CN110591956B

CN110591956B - 一种蔗糖小迫氏菌及其制备的生物乳化剂

Info

Publication number: CN110591956B
Application number: CN201910918348.1A
Authority: CN
Inventors: 鄢贵龙; 汪伟; 周玉珍; 赵利琴; 杨依晶; 王志倩; 姚佳怡
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: CN110591956A

Abstract

本发明公开了一种蔗糖小迫氏菌，所述蔗糖小迫氏菌为Kosakonia sacchari HYNU‑P26，该菌株于2019年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称：GDMCC）（广东省广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所），保藏编号：GDMCC 60704。本发明的菌株可用于发酵制备生物乳化剂，其生产的生物乳化剂具有稳定性好、能耐受一定盐度、可适应较宽泛pH值、可以被生物降解、对环境无污染等特性，具有广阔的应用前景和良好的经济效益。

Description

一种蔗糖小迫氏菌及其制备的生物乳化剂

技术领域

本发明涉及属于生物技术领域，特别涉及一种蔗糖小迫氏菌及其制备的生物乳化剂。

背景技术

乳化剂是能够改善乳浊液中各种构成相之间的表面张力，使之形成均匀稳定的分散体系或乳浊液的物质。乳化剂是表面活性物质，分子中同时具有亲水基和亲油基，它聚集在油/水界面上，可以降低界面张力和减少形成乳状液所需要的能量，从而提高乳状液的稳定性。目前，各个工业体系中使用的乳化剂主要以石油为原料经化学合成而来，化学合成乳化剂虽然得到广泛的使用，但也还存在自身的不足。有些不能耐高温，如一些非离子型乳化剂，升高温度时氢键会断裂，水分子脱落，导致亲水性下降而从水中析出，乳化能力变差。阴离子型乳化性剂则会在高盐度的水中析出。阳离子型乳化剂在酸性介质中才具有良好的性能，而在碱性介质中容易析出而失去乳化活性。此外更为严重的问题是化学合成乳化剂在自然界较难降解，其大量使用，已经形成较大的环境污染问题。由于理化性质原因在某些条件使用受限和在生产和使用过程中可能对环境造成污染等缺陷，使化学合成乳化剂的应用前景受到极大的挑战。因此，寻找更为绿色和性能优良的乳化剂成为人们关注的热点。

生物乳化剂主要是指一类由微生物或植物在一定条件下代谢产生的具有一定表面活性的代谢产物，其分子结构包含极性和非极性的基团，因而具有亲水、亲油的表面活性。生物乳化剂一般分子量较大、临界胶束浓度较低，具有优异的表面性能和高稳定性，适用于极端温度、pH值和盐度，而且生物毒性极低，完全可生物降解，对环境友好，因此是合成表面活性剂的理想代替品。由于其具有的诸多优点，已经被广泛用于农业、食品、医药、环境修复、日用化学品、石油开采等多个领域，而全球对生物乳化剂的需求量在进一步的提高，因此生物乳化剂具有巨大的发展前景，在未来有逐步替代化学合成的表面活性剂的趋势。

由于微生物生产的表面活性剂较为适合工业化大规模生产，而且随着人们环保和可持续发展意识的增强，生物乳化剂的开发越来越活跃。目前已报道的生物乳化剂有糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。目前已报道产表面活性剂的微生物包括细菌、真菌及酵母菌等。其中细菌占大多数，主要的生产菌有假单胞菌(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.) 链霉菌( Streptomyces sp.)、不动杆菌（Acinetobacter sp.）及固氮菌(Azotobacter sp.)等。但是上述报道的有些菌生产的生物乳化剂乳化效果较弱，有些耐温耐酸碱范围较窄，或者生产周期较长，因此寻找更优良的生物乳化剂生产菌及生产方法很有必要。

发明内容

本发明的主要目的在于提供蔗糖小迫氏菌及其制备的生物乳化剂，利用Kosakonia sacchari HYNU-P26发酵制备的生物乳化剂，其具有稳定性好、能耐受一定盐度、可适应较宽泛pH值、可以被生物降解、对环境无污染等特性，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种蔗糖小迫氏菌，所述蔗糖小迫氏菌为Kosakonia sacchari HYNU-P26，该菌株于2019年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称：GDMCC）（广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所），保藏编号：GDMCC NO：60704。

