CN102796781A - 用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：一）采用斜面接种法将铜绿假单胞杆菌菌种移入摇瓶进行扩大培养，获得铜绿假单胞杆菌种子液；二）先将发酵培养基加入发酵罐灭菌，然后按照8%～12%的接种量将铜绿假单胞杆菌种子液接入发酵罐内发酵，在接种种子液前，在培养基中加入1-5‰的泡敌；铜绿假单胞杆菌种子液发酵至120小时，获得糊状发酵液；三）使用分离设备对糊状发酵液进行两次萃取蒸馏，获得纯度为80%~90%的膏状鼠李糖脂。本发明能够满足纯度为80%以上的鼠李糖脂低成本大规模工业化生产的需要。

Description

用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法

技术领域

本发明涉及一种生产鼠李糖脂的方法，  特别涉及一种用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法。

背景技术

在石油勘探、开发、炼制及运储过程中，由于意外事故或操作失误，造成原油或油品从作业现场或储器里外泄，溢油流向地面、水面、海滩或海面，同时由于油质成分的不同，形成薄厚不等的一片油膜，这一现象称为溢油。随着全球经济一体化进程的加快，海上石油运输和海上石油开采量迅速增加，海上溢油事故也不断增多，严重威胁着海洋及沿海陆域的生态环境。据保守估计，每年有320万吨原油因泄漏等原因进入到海洋中。

溢油分散剂俗称“消油剂”。它是用来减少溢油与水之间的界面张力，从而使油迅速乳化分散在水中的化学药剂。在许多不能采用机械回收或有火灾危险的紧急情况下，及时地喷洒溢油分散剂，是消除水面石油污染和防止火灾的主要措施。消油剂可分为化学消油剂和生物消油剂。由于生物消油剂的主要成分生物表面活性剂的生产成本居高不下，阻碍了生物消油剂的大规模应用，目前在应对海上溢油事故时使用的主要是化学消油剂。但化学消油剂本身具有一定的毒性，因此世界各国政府对化学消油剂的应用，都采取慎重的态度。生物消油剂逐步取代化学消油剂是必然的趋势。

鼠李糖脂为一种阴离子表面活性剂，它们不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在碱性水溶液中也表现出良好的溶解特性。然而鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，如能显著降低水的表面张力，改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。鼠李糖脂对微生物、动物和人类均不会构成危害，但可以降解类似墨西哥湾漏油事故中释放出来的多环芳香族碳氢化合物（PAHs），该种化合物是芳香族碳氢化合物中的一种特例，它可以致癌或诱发基因突变。鼠李糖脂在不同的温度、酸碱度以及盐度的环境中相对稳定，可以有效降解原油中至少5种多环芳香族碳氢化合物。对清除环境污染物质安全和有效方法的研究，对发现这种生物表面活性剂和PAHs降解微生物起到了重要的促进作用。以其为主要成分的生物消油剂是化学消油剂的良好替代品。国际上对鼠李糖脂理论研究及应用开发已开展多年，但我国目前在该领域还处于起步阶段。

鼠李糖脂的应用范围非常广阔，但是其生产成本居高不下，限制着鼠李糖脂大规模的商业化生产进程，现在国际、国内范围内都没有纯品鼠李糖脂糖脂的公开销售。制约鼠李糖脂工业化生产的因素主要包括菌种的生产能力、培养条件、生产方式以及分离提取方式等，其中菌种诱变工作和培养条件优化研究已经非常普遍，也发现了较为优良的菌种，在适宜的培养条件下可达到较高且稳定的产量，但总体来看，现有的工艺与实现工业化生产所要求的低成本还有很大的差距。

发明内容

本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，该方法能够实现鼠李糖脂的低成本工业化生产。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：  一种用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：

一）采用斜面接种法将铜绿假单胞杆菌菌种移入摇瓶进行扩大培养，获得铜绿假单胞杆菌种子液；

二）先将发酵培养基加入发酵罐灭菌，然后按照8%～12%的接种量将铜绿假单胞杆菌种子液接入发酵罐，在接种种子液前，在培养基中加入1-5‰的泡敌；

所述发酵培养基中各组分的浓度为（g/L）：大豆油40~120；KH2PO4 3~7；K2HPO46~10；NaNO3 2~4；NaCl 0.5~2；KCl 0.5~2；MgSO4·7H2O 0.1~1；无水CaCl2 0.01~0.5；微量元素溶液2~10mL/L；微量元素溶液的pH：7.0~8.5，所述微量元素溶液中各溶质的浓度为（g/L）：FeSO4·7H2O 12；ZnSO4·7H2O 3.0；CoSO4·7H2O 1.0；MnSO4·2H2O3.0；

