CN107557324A

CN107557324A - 一株铜绿假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN107557324A
Application number: CN201711014867.2A
Authority: CN
Inventors: 李霜; 张玉珉; 王丹; 范艳秋
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: CN107557324B

Abstract

本发明涉及一株铜绿假单胞菌及其应用，所述菌株分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）YM4，保藏编号CCTCC NO：M 2017494。该菌株可利用亲水性碳源、疏水性碳源以及复合碳源等高产鼠李糖脂，鼠李糖脂对底物的转化率达65‑80%。YM4菌株的鼠李糖脂产物中，双鼠李糖脂和单鼠李糖脂是主要产物，两者共计占糖脂总量的80‑90%。针对该菌株的碳源代谢特征，开发出了适合工业化应用的不产泡种子培养基配方，可大幅降低种子罐的染菌概率。本发明菌株具有鼠李糖脂产量高、转化率高、双糖脂组分比例高等特征，具有显著的工业应用价值。

Description

一株铜绿假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种合成鼠李糖脂的铜绿假单胞菌株，由该菌产生的生物表面活性剂。

背景技术

鼠李糖脂是近年来研究极为广泛的生物表面活性剂，它不仅具有可与化学表面活性剂相媲美的增溶、乳化、润湿、发泡等性能，而且具有低毒、易于生物降解、对环境友好等的特点使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品，因而在石油开采、医药、食品、日化、环保等领域具有很大的应用潜力。微生物代谢积累的鼠李糖脂通常是由亲水基团鼠李糖与疏水基团中长链β-羟基脂肪酸构成的一系列化合物的混和体，包括单鼠李糖脂和双鼠李糖脂两种类型(Rha-Rha-C_m–C_n or Rha-C_m-C_n，m，n为8、10、12或14)。由于双鼠李糖脂中亲水基团的亲水性更强，导致具有更低的界面张力，在促进石油采收(EOR)和油田化学用品中更有优势[1]。因此，在关注鼠李糖脂的微生物发酵研究中，鼠李糖脂的组分构成也是重要的技术指标，对后续的开发应用具有显著的影响。生物表面活性剂具有良好的起泡效果，因此发酵过程中的搅拌和通气等措施会使得发酵液以泡沫形式溢出，不仅损失了培养基营养和菌体，还导致容易污染杂菌。尤其是在种子培养工艺中，种子培养过程中积累的鼠李糖脂导致大量的泡沫溢出，极易导致后续发酵染菌。目前，限制鼠李糖脂在工业上广泛应用的主要因素是其过高的生产成本以及复杂难控制的发酵工艺。因此，如何降低鼠李糖脂的生产成本成为目前研究的热点；为了降低其生产成本，很多研究通过菌株选育和发酵过程优化等手段来提高鼠李糖脂的产量。

发明内容

本发明目的在于提供一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一株铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)YM4，已于2017年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017494。

菌株的菌落形态特征：菌落呈淡褐色，边缘不规则，表面光滑不透明，湿润，易挑起。

菌体的形态特征：菌株是革兰氏阴性菌，短杆状，不形成芽孢。

菌株生理生化特征：好氧，生长温度25～45℃，最佳生长温度35～38℃，生长pH范围在4～9，最佳生长pH范围在6.5～7.5。

本发明的另一目的在于提供铜绿假单胞菌YM4在发酵生产鼠李糖脂中的应用。

本发明的技术方案，铜绿假单胞菌YM4发酵碳源为甘油、植物油脂或甘油和植物油脂的复合碳源。本发明的铜绿假单胞菌YM4可利用甘油、植物油脂以及两者混合物高产鼠李糖脂，转化率在65-80％；并且铜绿假单胞菌YM4以甘油为碳源时，双鼠李糖脂为主要产物，双糖脂与单糖脂的比例为9:1；以植物油脂为碳源时，单糖脂组分显著增加，双糖脂与单糖脂的比例仍可以达到2～3:1；利用甘油与植物油脂的混合碳源发酵时，双鼠李糖脂含量显著增加，双糖脂与单糖脂的比例可达3-4:1。

本发明的技术方案，所述植物油脂包括菜籽油、大豆油和棕榈油。

进一步的，本发明针对铜绿假单胞菌YM4开发了无泡种子培养基；本发明的菌株在种子培养阶段可利用木糖为碳源生长，种子生长阶段无泡沫溢出。

本发明提供了一种具体的无泡种子液培养基，其成分为：木糖20.0g/L、尿素4.0g/L、酵母粉3.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄ 4.0g/L、NaCl 1.0g/L；pH＝7，108℃灭菌20min。采用无泡种子培养基，在种子培养阶段可以减少泡沫溢出导致的染菌现象。

