BR102019006790A2 - Processo de produção de ramnolipídeos por fermentação submersa na presença de torta de milho como substrato sólido - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo de produção de ramnolipídeos por fermentação submersa na presença de torta de milho como substrato sólido. através deste processo pode-se simultaneamente controlar a liberação de nutrientes e indutores de síntese e evitar a formação de espumas, proporcionando grandes incrementos nas taxas de produção, alcançando concentrações superiores a 35 g/l. a presença da torta de milho evita os efeitos inibitórios acarretados pela utilização direta de altas concentrações dos indutores de síntese (e.g., glicerol e óleo de soja) no crescimento microbiano e consequentemente na produção do biossurfactante. o presente invento apresenta potencial para viabilizar a produção de ramnolipídeos utilizando as tecnologias já amplamente utilizadas na indústria biotecnológica (biorreatores de fermentação submersa) em um processo inovador com presença de substratos insolúveis.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um processo de produção de ramnolipídeos por fermentação submersa na presença de torta de milho como substrato sólido. A invenção também provê a utilização de óleo de soja e glicerol como indutores de produção, além da extração e dosagem dos ramnolipídeos produzidos por esta tecnologia fermentativa.

[002] De acordo com Müller, Kügler, Henkel, Gerlitzki, Hӧrmann, Pӧhnlein, Syldatk e Hausmann (2012), no artigo Rhamnolipids - Next generation surfactants?. os ramnolipídeos produzidos por Pseudomonas aeruginosa são uma das classes mais importantes de biossurfactantes, e estão entre os surfactantes de origem microbiana mais estudados, sendo produzidos em altas taxas e apresentando alto potencial de exploração comercial.

Antecedentes da Invenção

[003] Os surfactantes são moléculas anfipáticas que reduzem a tensão superficial das interfaces óleo/água e ar/água. A maior parte dos surfactantes no mercado hoje é de origem química, a maioria derivados do petróleo. No entanto, segundo Marchan e Banat (2012), no artigo Microbial biosurfactants: challenges and opportunities for future exploitation, existe uma grande tendência para utilização de surfactantes de origem biológica (biossurfactantes), uma vez que estes apresentam vantagens como: alta aceitabilidade ecológica, baixa toxicidade e alta biodegradabilidade. Entre os surfactantes de origem biológica, encontram-se os ramnolipídeos produzidos por cepas de Pseudomonas aeruginosa.

[004] De acordo com Randhawa e Rahman (2014), no artigo Rhamnolipid biosurfactants-past, present, and future scenario of global market, esses compostos apresentam aplicações em quase todos os ramos da indústria moderna, desde a indústria farmacêutica, cosmética e de química fina, até as indústrias alimentícias, agroquímicas e de petróleo. Apresentam ainda aplicação no aumento da biodegradação e na remoção de poluentes de baixa solubilidade

[005] Comercialmente, o processo de produção de biossurfactantes ainda não alcançou grande reconhecimento, sendo a produção industrial desses compostos ainda restrita. Os processos biotecnológicos apresentam um custo de produção mais elevado em relação aos processos químicos de produção de surfactantes. A aplicação de procedimentos trabalhosos e os relativos baixos rendimentos obtidos pelas fermentações são os principais causadores da baixa competitividade destes processos, segundo Lovaglio, Silva, Ferreira, Hausmann, e Contiero (2015), no artigo Rhamnolipids know-how: Looking for strategies for its industrial dissemination.

[006] A produção de biossurfactantes por fermentação submersa apresenta graves problemas causados pela grande formação de espumas durante as fermentações. A formação de espuma é causada pela presença dos biossurfactantes no meio de cultivo e agravada pelo método de aeração e agitação dos reatores de fermentação submersa. A grande quantidade de espuma formada retém parte da biomassa, assim como componentes do meio de cultivo. Desta maneira, junto com a espuma, que sai do reator, há saída e consequente perda de biomassa, nutrientes e produto, reduzindo a produtividade, ou até mesmo inviabilizando o processo.

[007] Compostos químicos antiespumantes podem ser aplicados durante as fermentações e serem uma alternativa para esse problema. Todavia, estes agentes podem inibir o crescimento celular, diminuir da taxa de transferência de massa, provocar reações inibitórias e efeitos tóxicos ao microrganismo, adicionalmente, podem interferir na separação e purificação do biossurfactante.

