CN101265488A - 一种鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺。本发明提供培养基中的碳氮源的种类和比例，豆油2－4g，蛋白胨2－4g、碳酸钙1－3g、磷酸氢二钠1－3g、磷酸二氢钾1－2g，水1L，在发酵中采用了主从双发酵罐联合发酵，主发酵罐通过连接从发酵罐，使溢出的发酵液收集于从发酵罐，在从发酵罐中进行加压停留法消泡，使用蠕动泵持续将重新液化的发酵液回注到主发酵罐，保持发酵过程持续进行，本发明在不影响发酵产量的前提下，降低培养基的复杂性和成本，提高产物转化率，有力的促进了鼠李糖脂的产业化进程。

Description

一种鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺

技术领域

本发明涉及生物表面活性剂领域。具体的说，本发明涉及一种生物表面活性剂分子中疏水基鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺。

背景技术

生物表面活性剂是由微生物或动植物产生的具有亲水、亲油特性，趋向于界面分配，表现出高的表面活性和乳化性能的生物大分子。其分子包括疏水基和亲水基，疏水基通常为脂肪酰基链，按照其亲水基的化学结构划分为：糖脂、含氨基酸类脂、磷脂、脂肪酸中性脂、结合多糖和蛋白质的高分子生物表面活性剂等。当前研究和应用最广泛的是以铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂为主。

中国海洋大学梁生康等通过药瓶培养试验研究了铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂生物表面活性剂的适宜条件，最高产量达到2.14g/L。南京理工大学沈薇等对铜绿假单胞菌的野生型菌株进行诱变，并对其摇瓶发酵工艺进行研究，在以植物油和尿素为主的培养基上，2d发酵鼠李糖脂产量最高达到8.93g/L。北京大学郝瑞霞等研究假单胞菌代谢产生糖脂和脂肽生物表面活性物质，其临界胶束浓度为236mg/L，将水的表面张力由72mN/m降到29.7mN/m，油水界面张力由30mN/m降到1.3mN/m。发酵液可以乳化原油，使原油的粘度降低86.95％。

综合已经发表的专利和文献，可以看出鼠李糖脂的产业化的重点在于提高发酵产量和降低生产成本。

发明内容

针对国内外目前鼠李糖脂的产业化的重点在于降低培养基的复杂性和成本，提高产物转化率，从而提高发酵产量、效率和降低生产成本。本发明对此提供了一种提高鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵产量的生产方法。

本发明利用已公开报道的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，具有利用植物油产生鼠李糖脂和脂肽类生物表面活性剂的能力。该菌株具有利用植物油产生鼠李糖脂和脂肽类生物表面活性剂的能力，其生长温度范围25-40℃，最适生长温度35℃。

本发明具体提供了一种提高鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵产量的生产方法，该方法包括菌种培养、发酵生产工艺：

1、菌种培养：以上述铜绿假单胞菌为生产菌种，使用适宜的培养基和培养条件，通过斜面菌种培养和摇瓶培养取得发酵菌种。培养基成分：豆油2-4g，蛋白胨2-4g、碳酸钙1-3g、磷酸氢二钠1-3g、磷酸二氢钾1-2g，水1。

本发明通过正交试验分析最适合的培养基，按重量百分比计，各成分的含量为，豆油含量取4％，蛋白胨含量取0.4％，磷酸氢二钠含量取0.3％，磷酸二氢钾含量取0.2％，碳酸钙含量取0.3％。

培养条件：温度30-37℃，摇床转速100-250转/min，8-20h。

2、发酵生产工艺：将步骤1取得的发酵菌种，采用主从双发酵罐联合发酵，主发酵罐发酵温度35℃，搅拌速度300转/分，通气量0.5v/v/m，按体积百分比接种量5％，主发酵罐为25L或其倍数的发酵罐；从发酵罐发酵温度35℃，无搅拌，罐顶部进气加压消泡，从发酵罐为7L或其倍数的发酵罐。在PH5.5-7.5，通风搅拌条件下发酵65-90h，得到鼠李糖脂发酵液。在主发酵罐中进行通风和搅拌，主发酵罐通过连接从发酵罐，使溢出的发酵液收集于从发酵罐，在从发酵罐中进行加压停留法消泡，同时使用蠕动泵持续将重新液化的发酵液回注到主发酵罐，使发酵过程持续进行。