一种生物乳化剂，所述生物乳化剂是通过权利要求1所述的蔗糖小迫氏菌发酵制得。

一种生物乳化剂的制备方法，包括根据下步骤：

S1. 将Kosakonia sacchari HYNU-P26接种至LB固体平板上，将LB固体平板置于35℃恒温培养箱中培养24h，用接种环从LB固体平板上挑取单菌落至LB液体培养基中，于35℃，150rpm下摇床培养24h作为种子液备用；

S2. 将S1培养好的种子液接入培养基中发酵，发酵后得到含生物乳化剂的发酵液；

S3. 将S2所得的发酵液离心，收集上清液；

S4. 将S3收集上清液在60℃-70℃真空浓缩得浓缩液；

S5. 向S4的浓缩液中加入3-5体积无水乙醇，沉淀后8000 rpm离心10 min-20min，收集沉淀物真空干燥得生物乳化剂。

进一步地，所述S2中种子液的接入量按体积比占比为1-5%，即菌种量体积与接种后培养液的体积比， V_菌种/（V_菌种+V_{种子培养基}）。

进一步地，所述S2中培养基组成和质量含量为：葡萄糖2%，麦芽糖0.5%，硫酸铵0.1%，蛋白胨0.5%和氯化钠0.1%，培养基的pH值为7.0。

进一步地，所述S2发酵条件：摇床速度为150r/min，培养温度为35℃，培养时间为72h。

进一步地，所述S4中所得浓缩液的体积为所用上清液体积的1/10。

与现有技术相比，本发明具有根据下有益效果：

本发明提供的菌株制备生物乳化剂生产周期短，成本低，所生产的生物乳化剂具有良好的乳化效果，对热及酸碱的稳定性高，乳化剂本身无色无味，与多种盐类有很好的相容性，且微生物发酵生产的生物乳化剂适合工业化大规模生产，不受地域、季节等条件限制，同时本发明生产的生物乳化剂及生产中产生的废弃物都能生物降解，符合当前环保和可持续发展的要求，因此本发明提供的生物乳化剂具有良好的发展前景，也能满足各行业对乳化剂的需求。

附图说明

图1不同质量浓度生物乳化剂的乳化指数

图2生物乳化剂在不同pH值下乳化指数

图3生物乳化剂在不同温度下乳化指数

图4生物乳化剂在不同盐浓度下乳化指数

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：菌株的分离筛选、鉴定

先用自来水冲洗新鲜野马追根和茎，除去表面的泥土等杂质，再用无菌水冲洗3遍，等植物稍干之后，切成0.5 cm左右长的样块，样块用75%乙醇消毒4 min，无菌水漂洗三次，再用0.1%升汞灭菌4 min，最后用无菌水漂洗三次，用无菌滤纸将植物样品表面水分吸干，用无菌镊子和手术刀将样品撕开，放置于平板上，每平板放置4片，30 ℃培养；待各组织的切面处长出菌落后，挑取菌体并进行划线分离获得纯培养物，获得蔗糖小迫氏菌 HYNU-P26，保存于斜面。

按照生工EZ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取总DNA。以上述提取的总DNA为模板，采用引物50F/1492R进行PCR扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，由电泳结果切割所需DNA目的条带，按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行纯化回收。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序。测序结果如下：

TTGCTTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGGAATGGTTAATAACCATTGCCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTACCAGAGATGCATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTCCGGGAGGGCCCTACC

将测得菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析，经BLAST序列比对及系统进化树分析，结果表明：本发明的菌株位于系统发育树与蔗糖小迫氏菌（Kosakonia sacchari）有最近的亲缘关系，HYNU-P26 16S rRNA基因序列与Kosakonia sacchari strain OFM30的同源性为99%，与Kosakonia sacchari strain OFF14同源性为99%，结合进化树，确定其为蔗糖小迫氏菌（Kosakonia sacchari）。

本发明提供的Kosakonia sacchari HYNU-P26，该菌株于2019年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称：GDMCC）（广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所），保藏编号：GDMCC NO：60704。

