No.10270，保藏日期为2014年12月31日。
表一、引物序列
引物 序列 碱基数
SFP-P1(SEQ ID NO 1) 5’-AAAAC GGRAG AWAT-3’ 14
SFP-P2(SEQ ID NO 2) 5’-AARCG RAASC GATMA G-3’ 16
rpoβ-F(SEQ ID NO 3) 5’-GTGGT TTCTT GATGA GGGTC-3’ 20
rpoβ-R(SEQ ID NO 4) 5’-GGAAT GACAG TTGCG GTA -3’ 18
R＝A/G，W＝A/T，S＝C/G，M＝A/C。
实施例二.半固态发酵法生产表面素
将有机黄豆(美国产)浸泡16小时，以黄豆量的10％水量为添加量的比例于121℃蒸煮30分钟，待冷却至常温后接种10％高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株(CGMCCNo.10270)的菌液，并分别添加30％灭菌水(半固态发酵)、30％无机盐液体培养基(半固态发酵)与不添加任何水份(固态发酵)，混合均匀后放至铁盘上并以纱布覆盖，于30℃，湿度80％，培养48小时，每24小时取发酵黄豆进行分析。
该无机盐液体培养基包括2-6％(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氢钠(Na2HPO4)、25-35mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、45-55mM硝酸铵(NH4NO3)、5-10mM氯化钙(CaCl2)、2-6mM乙二胺四乙酸钠(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化镁(MgSO4.7H2O)、1-3mM含水硫化铁(FeSO4.7H2O)。
试验结果如图1所示，结果表明以无机盐液体培养基进行半固态发酵的方式相较于另外2组，可以于发酵第2天，得到最佳的表面素产量。
实施例三.粗表面素的分析
将实施例二得到的发酵物进行粗产物萃取，得一黄色沉淀物；其粗产物萃取步骤包括：
A、将发酵物以纯水清洗、将清洗过后的发酵物装入250网目滤袋，以脱浆机进行固液分离；
B、将该固液分离的液体以5000rpm于4℃，离心15分钟，取其上清液，以浓盐酸调整pH值至4.0，再以10000rpm于4℃，离心30分钟，收集沉淀物；
C、将该沉淀物悬浮于二氯甲烷(dichloromethane)的分液漏斗中，均匀震荡静置使其分层，再取其有机层，以减压浓缩机将有机溶剂挥发，即得一黄色沉淀物，为一粗表面素。
D、将该黄色沉淀物溶于去离子水中，使用0.22μm滤膜过滤后，以逆相高效能液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析。利用Techsphere5mm ODS C18逆相管柱(reverse column)，将管柱温度控制在30℃，移动相为3.8mM，三氟乙酸：乙腈＝1：4(trifluroacetic acid:acetonitrile)，流速为1ml/min，波长为210nm，样品量为20μl(Wei et al.,2003)。
试验结果如图2所示：标准品为枯草芽孢杆菌ATCC 21332市售标准品(Sigma)。样本为高产量突变株所生产的表面素。由先前研究指出，以MALDI-TOF分析其17分钟的尖峰(peak)分子量最为接近表面素分子量1022kD，因此采用此时间点作为定量、定性分析。
实施例四.表面素的纯化
将实施三中的该黄色沉淀物溶于去离子水中，使用0.22μm滤膜过滤后，以装有不同分子量大小(molecular weight cut-offs，MWCO)的纤维素膜(cellulose membrane)的磁吸搅拌式超过滤装置(Amicon magnetically stirred ultrafiltration cell)在3kg/cm2的压力下进行浓缩，再通过44.5mm中空纤维超滤滤芯(Hollow fiber ultrafiltrationcartridges)于1.7x105帕(Pa)压力下收集其过滤物，即得一纯表面素。
实施例五.枯草芽孢杆菌生长曲线与表面素产量的关系
于高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株生长期间，每12小时取其菌液并以分光亮度计600nm测其吸光值，若吸光值大于0.7，则先稀释后再测定；此外，于每12小时取10ml菌液，以逆相高效能液相层析仪分析其表面素产量。
试验结果如图3所示：sfp枯草芽孢杆菌突变株在培养0到48小时为对数期(logarithmic phase)，48小时后进入平稳期(stationary phase)，而表面素的产量于培养后24小时开始增加，于培养后60小时达到稳定产量。
实施例六.sfp基因表达量与表面素产量的关系
取经过突变处理的单一菌落，以无机盐液体培养基于30℃培养24小时，抽取其RNA，分析sfp基因与rpo基因的相对定量。
试验结果如图4所示：sfp/rpo的基因相对表达量较高者，其所能生成的表面素量亦较多。
实施例七.表面素的表面张力测定
以DST 30Series Surface Tension Meter进行表面张力测定，纯水做为控制组，其表面张力约为72mN/m，将表面素依序稀释浓度为5×10-4M、1×10-4M、5×10-5M、1×10-5M、5×10-6M、1×10-6M、5×10-7M、1×10-7M、5×10-8M、1×10-8M，可得其临界微胞浓度(critical micelle concentration,CMC)，试验结果如图5所示。