本发明同时提供一种能够长期有效保存鼠李糖脂发酵液表面活性的储藏方法，通过在发酵液中添加了按重量百分比计0.2-1％的氯化钙，在60-90℃加热20-60min。能够使发酵液在30℃下储藏120d，其表面活性无明显下降。

通过实施本发明具体的技术方案，实现本发明内容，并可以达到以下有益效果。

1、高产发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的问题之一在于调整培养基中的碳氮源的种类和比例，在不影响发酵产量的前提下，降低培养基的复杂性和成本，提高产物转化率。培养基成分：豆油2-4g，蛋白胨2-4g、碳酸钙1-3g、磷酸氢二钠1-3g、磷酸二氢钾1-2g，水1L。

2、本发明的一个重要组成部分是采用了主从双发酵罐联合发酵，主发酵罐通过连接从发酵罐，使溢出的发酵液收集于从发酵罐，在从发酵罐中进行加压停留法消泡，同时使用蠕动泵持续将重新液化的发酵液回注到主发酵罐，从而使发酵过程持续进行，并且提高了最终的发酵产量。

3、本发明提供了一种延长鼠李糖脂发酵液的储藏时间的方法，确定在发酵液中添加氯化钙0.5％，在80℃加热处理40min，能够使发酵液在30℃下恒温储藏120d，其表面活性无明显下降。本发明通过比较处理前后发酵液中水溶性鼠李糖脂的含量可发现，直接离心发酵液获得清液，清液中含有的鼠李糖脂含量仅为11g/L，处理后清液含有鼠李糖脂24g/L。

附图说明：

(无)

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量写。

具体实施方式

实施例一：高产发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂中选用铜绿假单孢菌培养基和培养条件的优化

选用菌株为铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)已公开报道，从新疆克拉玛依采油区油藏原油中分离得到，生长温度范围25-40℃，最适生长温度35℃，具有利用植物油生产鼠李糖脂和脂肽类生物表面活性剂的能力。

高产发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂的问题之一在于调整培养基中的碳氮源的种类和比例，在不影响发酵产量的前提下，降低培养基的复杂性和成本，提高产物转化率。通过正交试验分析最适合的培养基各成分的含量，对培养基中所用的碳氮源，即豆油、蛋白胨和碳酸钙的含量以及培养时间做正交分析试验，试验方法和结果分析如下：因素为，碳酸钙A  豆油B  蛋白胨C  磷酸氢二钠D  磷酸二氢钾E  发酵时间F

水平因子分析表：

方差分析表：

	A％	B％	C％	D％	E％	-	F(h)	-
									∑K1	93.8	137	100.1	91.9	92.9	90.7	80.9	98.9
∑K2	191.9	76.2	96.4	98	101	92	104.2	96.8
									∑K3	\	72.5	89.2	95.8	91.8	103	100.6	90

(∑K1)2	8798.44	18769	10020.01	8445.61	8630.41	8226.49	6544.81	9781.21
									(∑K2)2	36825.61	5806.44	9292.96	9604	10201	8464	10857.64	9370.24
(∑K3)2	\	5256.25	7956.64	9177.64	8427.24	10609	10120.36	8100
									∑(∑Kj)2/n	5069.3	4971.9	4544.9	4537.9	4543.1	4549.9	4587.1	4541.9
SJ	534.6	437.3	10.2	3.2	8.4	15.2	52.4	7.2
									fJ	1.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
SJ/fJ	534.6	218.6	5.1	1.6	4.2	7.6	26.2	3.6
									F检验	120.8	49.4	1.2	0.4	1.0	1.7	5.9	0.8
显著性	**	**					*

