CN112126598B - 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法 - Google Patents

一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112126598B
CN112126598B CN202010924375.2A CN202010924375A CN112126598B CN 112126598 B CN112126598 B CN 112126598B CN 202010924375 A CN202010924375 A CN 202010924375A CN 112126598 B CN112126598 B CN 112126598B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
seed
pseudomonas aeruginosa
rhamnolipid
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010924375.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112126598A (zh
Inventor
汪江林
陈玲
李秦佩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Hengshi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Hengshi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Hengshi Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Hengshi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010924375.2A priority Critical patent/CN112126598B/zh
Publication of CN112126598A publication Critical patent/CN112126598A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112126598B publication Critical patent/CN112126598B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法，属于生物工程领域。采用Am607菌株进行鼠李糖脂的生产方法，除在23‑42℃下进行培养和发酵生产外，其他都可以参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，包括以下步骤：a)菌种活化；培养1～2天；b)利用种子培养基制备种子液；在23‑42℃培养，培养时间20～48h，测得种子液的OD600在5～6时，接种到装有发酵培养基的发酵罐中；c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵，通过Am607铜绿假单胞菌株在23‑42℃的发酵温度发酵生产鼠李糖脂；发酵液中的底物浓度30‑400g/L，调节pH至7.2。优选在25℃培养；优选发酵温度24℃‑28℃。

Description

一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法
技术领域
本发明涉及一种生产鼠李糖脂的菌株及发酵生产方法，属于生物工程领域。
背景技术
生物表面活性剂来源于微生物和动植物，由亲水基(酸、阳离子、阴离子、单糖、双糖或多糖)和疏水基(饱和、不饱和烃链或脂肪酸)构成。与化学合成表面活性剂相比较，生物表面活性剂化学结构更复杂，功能基团多，具有降低液体表面/界面张力、形成胶束以及两相微乳液等多种表面活性功能，同时具有良好的热稳定性和化学稳定性，且产品本身无毒，环境友好，可被环境微生物降解，具有较好的生物相容性，是典型的环保型＂绿色产品＂。此外，近年研究表明，生物表面活性剂可干扰细胞膜通透性，具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理作用和免疫功能，可被开发成新型生物医药和生物农药，对于缓解农药环境污染等问题具有突出作用。因此，环境问题日益严峻，人们越来越重视生物表面活性剂的开发和应用，以期代替常规的化学合成类表面活性剂，使之广泛用于石油工业、生态环境、日化用品、食品和医药工业以及绿色农业等领域。
鼠李糖脂是目前为止研究最为深入的一种阴离子生物表面活性剂，能显著降低水的表面张力改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。自然界中可以合成鼠李糖脂的微生物很多，其中常用的微生物是假单胞菌类，尤其以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为主，可以利用多种碳源为底物合成鼠李糖脂，如葡萄糖、蔗糖、甘油、葵花籽油、菜籽油、大豆油等各种植物油。
公开号CN101177696B的中国专利公开了一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法，突变菌株铜绿假单胞菌VTS-1以玉米油为碳源，发酵温度控制在30～34℃。
公开号CN103589765B的中国专利公开了一种制备鼠李糖脂发酵液的方法，发酵温度控制在35-39℃。
公开号CN108342431A的中国专利公开了一种鼠李糖脂的高效发酵工艺的方法，其种子培养和发酵时的温度控制在30℃。
目前，现有利用铜绿假单胞菌，无论是以植物油还是用甘油、乙醇等以及其中的二种或两种以上的混合物为碳源发酵产鼠李糖脂，其发酵温度均在30-39℃，一般发酵温度低于 30℃或高于39℃时菌体的产脂能力都会有大幅度的下降，甚至还会出现没有产物生成的情况。
传统铜绿假单胞菌其最适宜发酵温度为30-37℃。
发明内容
本发明提供出了一种铜绿假单胞菌株，以解决目前铜绿假单孢菌株温度适应范围窄、无法实现低温(25度)发酵的技术问题。
为此，本发明需要保护的技术方案为：
技术方案一
一种铜绿假单胞菌株，该菌株为铜绿假单胞菌Am607(Pseudomonas aeruginosaAm607)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020269。
技术方案二
上述铜绿假单胞菌株的用途，用于生产鼠李糖脂。
技术方案三
上述铜绿假单胞菌株用于生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，控制发酵温度23℃-42℃，其他发酵过程和条件控制参照传统铜绿假单胞菌株生产鼠李糖脂的一般方法。
优选，所述发酵温度限制24℃-26℃，是本发明铜绿假单胞菌Am607最适宜高产鼠李糖脂温度条件。
更进一步优选，所述发酵温度限制25℃。
所述铜绿假单胞菌Am607，可以在23-42℃的种子生产温度制备种子液；和/或在23- 42℃的发酵温度发酵生产鼠李糖脂。
所述铜绿假单胞菌Am607，其生产鼠李糖脂为亲水端为一个或者二个鼠李糖，疏水端为链长从C8到C14，包含单键或双键长度相同或不同的脂肪酸链中的一种或多种；
所述鼠李糖脂包括但不限于Rha-C10-C12,Rha-C12-C10，Rha-Rha-C10-C12,Rha-Rha- C12-C10，Rha-Rha-C10-C10，Rha-C8-C10,Rha-C10-C8，Rha-Rha-C8-C10,Rha-Rha-C10-C8， Rha-C10-C10中的一种或多种。
所述铜绿假单胞菌Am607，其发酵的底物包括但不限于是植物油、甘油和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐、烷烃、乙醇、废弃油脂、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种。
所述发酵的底物的添加量为30-400g/L。
举例而非限定，所述铜绿假单胞菌Am607，其发酵的培养基包括：
碳源 30-400g/L
氮源 每种所述氮源浓度为0.5-10g/L
无机盐 每种所述无机盐浓度为0.5-12g/L。
举例而非限定，所述碳源包括或者是植物油、甘油和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐、烷烃、乙醇、废弃油脂、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇、中的一种或多种；