实施例2 生物乳化剂的发酵、分离

本实施例说明用蔗糖小迫氏菌制备生物乳化剂的方法，包括以下步骤：

S1. 将Kosakonia sacchari HYNU-P26接种至LB固体平板上，将平板置于35℃恒温培养箱中培养24h；用接种环从LB固体平板上挑取单菌落至LB液体培养基中，于35℃，150rpm下摇床培养24h作为种子液备用；

S2.将S1培养好的种子液按体积比为1%接入发酵摇瓶，发酵培养基质量含量和组成为：葡萄糖2%，麦芽糖0.5%，硫酸铵0.1%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.1%；pH值为7.0；摇床速度为150r/min，培养温度为35℃，培养时间为72h，发酵结束后得到含生物乳化剂的发酵液；

S3.将S2所得的发酵液于8000 rpm离心10 min，收集上清液；

S4.将S3收集的上清液在60℃真空浓缩至所用上清液体积的1/10；

S5.向S4的浓缩液中加入3体积无水乙醇，4℃低温沉淀24h后，8000 rpm离心10min，收集沉淀物真空干燥得生物乳化剂。

实施例3 生物乳化剂的发酵、分离

S2.将S1培养好的种子液按体积比为3%接入发酵摇瓶，发酵培养基质量含量和组成为：葡萄糖3%，麦芽糖1%，硫酸铵0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.1%；pH值为7.0；摇床转速为160r/min，培养温度为35℃，培养时间为72h，发酵结束后得到含生物乳化剂的发酵液；

S3.将S2所得的发酵液于8000 rpm离心15 min，收集上清；

S4.将S3收集的上清液于65℃真空浓缩至所用上清液体积的1/10；

S5.向S4的浓缩液中加入4体积无水乙醇，4℃低温沉淀24h后，8000 rpm离心15min，收集沉淀物真空干燥得生物乳化剂。

实施例4 生物乳化剂的发酵、分离

本实施例说明用Kosakonia sacchari HYNU-P26制备生物乳化剂的方法，包括以下步骤：

S1. 将蔗糖小迫氏菌HYNU-P26接种至LB固体平板上，将平板置于35℃恒温培养箱中培养24h；用接种环从LB固体平板上挑取单菌落至LB液体培养基中，于35℃，150rpm下摇床培养24h作为种子液备用；

S2.将S1培养好的种子液按体积比为5%接入发酵摇瓶，发酵培养基质量含量和组成为：葡萄糖4%，麦芽糖2%，硫酸铵0.5%，蛋白胨2%，氯化钠0.1%；pH值为7.0；摇床转速为180r/min，培养温度为35℃，培养时间为72h，发酵结束后得到含生物乳化剂的发酵液；

S3.将S2所得的发酵液于8000 rpm离心20 min，收集上清；

S4.将S3收集的上清液于70℃真空浓缩至所用上清液体积的1/10；

S5.向S4的浓缩液中加入5体积无水乙醇，4℃低温沉淀24h后，8000 rpm离心20min，收集沉淀物真空干燥得生物乳化剂。

实施例5 生物乳化剂的性能测定

乳化能力的测定：取一定浓度的生物乳化剂溶液10.0 mL、大豆油5.0 mL加入到刻度试管中，用高速分散均质机15000 r/min均质2 min。25 ℃静置24 h后测量乳化层体积占总体积的百分数（乳化指数E24）来表示乳化性能指数。如果E24大于等于50％，则说明乳状液是稳定的。

取实例4中得到的生物乳化剂以纯水配制不同质量浓度范围的水溶液，测定其乳化指数，结果如图1所示。从图中可以看出生物乳化剂的乳化指数随质量浓度的增大而升高，在生物乳化剂浓度达到0.5%时，其形成的乳化液在24 h内都不分层，乳化指数E24为100%，说明其具有很好的乳化能力。

用HCl或NaOH将纯水pH分别调至pH1、pH3、pH5、pH7、pH9、pH11，然后取实例4中得到的生物乳化剂以不同pH值水溶剂配制质量浓度为0.5%的水溶液，分别测定乳化指数，检测该生物乳化剂的耐酸碱性能。结果如图2所示，在pH1-pH11范围内，其乳化指数分别为86.3%、92.6%、100%、100%、89.60%、65.9%，并且在常温条件下可以长时间的保持乳化活性，表明该乳化剂可以耐受很宽的酸碱范围。