[008] Outra alternativa para formação de espuma é o desenvolvimento de métodos físicos de contenção e recuperação da espuma formada; entretanto, esses métodos podem acarretar na diminuição da eficiência do processo, além de onerarem a produção do biossurfactante, de acordo com Krieger, Camilios Neto e Mitchell (2010), no artigo Production of Microbial Biosurfactants by Solid-State Cultivation.. Desta forma, ambas as alternativas (antiespumantes e métodos físicos de contenção e recuperação da espuma) apresentam suas limitações que refletem diretamente nos processos biotecnológicos para produção de biossurfactantes, o que resulta em um baixíssimo número de processos industriais de obtenção destes compostos.

[009] A patente BR 102017000578-0 A2 descreve um processo de produção de ramnolipídeo por Pseudomonas aeruginosa ou Enterobacter hormaechei utilizando resíduos da extração do óleo da semente de andiroba ou murumuru, contendo monossacarídeos (utilizado pelo microrganismo para a produção), em biorreator com aeração não dispersiva, com intenção de diminuir a formação de espuma. Sendo obtido um máximo de produção de 10,5 g/L de ramnolipídeo pela bactéria Pseudomonas aeruginosa com resíduos de semente de andiroba.

[010] A patente PI0705327-4 (BR1120160272900) descreve o uso de diferentes linhagens de Pseudomonas aeruginosa incluindo um mutante deficiente na biossíntese de polihidroxialcanoatos e com capacidade aumentada de produção de ramnolipídeos. Diferentes fontes de carbono derivadas de óleos vegetais e carboidratos foram utilizadas em processo de fermentação submersa em batelada alimentada em reator de fermentação submersa. Os autores relatam uma produção controlada para obtenção de diferentes relações da porção de ramnose com a porção de 3-hidroalcanoatos dos congêneres obtidos.

[011] A invenção BR102013029433-0A2/ US2014/0148588A1/ US9434755B2 refere-se a um método para o isolamento de ramnolipídeos. Este processo relata diferentes formas de se obter ramnolipídeos pré-purificados com reduzido uso de solventes orgânicos. Entre os exemplos utilizados encontram-se separações de ramnolipídeos de anti-espumante a base de silicone, e também de óleo de girassol, ambos compostos hidrofóbicos contaminantes das fases orgânicas dos diferentes métodos de separação descritos na literatura científica.

[012] A invenção US 2016/0272667 A1 fornece métodos alternativos, na ausência de solventes orgânicos para obtenção de diferentes composições de ramnolipídeos.

[013] A patente WO2016/139127 A1/ BR 1120170174448 A2 descreve um método de extração de pelo menos um composto ramnolipídico utilizando solventes e co-solventes orgânicos juntamente com alteração de temperatura e pressão.

[014] O processo BR1120160272900 / WO2015180907A1 descreve a produção de pelo menos um congênere de ramnolipídeo através de bactérias recombinantes (Pseudomonas putida) com atividades aumentadas de pelo menos uma das três enzimas do final da biossíntese dos ramnolipídeos [ie, α/β hidrolase (RhlA), ramnosiltransferase I (RhlB) e ramnosiltransferse II (RhlC)]. Este processo utilizou fontes de carbonos com apenas quatro átomos de carbono (C4) (i.e, butano, 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona ou ácido butírico). Para habilitar estes microrganismos ao metabolismo das referidas fontes, também foram inseridas oxirredutases do tipo mono-oxigenases (AlqG) e álcool desidrogenases (ADH), importantes para o metabolismo de butano e butanol respectivamente. Os processos descritos foram fermentações submersas em batelada alimentada em reator de fermentação de 300 mL contendo 180 ml de meio de cultivo. Os cultivos foram alimentados com solução de glicose ou com compostos C4 acima citados. Os melhores resultados foram obtidos com 1-butanol, 1,1 g/L de di-ramnolipídeos.