举例而非限定，所述氮源包括或者是酵母抽提物、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种；
举例而非限定，所述无机盐包括钾盐、钠盐、钙盐、锰盐、锌盐、镁盐和铜盐中的一种或多种；所述钾盐包括氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种，所述钙盐包括氯化钙、硫酸钙、磷酸钙中的一种或多种，所述锰盐包括氯化锰、硫酸锰中的一种或多种，所述锰盐包氯化锌、硫酸锌中的碳酸锌中的一种或多种，所述镁盐包括氯化镁、硫酸镁、碳酸镁中的一种或多种，所述铜盐包括氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的一种或多种。
举例而非限定，所述铜绿假单胞菌Am607，其发酵培养基包括：
Figure BDA0002667811050000031
所述铜绿假单胞菌Am607，其生产方法包括以下常规步骤：
a)菌种活化；
b)利用种子培养基制备种子液；
c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵。
举例而非限定，所述铜绿假单胞菌Am607的培养基参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，举例而非限定，可选用LB培养基。举例而非限定，所述LB培养基包括酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水。
所述铜绿假单胞菌Am607的培养基参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，举例而非限定，可选用的种子培养基包括：酵母粉1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，NaCl 5-10g/L；其制备种子液可参照传统铜绿假单胞菌，举例而非限定其培养时间可以20～48h，种子成熟指标为OD600可以为5～6。
本发明的铜绿假单胞菌株，温度适应性广，最适温度区间较大(该菌株是在25-42℃条件下可以高效发酵产脂)，尤其在低温(温度25℃)下表现最优进行发酵。
本发明铜绿假单胞菌株在环境温度较低(温度25℃)的情况下发酵生产鼠李糖脂，在鼠李糖脂工业生产中，尤其在冬季环境温度较低时不需要为维持铜绿假单胞菌较高的最佳发酵温度(30℃～39℃)需要大量热水来加热，降低了电能消耗、设备投资、人员投入，降低了生产成本且利于节能减排。
附图说明
图1是实施例1中Am607的第一代的菌落照片；
图2是实施例1中Am607的第六代的菌落照片；
图3为实施例及对比例发酵液中鼠李糖脂表面活性剂的比色法检测含量曲线；
图4是由实施例2-7，9-14共12个实施例建立的浓度-温度关系曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，解释说明本发明技术方案。
本申请的发明人通过在油田附近收集部分土壤，从土壤中分离出一株铜绿假单胞菌，命名为Am401。其分离筛选步骤如下：
1.菌种的富集培养
取土壤1g溶到100ml无菌水后，吸取1mL接入于富集培养基中，置37℃恒温震荡培养箱中培养24小时(富集培养基配方为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、双蒸水1000mL及琼脂20g，pH 7.0～7.2)；
2.分离纯化
分离纯化：
将富集培养后得到的菌悬液稀释1000倍-1000000倍后，吸取0.1ml菌悬液进行血琼脂平板(此平板购于上海生工)涂布，于37℃恒温培养箱中培养48小时，挑选菌落周围溶血圈大的菌株LB摇瓶培养后采用相同的方法涂布到蓝平板(硫酸铵0.1％，硝酸钠0.2％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾1％，磷酸氢二钠0.4％，酵母粉0.05％及余量水，pH 7.0～ 7.2，浸有原油的粗滤纸)后分离纯化培养48小时，得到铜绿假单胞菌Am041。再以Am041 为出发菌株，通过温度梯度驯化、NTG诱变、ARTP诱变方法进行诱变育种后，筛选得到了一株新的铜绿假单胞菌，命名为Am607(Pseudomonas aeruginosa Am607，其能够在温度23- 42℃将不同植物油、甘油和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐、烷烃、乙醇、废弃油脂或它们中的两种以上的混合物高效转化为鼠李糖脂。尤其突出的是，该Am607菌种的最适宜发酵温度为25℃。
对Am607完成了保藏，保藏信息为
菌株：铜绿假单胞菌Am607(Pseudomonas aeruginosa Am607)
保藏日期：2020年07月03日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)
保藏编号：CCTCC NO:M 2020269
采用Am607菌株进行鼠李糖脂的生产方法，除在23-42℃下进行培养和发酵生产外，其他都可以参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，举例而非限定，包括以下步骤：
a)菌种活化；
摇床培养1～2天；菌种活化的培养基是LB培养基，包括酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水。
b)利用种子培养基制备种子液；
在23-42℃培养，优选在25℃培养，培养时间20～48h，测得种子液的OD600在5～6时，接种到装有发酵培养基的发酵罐中。种子培养基包括：酵母粉1-5g/L，蛋白胨5- 10g/L，NaCl 5-10g/L。
c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵，通过Am607铜绿假单胞菌株在23-42℃的发酵温度发酵生产鼠李糖脂，优选24℃-28℃。参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，发酵初始时，举例而非限制，发酵液中的底物浓度可以30-100g/L，用NaOH溶液调节培养基pH至7.2。
实施例1
本发明的铜绿假单胞菌Am607(Pseudomonas aeruginosa Am607)，经传代实验验证，经五次传代后菌落形态及生产鼠李糖脂的能力均未出现明显变化(见图1、图2)。在25℃条件下，第一代和第六代菌株经5L罐发酵产鼠李糖脂分别为160g/L和161g/L；在LB固体培养基平皿上菌落形态：灰绿色菌落，扁平湿润、边缘不整齐，有特殊生姜味，金属光泽。可见本发明的铜绿假单胞菌Am607(Pseudomonas aeruginosa Am607)的传代稳定性良好。
实施例2
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在35℃条件下培养30h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在23℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为140g/L。
实施例3
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 25℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为160g/L。
实施例4
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 35℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为148g/L。
实施例5
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 37℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为140g/L。
实施例6
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在35℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.7，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在 35℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为146g/L。