取实例4中得到的生物乳化剂以纯水配制质量浓度为0.5%的水溶液，在不同温度20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下水浴1h，冷却至室温，并在室温下放置24h后，分别测定乳化指数，结果如图3。E24值分别为100%、100%、100%、86.3％、62.1％，均大于50％，表明该生物乳化剂的耐热性能良好。

取实例4中得到的生物乳化剂以不同浓度的NaCl和CaCl₂溶液配制成质量浓度为0.3%的溶液，NaCl和CaCl₂溶液质量浓度分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，测定E24，判定生物乳化剂的耐盐度，结果见图4。在不同浓度的NaCl和CaCl₂溶液中，测定的乳化指数没有过大的变化，而且添加氯化钙可以轻微提高乳化指数，表明该生物乳化剂的具有良好的耐盐性能。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 一种蔗糖小迫氏菌及其制备的生物乳化剂

<130> 2019

<141> 2019-09-26

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari )

<400> 2

ttgcttctcg ggtgacgagt ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact gcctgatgga 60

gggggataac tactggaaac ggtagctaat accgcataac gtcgcaagac caaagagggg 120

gaccttcggg cctcttgcca tcagatgtgc ccagatggga ttagctagta ggtggggtaa 180

cggctcacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactggaact 240

gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 300

gcctgatgca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc 360

ggggaggaag ggggaatggt taataaccat tgccattgac gttacccgca gaagaagcac 420

cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta 480

ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtctgt caagtcggat gtgaaatccc cgggctcaac 540

ctgggaactg catccgaaac tggcaggctt gagtctcgta gagggaggta gaattccagg 600

tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag gaataccggt ggcgaaggcg gcctcctgga 660

cgaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 720

tccacgccgt aaacgatgtc tatttggagg ttgtgccctt gaggcgtggc ttccggagct 780

aacgcgttaa atagaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga 840

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta 900

cctggtcttg acatccacag aacttaccag agatgcattg gtgccttcgg gaactgtgag 960

acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac 1020

gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg gtccggccgg gaactcaaag gagactgcca 1080

gtgataaact ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgaccagggc 1140

tacacacgtg ctacaatggc gcatacaaag agaagcgacc tcgcgagagc aagcggacct 1200

cataaagtgc gtcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg 1260

ctagtaatcg tggatcagaa tgccacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320

cgtcacacca tgggagtggg ttgcaaaaga agtaggtagc ttaacctccg ggagggccct 1380

acc 1383

Claims

1.一种蔗糖小迫氏菌，其特征在于：所述蔗糖小迫氏菌为Kosakonia sacchari HYNU-P26，该菌株于2019年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称：GDMCC）（广东省广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所），保藏编号：GDMCC 60704。

2.一种生物乳化剂的制备方法，其特征在于：包括根据下步骤

S1. 将权利要求1所述的蔗糖小迫氏菌Kosakonia sacchari HYNU-P26（保藏编号：GDMCC 60704）接种至LB固体平板上，将LB固体平板置于35℃恒温培养箱中培养24h，用接种环从LB固体平板上挑取单菌落至LB液体培养基中，于35℃，150rpm下摇床培养24h作为种子液备用；

S3. 将S2所得的发酵液离心，收集上清液；

S4. 将S3收集上清液在60℃-70℃真空浓缩得浓缩液；

3.根据权利要求2所述的一种生物乳化剂的制备方法，其特征在于：所述S2中种子液的接入量按体积比占比为1-5%，即菌种量体积与接种后培养液的体积比， V_菌种/（V_菌种+V_{种子培养基}）。

4.根据权利要求2所述的一种生物乳化剂的制备方法，其特征在于：所述S2中培养基组成和质量含量为：葡萄糖2%，麦芽糖0.5%，硫酸铵0.1%，蛋白胨0.5%和氯化钠0.1%，培养基的pH值为7.0。

5.根据权利要求2所述的一种生物乳化剂的制备方法，其特征在于：所述S2发酵条件：摇床速度为150r/min，培养温度为35℃，培养时间为72h。

6.根据权利要求2所述的一种生物乳化剂的制备方法，其特征在于：所述S4中所得浓缩液的体积为所用上清液体积的1/10。