CN116083264A - 一种卡萨克尼亚氏菌株h41及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41，于2022年06月02日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62512；本申请提供的一种卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41，能固定大气中的氮气，可大幅度的增加土壤中速效氮的含量，提高植物对氮元素的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种卡萨克尼亚氏菌株H41及其应用。
背景技术
氮是植物需求量最大的矿质营养元素，是植物正常生长发育所必需的营养元素之一。据统计，我国土壤含氮量在0.2～2g/kg干土之间，多数氮含量在1g/kg干土以下。大面积施用化肥解决土壤的缺氮问题不仅成本高，还会引发环境污染问题。生物固氮每年可提供全球可利用还原态氮的大约60％，在解决氮素来源问题上有巨大的潜力，是发展农耕土地生产力的长久之计。此外，相比化学肥料，生物固氮技术新、成本低、污染小，是当今研究的热点，具有较好的应用前景。
微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不仅数量巨大，而且种类极多，许多微生物对土壤氮、磷、钾等养分的转化和供给起非常重要的作用。研发生物固氮技术的关键是要筛选出有固氮酶活性高、能高效固氮的菌株。固氮细菌株是土壤生态系统中十分重要的功能群之一，在土壤氮素循环中发挥着不可替代的作用。自身固氮菌株在土壤耕层分布较多，作物根际的自身固氮菌株可通过固氮酶作用为作物提供氮素营养，对提高作物产量具有一定作用，同时这类菌株还可产生大量植物激素，从而影响植物生理过程以促进植物生长。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41，该菌株能固定大气中的氮气，可大幅度的增加土壤中速效氮的含量，提高植物对氮元素的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量。
为了实现上述目的，本申请采用如下技术方案：本发明所述的卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41已于2022年06月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌株种保藏号为GDMCC NO.62512，分类命名为卡萨克尼亚氏菌株(Kosakoniasacchari)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明从泓森槐根中分离得到一株固氮菌株H41，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，16S rDNA鉴定结果验证其为卡萨克尼亚氏菌株(Kosakoniasacchari)。通过对其固氮酶活性进行测定，结果表明该菌株的固氮酶活性较高，为310.3nmol/(mL·h)，能有效固定大气中的氮气，可大幅度的增加土壤中速效氮的含量，提高植物对氮元素的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量。
本申请卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41具有如下形态和生理特性：
a、菌株体形态特性：卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41呈杆状。
b、菌株落形态特性：在LB琼脂平板上生长速度较快，菌株落圆形，呈现淡黄色，中间凸起，边缘湿润整齐(30℃，生长24小时)，菌株落直径1.8-2.0cm。最适生长温度是30℃及最佳生长pH值7。
本申请还提高了一种卡萨克尼亚氏菌株H41在提高植物根际土壤速效氮含量中的应用。
本申请还提高了一种卡萨克尼亚氏菌株H41在制备促进植物生长的制剂中的应用。
本申请还提高了一种促进植物生长的制剂，包括如上所述的卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41。
进一步的，所述卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41在制剂中的浓度为108～109个/ml。
本申请还提高了一种提高植物根际土壤速效氮含量的制剂，包括如上所述的卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41。
进一步的，所述卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41在制剂中的浓度为108～109个/ml。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：本申请提供的一种卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)H41，该菌株能固定大气中的氮气，可大幅度的增加土壤中速效氮的含量，提高植物对氮元素的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图中：
图1为菌株H41稀释后涂布于LB固体培养基上培养24小时后菌株落图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，本发实施例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 GDMCC NO.62512菌株的筛选
1、菌株分离、纯化