结论：

根据直观分析和方差分析，各因子的总计数或平均数可看出发酵时间S_J/f_J值明显大于F检验值，差异显著；同时碳酸钙和豆油S_J/f_J值明显大于F检验值，差异非常显著。各成分配比：豆油含量取4％，蛋白胨含量取0.4％，磷酸氢二钠含量取0.3％，磷酸二氢钾含量取0.2％，碳酸钙含量取0.3％，发酵时间取72h。

实施例二：鼠李糖脂生物表面活性剂发酵工艺

铜绿假单孢菌菌种从分离培养基所制斜面接种于种子摇瓶培养基，其培养基成分及含量为豆油40g，蛋白胨4g、碳酸钙3g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾2g，水1L。摇瓶培养工艺：35℃，摇床转速200转/分，培养时间8h。发酵培养基成分及含量：豆油40g，蛋白胨4g、碳酸钙3g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾2g，水1L。主从双发酵罐：主发酵罐为25L发酵罐，从发酵罐为7L发酵罐。二者以蠕动泵连接。主发酵罐发酵参数：发酵温度35℃，搅拌速度300转/分，通气量0.5v/v/m，按体积百分比接种量5％。从发酵罐发酵参数：发酵温度35℃，无搅拌，罐顶部进气加压消泡。使用蒽酮法检测发酵液中鼠李糖脂的含量。发酵过程中检测铜绿假单孢菌菌量的变化，发酵时间72h。

铜绿假单孢菌发酵产生的鼠李糖脂生物表面活性剂具有对细胞膜的穿透溶融特性，因此发酵过程容易受到发酵产物鼠李糖脂的阻遏，采用通常的单一发酵设备，其发酵产量达到一定程度后，发酵液内的菌量将会由于生物表面活性剂对细胞膜的穿透溶融而大量下降，随之而来的是鼠李糖脂的产量不能进一步提高，造成发酵效率低下。

此外，生物表面活性剂的发泡特性与生产菌株铜绿假单胞菌的好氧发酵过程相结合，导致发酵过程的后期产生很大的泡沫，造成发酵液的溢出，从而使发酵底物的转化效率降低。通常的单一发酵设备的机械法消除泡沫和添加消泡剂的方法对此很难产生效果。

本发明采用了主从双发酵罐联合发酵，主发酵罐通过连接从发酵罐，使溢出的发酵液收集于从发酵罐，在从发酵罐中进行加压停留法消泡，同时使用蠕动泵持续将重新液化的发酵液回注到主发酵罐，从而使发酵过程持续进行，并且提高了最终的发酵产量。

同时进行了通常的单一发酵罐发酵，与主从双发酵罐联合发酵的结果作出对比，下表为使用通常的单一发酵设备和采用主从双发酵罐联合发酵时发酵过程的菌量和产量随发酵时间变化的检测结果，可以看出主从双发酵罐联合发酵的效果。

通过连续三批次发酵结果的统计，检验了发酵结果的稳定性。结果如下表：

批次	鼠李糖脂含量(g/L)	发酵高峰时间(h)
			1	28.5	70
2	31	72
			3	30.5	73
平均	30	72

实施例三：鼠李糖脂发酵液后处理和延长储藏时间的试验

目前确认有效的鼠李糖脂提取工艺一般都要使用有机溶剂萃取和层析的方式，由于其工艺的复杂性和提取设备的难以规模化造成鼠李糖脂的产品提取的成本大大高于发酵生产的成本。在试验中发现，未经有效处理的发酵液在储藏30d后，其表面活性降低了50％，本发明提供了一种延长鼠李糖脂发酵液的储藏时间的方法，能够使发酵液在30℃下恒温储藏120d，其表面活性无明显下降。