进一步的，发酵培养中以甘油为碳源，发酵培养基最优碳氮比为6～8；发酵培养以植物油脂为碳源，发酵培养基最优碳氮比为12～20；发酵培养以甘油和植物油脂的混合物为复合碳源，复合碳源添加比例为植物油脂：甘油＝10:1。

铜绿假单胞菌YM4产鼠李糖脂的摇瓶发酵条件为：初始pH＝7、接种量3％、温度37℃、转速200rpm、时间96h-120h、装液量50mL/250mL。

本发明菌株具有底物种类丰富、鼠李糖脂产量高、转化率高以及双糖脂组分占比高等有利于工业应用的特点；并且该菌株因具有利用木糖做碳源生长而不产生表面活性剂的特征，开发出适用于工业应用的种子培养工艺，大幅降低染菌概率。

附图说明

图1是ARTP诱变铜绿假单胞菌致死率曲线。

图2是利用活性炭固定化发酵产鼠李糖脂工艺。

图3是利用不同油脂碳源发酵产鼠李糖脂。

图4是不同种子培养基用于发酵产鼠李糖脂。

图5a是鼠李糖脂标准品液相色谱图。

图5b是鼠李糖脂标准品Rha-Rha-C10-C10成分质谱图；m/z＝649.3800。

图5c是鼠李糖脂标准品Rha-C10-C10成分质谱图；m/z＝503.3216。

本发明所述的生物材料，其分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)YM4，已于2017年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为：CCTCCNO：M 2017494，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

本实施例说明本发明菌株铜绿假单胞菌YM4的获取方法。

从胜利油田周边土壤中获取该菌原始菌株接入LB液体培养基中，37℃，200rpm培养12h得种子液。在超净工作台中用移液枪取种子液100μL于1号900μL无菌水的无菌试管中，充分震荡，使菌液均匀分散，即为10^-1的样品稀释液；再取10^-1的样品稀释液100μL于2号900μL无菌水的无菌试管中，以此类推，依次标记10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8。分别取10^-7和10^-8稀释度稀释液200μL使用无菌涂布棒均匀涂布平板上，平放静置10min，后倒置于37℃恒温培养箱培养18-24h，获得单菌落。用大连宝生物工程有限公司生产的DNA快速提取试剂盒提取菌株的总DNA，采用大肠杆菌通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

对菌株16S rDNA序列进行PCR扩增，将纯化后的DNA片段送大连宝生物工程有限公司测序得到菌株的序列，将整个序列提交到NCBI数据库GenBank进行Blast比对发现：原始菌株与Pseudomonas aeruginosa菌株的最高同源性100％，鉴定该菌株为铜绿假单胞菌。

将原始菌株通过ARTP育种机诱变育种，该育种机的诱变条件气体流速为10L/min，照射距离2mm，载气为氦气，样品量20μL，OD₆₀₀＝1，处理时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，将不同诱变时间的载片置于1mL无菌生理盐水中，充分震荡后将菌悬液做7个10倍梯度稀释，分别取200μL涂布于LB固体培养基中培养24h后进行活菌计数，并绘制致死率曲线，确定最佳诱变时间为120s，如图1所示。在上述诱变条件下直接诱变120s后在上述操作方式下稀释到10^-6涂布于无菌脱纤维绵羊血平板中进行初筛，培养24h后根据光圈大小挑选菌株；将菌株进行摇瓶发酵复筛，温度37℃、转速200rpm、装液量50mL/250mL条件下发酵72h测鼠李糖脂的产量以确定最佳菌株，即铜绿假单胞菌YM4，诱变菌株产鼠李糖脂的产量同比原始菌株提高了近80％。

实施例2

本实施例说明本发明提供的铜绿假单胞菌YM4利用甘油为碳源高产生物表面活性剂鼠李糖脂的方法。

种子培养基(LB培养基)：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L。

初始发酵培养基：甘油40.0g/L、NaNO₃ 2.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、pH 6.5。

优化发酵培养基：甘油30.0～60.0g/L、NaNO₃ 2.0～12.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄ 4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、微量元素2mL(FeCl₃ 0.16g/L、CuSO₄ 0.15g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.5g/L、MnSO₄·H₂O1.5g/L)、pH 7。