[015] A patente WO2016131801A1 descreve a produção de pelo menos um congênere de ramnolipídeo através de bactérias recombinantes que quando comparadas com as estirpes selvagens apresentem atividade aumentada de pelo menos uma das três enzimas do final da biossíntese dos ramnolipídeos [ie, α/β hidrolase (RhlA), ramnosiltransferase I (RhlB) e ramnosiltransferse II (RhlC)]. Utilizando fontes de carbonos como alcanos e/ou ácidos alcanóicos de seis a dez átomos de carbono.

[016] A invenção CN101948793A fornece uma estirpe bacteriana (KT2440- rhlABRI Pseudomonas putida) capaz de produzir biossurfactante (ramnolipídeo). O cluster rhlABRI (relacionado a síntese do biossurfactante), por recombinação homóloga, é integrado ao DNA da bactéria Pseudomonas putida. Os resultados mostram que a estirpe KT2440-rhlABRI é capaz de aumentar a degradação de pireno no solo.

[016] A patente BR1120130021241 / DE 10 2010 032 484-1 trata da produção de ramnolipídeos através de bactérias recombinantes não patogênicas. Estas bactérias carregam genes homólogos aos genes rhlA, rhlB e rhlC (genes de P. aeruginosa responsáveis pelos passos finais da via síntese) e apresentem a aumento de atividade de pelo menos um dos produtos destes referidos genes.

[017] A invenção WO2013041670A1 descreve a produção de ramnolipídeos através de bactérias geneticamente modificadas carregando uma cópia do gene rhlA ou um ortólogo deste, e uma cópia do gene rhlB ou um gene ortólogo, em ambos os casos os genes estão sob o controle de um promotor heterólogo. Esta célula hospedeira é capa de produzir ramnolipídeos em uma relação molar de mais de 0,18 Cmol de ramnolipídeos por Cmol de substrato.

[018] A invenção WO2016115048A1 descreve diferentes processos de obtenção de composições de ramnolipídeos ou de misturas de ramnolipídeos isoladas por métodos que não utilizam solventes orgânicos. Processos como repouso de 24 a 48 horas do sobrenadante de cultivo seguidos de esterilização por autoclave, filtração e redução com peróxido de hidrogênio estão descritas nesta invenção, assim como precipitação com ácido.

[019] A invenção WO2016/179249A1 trata de um método de fermentação submersa semi-contínua para produção de ramnolipídeos. O processo é caracterizado por fermentações sequenciais em batelada, assim no final de cada fermentação (quatro ou cinco dias) uma fração de pelo menos 70% do meio fermentado é retirado e substituído por meio fresco. Este processo é repetido por aproximadamente um mês. Este processo otimiza a capacidade de utilização do fermentador diminuindo o tempo gasto com limpeza quando comparada a estratégias de batelada e batelada alimentada.

[020] As patentes acima citadas descrevem: 1) processos de fermentação submersa, por batelada, batelada alimenta e também por processos semicontínuos; 2) processos de produção controlada para obtenção de diferentes relações da porção de ramnose com a porção de 3-hidroalcanoatos dos congêneres obtidos; 3) processos de obtenção de mutantes obtidos a partir de bactérias GRAS (do inglês: Generally Recognized as Safe, que significa substancia ou produto que pode ser intencionalmente adicionado a alimentos e não trazem nenhum mal à saúde) e com maior capacidade de produção de ramnolipídeos quando comparado com as respectivas estirpes selvagens; 4) processos de obtenção de mutante de Pseudomonas aeruginosa deficiente na biossíntese de polihidroxialcanoatos e com capacidade aumentada de produção de ramnolipídeos; 5) diferentes processos de separação dos ramnolipídeos, sendo que os maiores problemas relatados a serem resolvidos pelas invenções relacionam-se com a separação dos ramnolipídeos de compostos hidrofóbicos como óleos vegetais e antiespumantes a base de silicone. Cada um destes processos apresenta vantagens e também limitações.

[021] Já, o presente invento trata do processo de produção de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa em fermentações submersas utilizando torta de milho como suporte sólido. Através deste processo, pode-se evitar a formação de espumas sem diminuir a eficiência do processo e nem acarretar em aumento de custo, uma vez que a torta de milho é um resíduo agroindustrial e a sua presença como um suporta sólido evita a formação de espuma.