铜绿假单胞杆菌种子液在发酵罐内发酵至120小时，获得糊状发酵液；

三）使用分离设备对糊状发酵液进行两次萃取蒸馏：

1）先将糊状发酵液的pH调节至1~3，然后静置，待自然沉降后，加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层萃取液；

2）蒸馏步骤1）中获得的上层萃取液，将其中的乙酸乙酯蒸馏去除，获得膏状鼠李糖脂混合物；

3）将步骤2）中获得的膏状鼠李糖脂混合物重溶在乙酸乙酯内，对其进行二次萃取，收集位于上层的二次萃取液；

4）蒸馏步骤3）中获得的二次萃取液，将其中的乙酸乙酯蒸馏去除，获得纯度为80%~90%的膏状鼠李糖脂。

还包括步骤四），将纯度为80%~90%的膏状鼠李糖脂烘干，获得纯度95%以上的鼠李糖脂。

所述发酵罐为消泡式发酵罐，所述消泡式发酵罐包括罐体和由电机驱动的搅拌轴，在所述搅拌轴的上部从上至下依次装有长臂消泡浆和短臂消泡浆，在所述长臂消泡浆和所述短臂消泡浆之间设有外圆周面与所述罐体固接的环形贴壁挡板。

所述分离设备包括储藏罐、粗馏罐、重溶罐、蒸馏罐和回收罐；

所述储藏罐上设有加料口、出料阀和排料阀，所述加料口设置在储藏罐的上部，所述出料阀设置在储藏罐的侧部，所述排料阀设置在储藏罐的底部；

所述粗馏罐设有顶部出口、底部出口、侧部进口和罐体加热套，所述粗馏罐的侧部进口通过连接管与所述储藏罐的出料阀连接；

所述重溶罐设有侧部进口、侧部出口和底部出料阀，所述重溶罐的侧部进口与所述粗馏罐的底部出口连接；

所述蒸馏罐设有侧部进口、顶部出口、底部出口和罐体加热套，所述蒸馏罐的侧部进口与所述重溶罐的侧部出口连接；

所述回收罐包括顶部入口和底部出料阀，所述回收罐的顶部入口通过冷凝管与所述蒸馏罐的顶部出口和所述粗馏罐的顶部出口连接，所述冷凝管上设有冷凝套。

本发明具有的优点和积极效果是：采用大豆油作为培养基的主要成分，同时采用一次发酵、调酸后两次萃取蒸馏的工艺，能够满足纯度为80%以上的鼠李糖脂低成本大规模工业化生产的需要。进一步地，通过采用消泡式发酵罐，减少了发泡的产生，提高了培养基的利用率和鼠李糖脂的产量，进一步降低了鼠李糖脂的生产成本。本发明整个工艺生产流程完整，操作步骤简单，设备容易控制。

附图说明

图1为本发明的流程框图；

图2为本发明所采用的消泡式发酵罐的结构示意图；

图3为本发明所采用的分离设备的结构示意图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：

实施例1：

请参阅图1，  一种铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：

一）采用斜面接种法将铜绿假单胞杆菌菌种移入摇瓶进行扩大培养，获得铜绿假单胞杆菌种子液。

二）先将灭菌后的发酵培养基加入发酵罐，然后按照8%的接种量将铜绿假单胞杆菌种子液接入发酵罐，在接种种子液前，在培养基中加入1‰的泡敌；上述发酵培养基中各组分的浓度为（g/L）：大豆油40；KH2PO4 3；K2HPO4 6；NaNO3 2；NaCl 0.5；KCl0.5；MgSO4·7H2O 0.1；无水CaCl2 0.01；微量元素溶液2mL/L；微量元素溶液的pH：7.0，微量元素溶液中各溶质的浓度为（g/L）：  FeSO4·7H2O 12；ZnSO4·7H2O 3.0；CoSO4·7H2O 1.0；MnSO4·2H2O 3.0。