将本发明提供的铜绿假单胞菌YM4首先于37℃平板活化菌种，20h后接一环生长良好的菌体入50mL LB培养基，37℃，200rpm培养24h，然后按照3％(v/v)接种量转接入装液量为50mL发酵液/250mL三角瓶，37℃培养，转速为200rpm，发酵96h后，取发酵液1mL于离心机中12000r/min离心5min后，取上清液用超纯水稀释20倍，震荡混匀，用硫酸-蒽酮法测发酵液中鼠李糖脂的产量，离心获取的菌体经洗涤一次，重悬后测菌体量的OD₆₀₀。最佳发酵培养基获取方法：首先通过正交实验获取较优合成RLs的培养基，然后利用可视化优化确定最佳发酵培养基。结果如表1所示。对比初始发酵培养基合成鼠李糖脂的产量，本发明菌株利用优化后的发酵培养基合成鼠李糖脂的产量可达30g/L，产量提高了近3倍，产物鼠李糖脂对底物的转化率达65％以上。

表1 YM4菌株利用甘油发酵产鼠李糖脂

实施例3

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4利用粗甘油为碳源高产鼠李糖脂的方法。

发酵培养基：甘油30.0g/L、NaNO₃ 12.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄ 4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、微量元素2mL(FeCl₃ 0.16g/L、CuSO₄ 0.15g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.5g/L、MnSO₄·H₂O 1.5g/L)、pH 7。

粗甘油含量为80％(w/w)，每升发酵液使用粗甘油37.5g。

本发明提供的铜绿假单胞菌YM4首先于37℃平板活化菌种，20h后接一环生长良好的菌体入50mL LB培养基，37℃，200rpm培养24h，然后按照3％(v/v)接种量转接入装液量为50mL发酵液/250mL三角瓶，37℃培养，转速为200rpm，发酵96h后，取发酵液1mL于离心机中12000r/min离心5min后，取上清液用超纯水稀释20倍，震荡混匀，用硫酸-蒽酮法测发酵液中鼠李糖脂的产量，离心获取的菌体经洗涤一次，重悬后测菌体量的OD₆₀₀，结果如表2所示。对比精甘油(AR级)培养基合成鼠李糖脂的产量，本发明菌株利用廉价粗甘油(80％，w/w)产鼠李糖脂可达19.78g/L，产物鼠李糖脂对底物的转化率达60％以上。

表2 YM4菌株利用粗甘油(80％，w/w)发酵96h产鼠李糖脂

实施例4

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4利用活性炭固定化培养高产鼠李糖脂的方法。

发酵培养基：甘油30.0g/L、NaNO₃ 12.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄ 4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、微量元素2mL(FeCl₃ 0.16g/L、CuSO₄ 0.15g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.5g/L、MnSO₄·H₂O 1.5g/L)、pH7、接种量3％(v/v)；摇瓶装液量50mL培养基/250mL培养瓶。

固定化发酵方式：分别加入0.5g/L、1g/L、2g/L的活性炭(粒径1.5mm)于发酵培养基中，初次培养96h后取出培养瓶中全部发酵液后，留下活性炭颗粒，重新加入新鲜的无菌培养基培养72h，依次循环3～4次，分别测定不同批次发酵液中鼠李糖脂的产量，结果如图2所示，添加粒径1.5mm的活性炭0.5g/L，可达到较好的固定化作用。

实施例5

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4利用油脂为碳源产鼠李糖脂的方法。

发酵培养基：分别以30.0g/L菜籽油、大豆油、棕榈油为碳源，硝酸钠2.0-12.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄ 4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、微量元素2mL(FeCl₃ 0.16g/L、CuSO₄ 0.15g/L、ZnSO₄·7H₂O1.5g/L、MnSO₄·H₂O 1.5g/L)、pH7、接种量3％(v/v)。

将本发明提供的铜绿假单胞菌YM4首先于37℃平板活化菌种，20h后接一环生长良好的菌体入50mL LB培养基中，37℃，200rpm培养24h，然后按照3％(v/v)接种量转接入装液量为50mL发酵液/250mL三角瓶，37℃培养，转速为200rpm，发酵96h后，取发酵液1mL于离心机中12000r/min离心5min后，取上清液用超纯水稀释20倍，震荡混匀用硫酸-蒽酮法测发酵液中鼠李糖脂的产量，结果如图3所示。本发明菌株的最适油脂碳源为大豆油，利用大豆油发酵合成鼠李糖脂的产量在25g/L左右，底物转化率最高可达到80％以上。本发明菌株铜绿假单胞菌YM4利用油脂做碳源发酵产鼠李糖脂时，最适C/N比在12～20；利用甘油做碳源发酵产鼠李糖脂时最佳C/N比在6～8。