[022] Finalmente, vale a pena ressaltar que no presente processo não é necessário o uso de antiespumantes, uma vez que a presença do suporte sólido evita a formação de espuma. A utilização de substratos sólidos em fermentações submersas evita a formação de espumas (grave problema das fermentações submersas), e ainda controla a entrega de nutrientes e indutores de síntese (e.g., glicerol e óleos vegetais). Somada a essa vantagem, este processo pode viabilizar a obtenção biotecnológica de surfactantes.

Sumário da Invenção

[023] O objetivo do presente invento é produzir ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa através de fermentação submersa utilizando torta de milho como substrato sólido. Este processo inibe a formação de espumas sem diminuir a eficiência e nem acarretar em aumento de custo, uma vez que o substrato sólido, neste caso a torta de milho, evita a formação de espuma. Outras vantagens são: (i) a diminuição dos custos operacionais, já que a torta de milho, por ser um subproduto da extração do óleo de milho, apresenta baixo custo; (ii) o aumento do rendimento do produto e (iii) a presença da torta de milho propicia a adição de óleo vegetal e o aumento da concentração de glicerol, ambos promovendo incrementos na produção. O presente invento apresenta potencial para viabilizar a produção de ramnolipídeos utilizando as tecnologias já amplamente utilizadas na indústria biotecnológica (biorreatores de fermentação submersa) em um processo inovador.

Descrição Detalhada da Invenção

[024] A fermentação submersa na presença de torta de milho como suporte sólido (FSb-TM) pode ser definida como uma técnica que envolve um subproduto sólido com alta capacidade de absorção de água utilizado como suporte para o crescimento bacteriano e produção de ramnolipídeos.

[025] O microrganismo utilizado neste invento foi a cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO1, originalmente isolada na Austrália, a partir de feridas humanas infectadas, de acordo com Holloway (1955), no artigo Genetic recombination in Pseudomonas aeruginosa. Segundo Stover et al (2000), no artigo Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen, PAO1 é a cepa referência de Pseudomonas aeruginosa, mundialmente mais utilizada em estudos laboratoriais, apresenta o genoma sequenciado, publicado. e que vem recebendo constantes atualizações nas anotações, que podem ser acompanhadas pelo site http://www.pseudomonas.com. Este microrganismo está depositado no Banco Coleção de Culturas Americano ATCC (do inglês: American Type Culture Collection) sob o número ATCC 15692.

[026] Os ensaios de FSb-TM foram realizados em frascos Erlenmeyers 125 mL, contendo de 0,625 a 5g de torta de milho e 1 a 6 % de óleo de soja. Os frascos foram esterilizados por 20 min, a 121 °C/1 ATM, resfriados e inoculados em uma proporção de 2 - 4 % de volume de inóculo em volume de meio de cultivo. Este meio de cultivo era constituído de solução de sais (contendo, por litro: 3,0 g KH2PO4; 7,0 g K2HPO4; 0,2 g MgSO4.7H2O e 1,0 g (NH4)2SO4) adicionada de glicerol 3 a 10 % (v/v). O volume total de meio de cultivo utilizado foi de 25 mL.

[027] Frascos Erlenmeyers, contendo de 0,625 a 5g de torta de milho foram inoculados e incubados em estufa bacteriológica em temperaturas de 30 a 40°C. Os pré-inóculos foram realizados em frascos Erlenmeyers contendo meio Luria-Bertani (composição por litro: 10 g NaCl, 10 g triptona e 5 g extrato de levedura), inoculados com 3 a 5 colônias bacterianas obtidas de placas com meio Luria-Bertani adicionado de 1,5 % (m/v) de ágar.

[028] Os cultivos foram interrompidos, no tempo de cultivo oportuno, e submetidos à extração dos ramnolipídeos com água destilada em agitador orbital a 100 - 300 rpm por 15 - 60 minutos. Os extratos resultantes foram centrifugados a 2.000 - 5.000 g por 5 - 15 min. Os sobrenadantes obtidos foram utilizados para a extração orgânica utilizando-se uma mistura de clorofórmio/metanol (CHCl3:CH3OH, 3:1). Os extratos orgânicos foram recuperados em funil de separação, e em seguida submetidos a evaporador rotatório. Os extratos concentrados resultantes foram: (1) solubilizados em água, e a solução resultante utilizada para quantificação indireta dos ramnolipídeos pelo método de fenol-sulfúrico, utilizando uma curva padrão de ramnose.

