CN104694599A - 一种表面活性剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面活性剂的制备方法，该方法用节杆菌作菌种，可以分别通过下列二种方法：(1)节杆菌在最佳培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物；(2)用节杆菌休止细胞制备海藻糖脂类化合物。其中，培养温度为25-38℃，pH＝4.5-7.8，以0.6-1.4（体积比）/分的空气或富含氧气的空气通入培养物。发酵后，发酵液用1.5-3.0倍量的甲醇-氯仿溶剂或乙酸乙酯提取，其中甲醇∶氯仿＝1∶1.8-2.8（V/V）。采用本发明代谢调节的方法，能使海藻糖脂类表面活性剂产量达到25克/升左右，对碳源基质的转化率也能提高一倍。而采用休止细胞生产表面活性物的方法是一种廉价，简便的制备表面活性剂的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性剂的制备方法，尤其涉及一种生物表面活性剂的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
用微生物来生产表面活性剂是七十年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。微生物在代谢过程中常分泌一些生化产物。其分子结构具有亲水和疏水两种组分，如糖脂类，磷脂类及脂蛋白类等。生物表面活性剂具有乳化、破乳、润湿、增溶、发泡、消泡、抗静电、抗腐蚀等功能，因此应用范围甚广，可应用于石油三次开采，消除石油污染及日化、食品和纺织工业等方面。
根据现在研究情况来看，糖脂是最主要的一类生物表面活性剂。但现有技术中糖脂的产量仅5-10克/升。
为了使糖脂达到工业化生产水平，必须继续研发改进表面活性剂的培养方法，提高产量，降低成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是，提供一种表面活性剂的制备方法，即微生物生产海藻糖脂类表面活剂的方法，该方法成本低廉，产量较高，可广泛应用于日化、食品等行业。
本发明为了解决上述问题，采用的技术方案如下：
一种表面活性剂的制备方法，该方法用节杆菌作菌种，可以分别通过下列二种方法：
(1)节杆菌在最佳培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物；
(2)用节杆菌休止细胞制备海藻糖脂类化合物。
其中，培养温度为25-38℃，pH＝4.5-7.8，以0.6-1.4（体积比）/分的空气或富含氧气的空气通入培养物。
具体的，发酵后，发酵液用1.5-3.0倍量的甲醇-氯仿溶剂或乙酸乙酯提取，其中甲醇∶氯仿＝1∶1.8-2.8（V/V）。
优选的，在步骤（1）中，有机营养源采用酵母膏，用量为0.2-0.45%。
优选的，在步骤（1）中，培养液中含有ZnSO4·7H2O为0.002-0.0045克/升，MnSO4·H2O为0.02-0.034克/升，CaCl2·2H2O为0.02-0.045克/升。
进一步的，在步骤（1）中，在发酵过程中用KOH或NaOH调节pH至4.8-7.8。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：
用本发明的节杆菌休止细胞，生产表面活性剂的方法。首先将节杆菌培养休止细胞，再用休止细胞直接生产海藻糖脂类化合物：先找出利用何种廉价碳源能生产菌体，节杆菌能长于葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糠、废糖蜜、甘油、醋酸盐等碳源，其中废糖蜜和葡萄糖是较合适的碳源，菌体产量能达10克/升。将休止细胞悬浮于磷酸缓冲液、生理盐水、蒸馏水或自来水都能产生糖脂，而以磷酸缓冲液作培养液产糖脂最多。磷酸缓冲液浓度可为0.1-0.5M，pH为4.5-7.8培养温度为25-38℃，最佳温度是25-30℃。节杆菌休止细胞产糖脂可用各种糖类、正烷烃、馏份油或植物油作碳源，其中正烷烃转化率能达0.4-0.6。
利用本发明的方法，节杆菌休止细胞在地下适当条件下，如温度25-38℃，通空气，pH控制在4.5-7.8，可直接用于石油的三次开采。采用本发明的方法，用节杆菌生产出的糖脂类化合物是海藻糖四脂和海藻糖单脂，二种糖脂间的比例也是随着代谢调节改变的。当氮源非限制培养时，产物主要是海藻糖单脂，而当氮源限制时，产物则主要就是海藻糖四脂。用休止细胞培养时产物极大部分是海藻糖四脂。用本发明的方法生产所得的海藻糖脂可用石油三次开采及日化、纺织、食品等工业。
采用本发明代谢调节的方法，能使海藻糖脂类表面活性剂产量达到25克/升左右，对碳源基质的转化率也能提高一倍。而采用休止细胞生产表面活性物的方法是一种廉价，简便的制备表面活性剂的方法。
具体实施方式
以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例一
一个5升自控生物反应器，装2.0升营养盐溶液，成份为：Na2HPO4·2H2O 1克，MgSO4·7H2O 0.5克，FeSO4·7H2O 0.1克，ZnSO4·7H2O 0.005克，KH2PO41克，（NH4）2SO42.5克，MnSO4·H2O 0.01克，CaCl2·2H2O 0.05克，酵母膏1克，溶于1升水中，加200毫升正烷烃，温度30℃，接入节杆菌种子250毫升，转速500转/分，通风2.5立升/分，培养过程中自动加入1N NaOH使pH值维持在6.50，发酵72小时，含表面活性物培养液2升，用二倍量三氯甲烷∶甲醇（V∶V＝2∶1）溶剂提取，得粗糖脂96克，经硅胶柱层析得糖脂56克。
实施例二
休止细胞生产糖脂
1.休止细胞培养于：把节杆菌培养下列培养液（5升三角瓶装1升培养基）：Na2HPO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，FeSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，FeSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·H2O 0.01克/升，CaCl2·2H2O 0.05克/升，葡萄糖30克/升，pH6.8，30℃，振荡培养4天，离心菌体，用0.9% NaCl洗涤两次，再放于0.1M磷酸缓冲液振荡4小时，离心得休止细胞。
2.休止细胞在发酵罐中生产糖脂：一个5升自控发酵罐，装2.5升0.1M磷酸缓冲液（pH6.5），接入相当于25克干重的休止细胞，加入正烷烃200ml，转速500转/分，通风2.5立升/分，培养94小时，终了即用二倍量的二氯甲烷∶甲醇体积比（2∶1）提取，蒸干得粗脂122克。
上述具体实施方式，仅为说明本发明的技术构思，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种表面活性剂的制备方法，其特征在于，该方法用节杆菌作菌种，可以分别通过下列二种方法：
(1)节杆菌在最佳培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物；
(2)用节杆菌休止细胞制备海藻糖脂类化合物。
2.其中，培养温度为25-38℃，pH＝4.5-7.8，以0.6-1.4（体积比）/分的空气或富含氧气的空气通入培养物。
3.根据权利要求1所述的一种表面活性剂的制备方法，其特征在于，发酵后，发酵液用1.5-3.0倍量的甲醇-氯仿溶剂或乙酸乙酯提取，其中甲醇∶氯仿＝1∶1.8-2.8（V/V）。
4.根据权利要求1或2所述的一种表面活性剂的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，有机营养源采用酵母膏，用量为0.2-0.45%。
5.根据权利要求1或2所述的一种表面活性剂的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，培养液中含有ZnSO4·7H2O为0.002-0.0045克/升，MnSO4·H2O为0.02-0.034克/升，CaCl2·2H2O为0.02-0.045克/升。
6.根据权利要求1或2所述的一种表面活性剂的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，在发酵过程中用KOH或NaOH调节pH至4.8-7.8。
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