鼠李糖脂作为一种离子型表面活性剂，在发酵过程中大部分鼠李糖脂结合于细胞壁，如果不经过处理就不能充分释放到发酵液中，易于被胞内脂酶降解。经检测，发酵液中鼠李糖脂生物表面活性剂的临界胶束浓度(CMC值)为50mg/L，可将水的表面张力值降低至35mN/m。对温度和常见盐类对发酵液表面活性的影响做了如下检测：

温度对鼠李糖脂溶液表面活性的影响

Na+、Ca2+浓度对鼠李糖脂发酵液表面活性的影响

发酵液在温度低于0℃和高于80℃时，其中的鼠李糖脂易失去部分表面活性；若在发酵液中添加Ca²⁺离子，则对其有保护作用。例如在添加1％CaCl₂后，100℃处理发酵液，其表面活性没有损失。

该表面活性剂对Na⁺、Ca²⁺浓度的耐受性均较高，表面活性剂溶液中的Ca²⁺在1、2、5％的浓度下，表面张力依次降低，说明溶液中适量的Ca²⁺对其表面活性还有有益作用。

因此确定在发酵液中添加氯化钙0.5％，在80℃加热处理40min，通过比较处理前后发酵液中水溶性鼠李糖脂的含量可发现，如不经上述处理，直接离心发酵液获得清液，清液中含有的鼠李糖脂含量仅为11g/L，处理后清液含有鼠李糖脂24g/L。

发酵液表面活性的检测方法：以去离子水稀释发酵液，经过检测水溶液的表面张力降低值，测定临界胶束浓度，临界胶束浓度越高，表面活性就越差。以初始发酵液的表面活性为100％，在发酵液的储藏期内持续检测相对表面活性，结果如下表：

可见该延长鼠李糖脂发酵液储藏期的处理方法简单易行，并对生产应用具有重要的意义。

Claims (7)

1.一种鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，选用菌种铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)从分离培养基、种子摇瓶培养基培养后，经发酵培养基发酵后，使用蒽酮法检测发酵液中鼠李糖脂的含量，其特征在于，

(1)其培养基成分与含量为：豆油2-4g，蛋白胨2-4g、碳酸钙1-3g、磷酸氢二钠1-3g、磷酸二氢钾1-2g，水1L；

(2)采用主从双发酵罐联合发酵生产鼠李糖脂；

(3)发酵结束后的发酵液进行添加无机盐的热处理。

2.如权利要求1所述的鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，其特征在于，按重量百分比计，培养基成分与含量优选豆油含量取4％，蛋白胨含量取0.4％，磷酸氢二钠含量取0.3％，磷酸二氢钾含量取0.2％，碳酸钙含量取0.3％。

3.如权利要求1所述的鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，其特征在于，采用主从双发酵罐联合发酵生产鼠李糖脂中，主发酵罐中进行通气和搅拌操作，从发酵罐对主发酵罐溢出的发酵液进行收集，加压消泡，使发酵液泡沫重新液化。

4.如权利要求1所述的鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，其特征在于，对结束发酵后的发酵液进行添加无机盐的热处理中，按重量百分比计，选用含量0.2-1％氯化钙的无机盐，热处理的温度为60-90℃，时间为20-60min。

5.如权利要求3所述的鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，其特征在于，从发酵罐中进行加压同时使用蠕动泵持续将重新液化的发酵液回注到主发酵罐，保持发酵过程连续进行。

6.如权利要求3所述的鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，其特征在于，主发酵罐发酵温度35℃，搅拌速度300转/分，通气量0.5v/v/m，按体积百分比接种量5％，主发酵罐为25L或其倍数的发酵罐。

7.如权利要求3所述的鼠李糖脂生物表面活性剂的发酵生产工艺，其特征在于，从发酵罐发酵温度35℃，无搅拌，罐顶部进气加压消泡，从发酵罐为7L或其倍数的发酵罐。