[029] As etapas do processo são mostradas na Figura 1, onde as letras representam os produtos e os números representam os processos. O processo 1 é caracterizado pelo inóculo do meio de cultivo (B) a partir do pré-inóculo (A). Na sequência, o meio de cultivo inoculado é transferido para frascos Erlenmeyer contendo diferentes porcentagens de torta de milho (C). O produto C adicionado de meio de cultivo inoculado é incubado em temperatura de 30 oC a 40 oC por tempo de cultivo de 216 horas (processo 3 - FSb-TM). O produto D é submetido a processos sequenciais de extração aquosa e extração orgânica (4) [a última utilizando-se uma mistura de clorofórmio/metanol (CHCl3:CH3OH, 3:1)]. Os extratos orgânicos são recuperados em funil de separação, e em seguida submetidos a evaporador rotatório obtendo-se assim um extrato orgânico concentrado de ramnolipídeos (E). O produto (E) pode ser submetido à dissolução em água obtendo-se (F), sendo este utilizado para o processo quantificação indireta dos ramnolipídeos utilizando curva padrão de ramnose.

[030] A Figura 2 mostra: (A) Torta de Milho, (B) um "reator experimental” de produção de ramnolipídeos (produto C da Figura 1); um frasco Erlenmeyers de 125 mL contendo diferentes quantidades de torta de milho.

[031] A produção de ramnolipídeos obtida por fermentação submersa com suporte sólido pode ser vista na Figura 3: 1) fermentação submersa [(FSb-G3) -frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25 mL de meio de cultivo inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 oC/180 rpm por 9 dias]; 2) fermentação submersa com torta de milho [(FSb-TM10G3) - frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25 mL de meio de cultivo inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 oC por 9 dias]. A produção de ramnolipídeos é significativamente maior no processo fermentativo com presença da torta de milho (FSb-TM10G3). A produção neste modelo (FSb-TM10G3) além de apresentar uma concentração de ramnolipídeos mais de quatro vezes superior ao processo clássico de produção (FSb-G3), ainda apresenta a vantagem de utilizar um subproduto agroindustrial, o que diminui os custos de produção dos ramnolipídeos, além de evitar a formação de espumas.

[032] A produção de ramnolipídeos obtida por fermentação submersa com suporte solido de torta de milho e diferentes concentrações de glicerol pode ser vista na Figura 4: 1) fermentação submersa com torta de milho e 3% de glicerol [(FSb-TM10G3) - frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25 mL de meio de cultivo inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 oC/180 rpm por 9 dias]; 2) fermentação submersa com torta de milho e glicerol 6% [(FSb-TM10G6) -frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25 mL de meio de cultivo inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 oC por 9 dias]; 3) fermentação submersa com torta de milho e glicerol 10% [(FSb-TM10G10) - frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL de meio de cultivo inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 oC por 9 dias]. A utilização de 6 % de glicerol mostrou-se a melhor condição para a produção de ramnolipídeos, uma vez que há maior quantidade de carbono disponível.

[033] Com intuito de impedir a formação de espuma e melhorar a síntese de ramnolipídeos, adicionou-se diferentes concentrações de óleo de soja aos cultivos. A porcentagem (10%) de torta de milho, bem como a porcentagem de glicerol (6%) foram mantidas. O efeito da adição de diferentes concentrações de óleo de soja pode ser visto na figura 5. A adição de 1% de óleo de soja (FSb-TM10G6OS1) foi a melhor condição encontrada, produzindo cerca de 30 g/L de ramnolipídeos.