实施例八.表面素的乳化特性测定
参考Cooper等人所使用的方法，将表面素溶于纯水中并配制成不同浓度，取出2ml稀释后的表面素溶液并添加3ml煤油于试管中，以vortex震荡2分钟后，于室温下静置24小时，测量乳化层高度与溶液总高度的比值乘上100％即为该待测样品的乳化指数。油品乳化能力的大小以乳化指数(emulsification index,E24)表示的，试验结果如图6所示。
实施例九.表面素的抑菌试验
分别将大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶澡弧菌(Vibrio alginolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、鲑弧菌(Vibrio salmonicida)、产气单胞菌(Aeromonashydrophila)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)培养于LBA(E.coli□DH5α)或TSA(+1.5％NaCl)上，于37℃培养16小时后，刮下菌落并溶于指定培养液；使OD540为1时(浓度约为1×109/c.c.菌数)，取500μl菌液加入500μ的LB或TSB(+1.5％NaCl)，使菌液浓度1×104.5/c.c.菌数；使用96孔培养皿在每个凹槽加入130μl的菌液，菌液浓度为1×104.5/c.c.菌数，再加入20μl不同浓度的化学合成抗菌胜肽。于37℃培养16小时后，观察呈现澄清的菌液(没有生长)的最低抗菌胜肽浓度，即为最小抑菌浓度。
试验结果如表二所示：与枯草芽孢杆菌ATCC21332所生产的表面素比较，由高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，所生产的表面素其最小抑菌浓度为96.5μΜ。
表二、枯草芽孢杆菌ATCC21332与高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株所生产的表面素的最小抑菌浓度(μΜ)比较。

Claims (10)

1.一株高产表面素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株，命名为B.S.surfactin 1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No.10270。
2.权利要求1所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株在生产表面素中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株进行半固态发酵生产表面素的方法，该方法包括以下步骤：
A、将该高产表面素的枯草芽孢杆菌突变菌株接种至含无机盐液体培养基与黄豆的混合物，进行半固态发酵，得到一发酵物；
B、将该发酵物进行粗产物萃取，得到一黄色沉淀物；
C、将该黄色沉淀物纯化，即得到纯化的表面素。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的无机盐液体培养基包括2-6％(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氢钠(Na2HPO4)、25-35mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、45-55mM硝酸铵(NH4NO3)、5-10mM氯化钙(CaCl2)、2-6mM乙二胺四乙酸钠(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化镁(MgSO4.7H2O)、1-3mM含水硫化铁(FeSO4.7H2O)。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述的sfp高产量枯草芽孢杆菌突变菌株的接种体积与该混合物中黄豆体积的比例为5:100-10:100。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述的无机盐液体培养基(Mineralsaltmedium)的体积与该混合物中黄豆体积的比例为25:100-35:100。
7.如权利要求3所述的方法，其中步骤A的半固态发酵是于温度30-40℃，湿度80-90％，发酵2-3天。
8.如权利要求3所述的方法，其中步骤B的粗产物萃取，其步骤包括：
A、将步骤A的一发酵物以纯水清洗、进行固液分离；
B、将该固液分离的液体以低温离心，取其上清液后，再以低温离心，收集沉淀物；
C、将该沉淀物悬浮于二氯甲烷(dichloromethane)中，取其有机层，得到一黄色沉淀物。
9.如权利要求3或8所述的方法，其中该黄色沉淀物为一粗表面素。
10.如权利要求3所述的方法，其中步骤C的纯化是以磁吸搅拌式超过滤装置(Amicon magnetically stirred ultrafiltration cell)及中空纤维超滤滤芯(Hollow fiberultrafiltration cartridges)进行纯化。
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