在本实施例中，上述发酵罐为消泡式发酵罐。请参见图2，所述消泡式发酵罐包括罐体和设置在其顶端的顶盖，罐体底端设有底座9，罐体底部设有出料口8，罐体上设有加热套6，罐体上设有四个电极槽7，分别用于安装溶氧量探头、pH探头、温度探头和压力探头，溶氧量探头、pH探头、温度探头和压力探头分别通过导线与中控装置连接。罐体上部设有进气管11；顶盖上设有与其转动连接的搅拌轴、进料口3、调酸口13-1、调碱口13-2、补料口13-3和排气管1，排气管1上缠绕有冷却管2，搅拌轴的上端与电机连接轴14连接，由电机驱动。搅拌轴下部装有搅拌桨10，上部从上至下依次装有长臂消泡浆4和短臂消泡浆5，在长臂消泡浆4和短臂消泡浆5之间设有外圆周面与罐体固接的环形贴壁挡板12。

使搅拌轴保持500r/min的转速，使溶氧量保持在30%以上。发酵依靠长、短消泡浆及环形贴壁挡板机械消泡。发酵至120h即达到下罐要求，从出料口8获得糊状发酵液。

三）使用分离设备对糊状发酵液进行两次萃取蒸馏：

请参见图3，在本实施例中分离设备包括储藏罐15、粗馏罐21、重溶罐24、蒸馏罐25和回收罐23，各个罐体之间采用耐酸钢制管道或者耐酸粗皮管相连接。

储藏罐15上设有监视窗17、加料口16、出料阀19和排料阀18，监视窗17设置在储藏罐的中部，加料口16设置在储藏罐的上部，出料阀19设置在储藏罐的侧部，排料阀18设置在储藏罐的底部；监视窗17用于观察罐内的物料。打开排料阀18，可将罐内沉淀物料全部排空。

粗馏罐21设有顶部出口、底部出口、侧部进口和罐体加热套22，粗馏罐21的侧部进口通过连接管20与储藏罐15的出料阀19连接。

重溶罐24设有侧部进口、侧部出口和底部出料阀，重溶罐24的侧部进口与粗馏罐21的底部出口连接。

蒸馏罐25设有侧部进口、顶部出口、底部出口和罐体加热套，蒸馏罐25的侧部进口与重溶罐24的侧部出口连接。

回收罐27包括顶部入口和底部出料阀，回收罐27的顶部入口通过冷凝管与蒸馏罐25的顶部出口和粗馏罐21的顶部出口连接，冷凝管上设有冷凝套26。

将糊状发酵液从加料口16注入储藏罐15，并将其pH调节至1，静置，使其自然沉降后，加入浓度为30%的乙酸乙酯，进行萃取，打开出料阀19，使乙酸乙酯萃取液经连接管20进入粗馏罐21进行蒸馏，乙酸乙酯萃取液经过蒸馏后，在粗馏罐21的底部获得膏状鼠李糖脂混合物，采用泵抽的方法，使膏状鼠李糖脂混合物从粗馏罐21的底部出口排出进入重溶罐24。进行重溶萃取，重溶罐24内加注有浓度为30%的乙酸乙酯，重溶于乙酸乙酯的萃取液进入蒸馏罐25，在蒸馏罐25内进行第二次蒸馏，在蒸馏罐25的底部获得纯度为80%的膏状鼠李糖脂，并可通过其底部出口获得纯度为80%的膏状鼠李糖脂产品。

在储藏罐15底部产生的沉淀物可从其底部的排料阀18排出；粗馏罐21内蒸发后的乙酸乙酯从粗馏罐21的顶部出口排出，经冷凝管26冷凝成液态进入回收罐27；在重溶罐24底部产生的沉淀物可从其底部的排料阀排出；蒸馏罐25内蒸发后的乙酸乙酯从蒸馏罐25的顶部出口排出，经冷凝管26冷凝成液态进入回收罐27，回收罐27内回收的乙酸乙酯从其底部排料阀排出后，可重复使用。