[034] Com objetivo de se obter a máxima produção do biossurfactante, diferentes porcentagens se substrato sólido de torta de milho foram avaliadas, os resultados encontram-se na figura 6. Tanto a utilização de 5% e 10% (FSb-TM5G6OS1 e FSb-TM10G6OS1 respectivamente) de torta de milho são as melhores condições para aumentar a produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa. Dessa forma, o uso de 5% de torta de milho é a melhor opção, uma vez que, obtém-se a produção máxima de ramnolipídeos e simultaneamente há economia de material, pois utiliza-se menor quantidade de substrato sólido.
Legenda das Figuras
Figura 1 Modelo esquemático do processo de produção e extração de ramnolipídeos obtidos por fermentação submersa com suporte sólido de torta de milho.
Figura 2 (A) Suporte sólido de torta de milho e (B) Reator de produção de ramnolipídeos por fermentação submersa com suporte sólido de torta de milho.
Figura 3 Produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa por Fermentação submersa e Fermentação submersa com suporte sólido.
FSb-G3: Fermentação Submersa com 3% de glicerol; FSb-TM10G3: Fermentação submersa com 10% de torta de milho como suporte sólido e 3% de glicerol.
Figura 4 Produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa por Fermentação submersa com diferentes concentrações de glicerol
FSb-TM10G3: Fermentação submersa com 10% de torta de milho e 3% de glicerol; FSb-TM10G6: Fermentação submersa com 10% de torta de milho e 6% de glicerol; FSb-TM10G10: Fermentação submersa com 10% de torta de milho e 10% de glicerol.
Figura 5 Produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa por Fermentação submersa com 6% de glicerol e diferentes concentrações de óleo de soja
FSb-TM10G6OS1: Fermentação submersa com 10% de torta de milho, 6% de glicerol e 1% de óleo de soja; FSb-TM10G6OS2: Fermentação submersa com 10% de torta de milho, 6% de glicerol e 2% de óleo de soja; FSb-TM10G6OS3: Fermentação submersa com 10% de torta de milho, 6% de glicerol e 3% de óleo de soja; FSb-TM10G6OS6: Fermentação submersa com 10% de torta de milho, 6% de glicerol e 6% de óleo de soja.
Figura 6 Produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa por Fermentação submersa com diferentes concentrações de torta de milho
FSb-TM2,5G6OS1: Fermentação submersa com 2,5% de torta de milho, 6% de glicerol e 1% de óleo de soja; FSb-TM5G6OS2: Fermentação submersa com 5% de torta de milho, 6% de glicerol e 2% de óleo de soja; FSb-TM10G6OS3: Fermentação submersa com 10% de torta de milho, 6% de glicerol e 3% de óleo de soja; FSb-TM20G6OS6: Fermentação submersa com 20% de torta de milho, 6% de glicerol e 6% de óleo de soja.

Claims (8)

1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, caracterizado pelo processo de fermentação submersa com presença de suporte sólido para obtenção de ramnolipídeos sintetizados e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 1, FIG 2 e FIG 3)
2. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela utilização de torta de milho, como suporte e substrato sólido, para obtenção de ramnolipídeos sintetizados e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 1, FIG 2 e FIG 3)
3. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pela utilização de torta de milho como fonte de carbono e indutor de síntese de ramnolipídeos sintetizados e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 1, FIG 2 e FIG 3)
4. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizada pela utilização de glicerol como fonte de carbono e indutor de síntese de ramnolipídeos sintetizados e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 1, FIG 2, FIG 3 e FIG 4)
5. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizada pela utilização de óleo de soja como fonte de carbono e indutor de síntese de ramnolipídeos sintetizados e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 1, FIG 2, FIG 3, FIG 4, FIG 5, e FIG 6)
6. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizada pela utilização de torta de milho e óleo de soja como antiespumantes durante a produção de ramnolipídeos sintetizados e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 4, FIG 5 e FIG 6)
7. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo processo de extração aquosa dos ramnolipídeos, conduzido através da adição de água ao sistema, sendo o conjunto submetido à agitação de 100 a 300 rpm de 15 a 60 minutos em agitador orbital, seguido por centrifugação do extrato aquoso (FIG 1)
8. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA NA PRESENÇA DE TORTA DE MILHO COMO SUBSTRATO SÓLIDO, de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizado por processo de extração e purificação parcial dos ramnolipídeos, a partir do extrato aquoso livre de células, sendo este submetido a extração líquido-líquido com clorofórmio:metanol e recuperação dos ramnolipídeos a partir da fase orgânica (FIG 1).

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