从泓森槐分离纯化得到可固氮的微生物，具体分离纯化步骤如下：其中分离所用培养基为DN无氮培养基：NaCl 0.1g，蔗糖10.0g，单独灭菌株的K2HPO4 0.2g，单独灭菌株的KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2 0.02g，Na2MoO4 0.002g，苹果酸5.0g，pH 7.0，FeCl30.01g，固体培养基加琼脂20.0g，半固体培养基加琼脂2.0g，121℃高压灭菌株15min。
将泓森槐样品的根、茎、叶分别用无菌株剪刀剪成3cm的小段，用无菌株水清洗表面灰尘，用70％酒精浸泡5min，用无菌株水清洗一遍，用0.1％升汞浸泡5min，表面消毒后，用无菌株水洗涤10次，每次10min，最后一次洗涤的无菌株水涂布在LB平板上，作为对照，确定是否消毒彻底。把消毒后的根两端各剪去1cm，分别接种于半固体DN培养基中，待长出菌株膜测定固氮酶活性后，用平板划线法与稀释涂平板法在DN培养基进行反复传代培养，直至菌株落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过石碳酸复红染色和显微镜镜检(油镜)，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。将纯化后的H41于15％的甘油中-20℃和-80℃保存。
2、固氮酶活测定
采用乙炔还原法对H41进行固氮酶活性的测定。将H41活化，用无菌株水制备成OD600＝1的菌株悬液，在8mL的试管中加入3mL DN半固体培养基，剩余空气体积5ml，用移液枪吸取10μL菌株悬液接种至试管中，无菌株水作为对照，用乳胶塞密封后放置于培养箱中37℃培养48h后，向试管内注射剩余空气体积1/100的100％乙炔气体(使最终浓度为1％)，继续培养24h后用无菌株注射器从试管内抽取0.5ml反应气体，用气相色谱仪测定是否产生乙烯从而检测H41的固氮能力，并按公式计算出相应菌株固氮酶的活性，测三次重复，取计算结果平均值。气相色谱仪的参数设置：检测器180℃，进样器120℃，柱箱温度80℃。计算固氮酶活性公式如下，单位nmol/(mL·h)C2H4：
EA＝(58.0×103×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t×V)
式中：Sb：乙炔峰面积；Te：实验条件下温度(K)；P：绝对大气压强(Pa)；t：培养时间(h)；V：容器体积(mL)；Se：乙烯峰面积；T：凯氏绝对温度(T＝273.13K)；Pe：实验条件下大气压强(Pa)。
试验结果表明，菌株H41的固氮酶活性较高，为310.3nmol/(mL·h)。
实施例2 GDMCC NO.62512菌株的生理生化特性及分类
1、形态特征
将H41制备成菌株悬液并稀释后涂布于LB培养基上，于28℃培养24h后观察菌株落和菌株体形态。
结果显示该菌株革兰氏染色呈阴性，在LB培养基上培养24h后，菌株落呈圆形，边缘整齐，半透明，生长到后期菌株落略显浅黄色；如附图1所示。
2、生理生化特征
参照细菌株鉴定手册对菌株H41的VP试验、MR试验、吲哚试验等生理生化特性进行测定，其结果显示该菌株硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验呈阳性，脲酶试验、吲哚试验、VP试验和MR试验呈阴性。
3、16S rDNA测序
采用细菌株基因组提取试剂盒提取菌株H41的基因组DNA，用细菌株通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA，经电泳检测后送公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。结果发现本发明的H41，与卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)模式菌株JM387相似性为99.4％。因此将本发明的H41应归属于卡萨克尼亚氏菌株(Kosakonia sacchari)。
实施例3 GDMCC NO.62512菌株的促生实验
挑选颗粒饱满的小麦种子，采用乙醇进行表面消毒，将消毒的小麦种子分为对照组和实验组，且对照组和实验组均设置6个样品；对照组中接1mL无菌株培养基，实验组中接H41(约108个/mL)1mL，相同条件下生长60天之后测定对照组和实验组中小麦的植物株高、干重和氮含量，测量结果显示：接种H41的实验组中小麦的长势明显好于未接种H41的对照组，接菌株植物株高、干重和氮含量分别比空白对照组提高了27％、36％和62％。
可以理解的，以上实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以对上述技术特点进行自由组合，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的等同变换与修饰，均应属于本发明权利要求的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种卡萨克尼亚氏菌株H41，其特征在于，卡萨克尼亚氏菌株H41于2022年06月02日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62512。
2.如权利要求1所述卡萨克尼亚氏菌株H41在提高植物根际土壤速效氮含量中的应用。
3.如权利要求1所述卡萨克尼亚氏菌株H41在制备促进植物生长的制剂中的应用。
4.一种促进植物生长的制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的卡萨克尼亚氏菌株H41。
5.根据权利要求4所述的一种促进植物生长的制剂，其特征在于，所述卡萨克尼亚氏菌株H41在制剂中的浓度为108～109个/ml。
6.一种提高植物根际土壤速效氮含量的制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的卡萨克尼亚氏菌株H41。
7.根据权利要求6所述的一种提高植物根际土壤速效氮含量的制剂，其特征在于，所述卡萨克尼亚氏菌株H41在制剂中的浓度为108～109个/ml。
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