实施例6

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4利用油脂碳源及定时流加工艺高产鼠李糖脂的方法。

以大豆油为碳源，添加量为60.0g/L，硝酸钠10.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、微量元素2mL(FeCl₃ 0.16g/L、CuSO₄ 0.15g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.5g/L、MnSO₄·H₂O 1.5g/L)、pH7、接种量6％(v/v)。

将本发明提供的铜绿假单胞菌YM4首先于37℃平板活化菌种，24h后接一环生长良好的菌体入50mL LB种子培养基，37℃，200rpm培养24h，然后按照6％(v/v)接种量转接入装液量为3L发酵液/5L发酵罐，发酵条件为温度37℃、转速300rpm、通气量1.2vvm，发酵4d后，开始每48h流加油脂60mL，连续发酵10d，发酵结束后取一定量的发酵液于离心机中12000r/min离心10min后，取上清液用超纯水稀释100倍，震荡混匀用硫酸-蒽酮法测发酵液中鼠李糖脂的产量，本发明菌株利用流加的油脂碳源发酵合成鼠李糖脂的产量在100-110g/L左右。

实施例7

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4利用复合碳源为碳源高产鼠李糖脂的方法。

分别以菜籽油、大豆油、棕榈油为疏水性碳源，甘油为亲水性碳源，总碳源添加量为30.0g/L，添加比例为油脂：甘油＝10:1，硝酸钠6.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄4.0g/L、NaCl 1.0g/L、KCl 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、无水CaCl₂ 0.1g/L、酵母粉1.0g/L、微量元素2mL(FeCl₃ 0.16g/L、CuSO₄ 0.15g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.5g/L、MnSO₄·H₂O 1.5g/L)、pH7、接种量3％(v/v)。

将本发明提供的铜绿假单胞菌YM4首先于37℃平板活化菌种，20h后接一环生长良好的菌体入50mL种子培养基中，37℃，200rpm培养24h，然后按照3％(v/v)接种量转接入装液量为50mL发酵液/250mL三角瓶，37℃培养，转速为200rpm，发酵96h后，取发酵液1mL于离心机中12000r/min离心5min后，取上清液用超纯水稀释20倍，震荡混匀用硫酸-蒽酮法测发酵液中鼠李糖脂的产量。结果如表3所示，混合碳源也是该菌株的优良底物，鼠李糖脂转化率为85％。HPLC-ELSD分析检测，对以油脂为发酵底物时，通过添加一定比例的甘油，可提高双糖脂(Rha-Rha-C10-C10)占比，而双糖脂比单糖脂(Rha-C10-C10)具有更高的表面活性价值。

表3 利用混合碳源发酵产鼠李糖脂

实施例8

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4的无泡种子培养工艺。

常规种子培养基(LB培养基)：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L。

无泡种子培养基：木糖20.0g/L、尿素4.0g/L、酵母粉3.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄ 4.0g/L、NaCl 1.0g/L、pH＝7，灭菌条件：108℃灭菌20min。

用接种环挑一环铜绿假单胞菌YM4的单菌落于种子液培养基中，在温度37℃、转速200rpm的条件下培养24h后，通过测定分光光度计600nm处的吸光值，与LB种子液作对照，发现以木糖为碳源的种子液OD₆₀₀与LB培养基种子液中OD₆₀₀分别为2.1和3.2，取种子液8mL在台式离心机中8000r/min离心5min后取上清液在自动表/界面张力仪下测定表面张力，数据显示，以木糖为碳源的种子液的表面张力为44.3mN/m，稀释10倍后，表面张力为67.8mN/m；而对照组LB培养基种子液的表面张力在27.9mN/m，稀释10倍后，表面张力为45.2mN/m。