四）将纯度为80%的膏状鼠李糖脂烘干，获得纯度95%的鼠李糖脂。

实施例2：

与实施例1的不同之处在于：

一、在步骤二）中，铜绿假单胞杆菌种子液的接种量为12%；在培养基中加入5‰的泡敌；发酵培养基中各组分的浓度为（g/L）：大豆油120；KH2PO4 7；K2HPO4 10；NaNO3 4；NaCl 2；KCl 2；MgSO4·7H2O 1；无水CaCl2 0.5；微量元素溶液10mL/L；微量元素溶液的pH：8.5，微量元素溶液中各溶质的浓度为（g/L）：  FeSO4·7H2O 12；ZnSO4·7H2O 3.0；CoSO4·7H2O 1.0；MnSO4·2H2O 3.0。

二、在步骤三）中，将糊状发酵液的pH调节至3；首次萃取加入乙酸乙酯的浓度为60%，再次萃取加入乙酸乙酯的浓度为60%；在蒸馏罐25的底部获得的膏状鼠李糖脂纯度为90%。

三、在步骤四）中，膏状鼠李糖脂烘干后，获得鼠李糖脂的纯度为99%。

除上述参数与实施例1不同外，本实施例所采用的工艺及设备均与实施例1相同。

尽管上面结合附图对本发明的优选实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以作出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

一）采用斜面接种法将铜绿假单胞杆菌菌种移入摇瓶进行扩大培养，获得铜绿假单胞杆菌种子液；

二）先将发酵培养基加入发酵罐灭菌，然后按照8%～12%的接种量将铜绿假单胞杆菌种子液接入发酵罐，在接种种子液前，在培养基中加入1-5‰的泡敌；

所述发酵培养基中各组分的浓度为（g/L）：大豆油40~120；KH2PO4 3~7；K2HPO46~10；NaNO3 2~4；NaCl 0.5~2；KCl 0.5~2；MgSO4·7H2O 0.1~1；无水CaCl2 0.01~0.5；微量元素溶液2~10mL/L；微量元素溶液的pH：7.0~8.5，所述微量元素溶液中各溶质的浓度为（g/L）：FeSO4·7H2O 12；ZnSO4·7H2O 3.0；CoSO4·7H2O 1.0；MnSO4·2H2O3.0；

铜绿假单胞杆菌种子液在发酵罐内发酵至120小时，获得糊状发酵液；

三）使用分离设备对糊状发酵液进行两次萃取蒸馏：

1）先将糊状发酵液的pH调节至1~3，然后静置，待自然沉降后，加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层萃取液；

2）蒸馏步骤1）中获得的上层萃取液，将其中的乙酸乙酯蒸馏去除，获得膏状鼠李糖脂混合物；

3）将步骤2）中获得的膏状鼠李糖脂混合物重溶在乙酸乙酯内，对其进行二次萃取，收集位于上层的二次萃取液；

4）蒸馏步骤3）中获得的二次萃取液，将其中的乙酸乙酯蒸馏去除，获得纯度为80%~90%的膏状鼠李糖脂。

2.根据权利要求1所述的用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，还包括步骤四），将纯度为80%~90%的膏状鼠李糖脂烘干，获得纯度95%以上的鼠李糖脂。

3.根据权利要求1所述的用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述发酵罐为消泡式发酵罐，所述消泡式发酵罐包括罐体和由电机驱动的搅拌轴，在所述搅拌轴的上部从上至下依次装有长臂消泡浆和短臂消泡浆，在所述长臂消泡浆和所述短臂消泡浆之间设有外圆周面与所述罐体固接的环形贴壁挡板。

4.根据权利要求1所述的用铜绿假单胞杆菌发酵、分离生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述分离设备包括储藏罐、粗馏罐、重溶罐、蒸馏罐和回收罐；

所述储藏罐上设有加料口、出料阀和排料阀，所述加料口设置在储藏罐的上部，所述出料阀设置在储藏罐的侧部，所述排料阀设置在储藏罐的底部；

所述粗馏罐设有顶部出口、底部出口、侧部进口和罐体加热套，所述粗馏罐的侧部进口通过连接管与所述储藏罐的出料阀连接；

所述重溶罐设有侧部进口、侧部出口和底部出料阀，所述重溶罐的侧部进口与所述粗馏罐的底部出口连接；

所述蒸馏罐设有侧部进口、顶部出口、底部出口和罐体加热套，所述蒸馏罐的侧部进口与所述重溶罐的侧部出口连接；

所述回收罐包括顶部入口和底部出料阀，所述回收罐的顶部入口通过冷凝管与所述蒸馏罐的顶部出口和所述粗馏罐的顶部出口连接，所述冷凝管上设有冷凝套。

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