5L搅拌式反应器培养YM4菌株的种子液：将铜绿假单胞菌YM4接种到无泡种子液培养基培养24h后，以6％接种量接种到5L搅拌式发酵罐中培养24h，发酵罐装液量3L、转速300rpm、温度37℃、通气量1.2vvm。培养结果如表4所示。以木糖为碳源的无泡种子培养工艺在整个培养过程中没有泡沫排出；而在相同发酵罐条件下，LB种子罐排出了230mL发酵液。将培养24h的种子液按3％接种量接种到发酵培养基中，发酵结果如图4所示。木糖为碳源的无泡种子液，与常规LB种子液相比，在发酵进程及发酵终点的鼠李糖脂产量上无差异，表明无泡种子培养基配方适用于鼠李糖脂发酵。

表4 不同种子培养基在5L搅拌式发酵罐上的性状

实施例9

本实施例说明铜绿假单胞菌YM4具有高产双鼠李糖脂的特征以及利用不同碳源发酵所产鼠李糖脂的结构组分变化。

鼠李糖脂标准品(90％纯度，AGAE Technologies公司提供)采用HPLC-MS分析不同出峰物质的分子量及其分子构型，结果如图5所示。

HPLC-MS为二维液相色谱/四级杆-飞行时间质谱。

色谱条件:C18色谱柱；标品浓度为1g/L；检测器：ELSD；流动相：A：0.05％甲酸-水，B：乙腈；洗脱梯度:0～5min，30％～70％B；6～30min，70％～90％B；31～40min，100％B。

质谱条件：雾化气和干燥气为N₂，HPLC/Q-TOF-MS系统使用ESI离子源，离子源温度为350℃，离子源气流速为10l/min，喷雾电压45P，质谱扫描质量数范围:200～1000m/Z。

将实施例2、实施例3、实施例4中不同碳源的发酵产物，取发酵液1mL于离心机中12000r/min离心5min后，取上清液用超纯水稀释20倍，震荡混匀用HPLC-ELSD测发酵液中鼠李糖脂的组分。分析方法同上，结果如表5所示。YM4菌株的鼠李糖脂组分中，双鼠李糖脂和单鼠李糖脂为主要产物，两者合计占总糖脂的90％左右。利用甘油为碳源时，双鼠李糖脂(Rha-Rha-C10-C10)为主要产物，双鼠李糖脂与单鼠李糖脂(Rha-C10-C10)的比例为9:1；而利用油脂碳源时，单鼠李糖脂组分显著增加，双鼠李糖脂与单鼠李糖脂(Rha-C10-C10)的比例为2～3:1；复合碳源发酵时，双糖脂组分占比增加，双糖脂：单糖脂为3～4:1。

表5 利用不同碳源合成鼠李糖脂的组分分析

Claims

1.一株铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)YM4，保藏编号CCTCC NO：M 2017494。

2.权利要求1所述铜绿假单胞菌在发酵生产鼠李糖脂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵碳源为甘油、植物油脂或甘油和植物油脂的复合碳源；所述植物油脂选自菜籽油、大豆油和棕榈油中的一种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，种子培养基的碳源选用木糖。

5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，种子培养基成分为：木糖20.0g/L、尿素4.0g/L、酵母粉3.0g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.0g/L、KH₂PO₄4.0g/L、NaCl 1.0g/L，pH＝7，108℃灭菌20min。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养以甘油为碳源，发酵培养基碳氮比为6～8。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养以植物油脂为碳源，发酵培养基碳氮比为12～20；所述植物油脂选自菜籽油、大豆油和棕榈油中的一种。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养以甘油和植物油脂的混合物为复合碳源，复合碳源添加比例为植物油脂：甘油＝10:1；所述植物油脂选自菜籽油、大豆油和棕榈油中的一种。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用活性炭固定化培养产鼠李糖脂，固定化发酵培养方式如下：

向发酵培养基加入活性炭，初次培养96h后取出培养瓶中全部发酵液，留下活性炭颗粒，重新加入新鲜的无菌培养基培养72h，依次循环3～4次；

其中，活性炭粒径1.5mm，加入量0.5～2g/L；优选加入0.5g/L。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，碳源为植物油脂时，采用定时流加工艺产鼠李糖脂，包括如下步骤：

(1)将铜绿假单胞菌YM4于平板活化菌种，后接一环生长良好的菌体入LB种子培养基培养；

(2)将种子液按6％v/v接种量转接入发酵罐发酵，发酵条件为温度37℃、转速300rpm、通气量1.2vvm，发酵4d后，开始每48h流加油脂20mL，连续发酵10d；

(3)发酵结束后，将发酵液离心取上清，提取鼠李糖脂。