实施例7
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在35℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.7，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 25℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为158g/L。
实施例8
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为60g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 25℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入60g底物，发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为31g/L。
实施例9
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为800g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 25℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为165g/L。
实施例10
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠1g/L、酵母抽提物5g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钙 3g/L、硫酸镁2g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌20 分钟。在25 ℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为155g/L。
实施例11
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠10g/L、酵母抽提物1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.1g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在 25℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为148g/L。
实施例12
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在42℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在42 ℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为124g/L。
实施例13
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5.5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在 42℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为127g/L。
实施例14
取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在42℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了5，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌 20分钟。在25 ℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为154g/L。
综上实施例2-14可知，本发明菌株能在较宽的温度范围产下鼠李糖脂，其产量在接近 25度温度表现异常优异，见图4所示。
对比例1
取已有的铜绿假单胞菌株1支(保藏号CGMCC NO:1.10452)甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了6，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为60g葵 花籽油，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在25℃、0.1-1vvm、 400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入60g底物，发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为8g/L。
对比例2
生产菌相同于对比例1，也选择已有的铜绿假单胞菌株，其保藏号CGMCC NO:1.10452。
取1支BNCC139674甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在35℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了7，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾 2g/L、氯化钙1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为60g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入60g 底物，发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为14g/L。
对比例3
生产菌相同于对比例1，也选择已有的铜绿假单胞菌株，其保藏号CGMCC NO:1.10452。
取1支BNCC139674甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了6，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠1g/L、酵母抽提物5g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾 1g/L、氯化钙3g/L、硫酸镁2g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在 121℃灭菌20分钟。在25℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为20g/L。
对比例4
生产菌相同于对比例1，也选择已有的铜绿假单胞菌株，其保藏号CGMCC NO:1.10452。取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在35℃条件下培养36h，测得种子液的OD600达到了7，将3％种子液接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基包括：硝酸钠5g/L、酵母抽提物3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 1g/L、硫酸镁0.5g/L。发酵培养基中所加底物为640g葵花籽油，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在35 ℃、0.1-1vvm、400rpm、0.05mpa条件下发酵，起始加入80g底物，从48h 后每隔24h加入60g底物。发酵结束后，测定发酵液中的鼠李糖脂含量为26g/L。
铜绿假单胞菌株CGMCC NO:1.10452作为一种典型的产鼠李糖脂模式菌株，维持该铜绿假单胞菌较高的最佳发酵温度30℃～37℃。由对比例1-4可知，虽在接近25度温度下还尚能产鼠李糖脂，但其产量表现不佳。
以上各个实施例及对比例中所使用的发酵液中鼠李糖脂含量的测定方法：
发酵液中鼠李糖脂表面活性剂的比色法检测含量：
标准品溶液的配置：称取干燥恒重的鼠李糖标品，用去离子水溶解，定容于容量瓶，配置成终浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的标准品溶液。
蒽酮试剂的制备：取蒽酮0.20g溶于100mL 85％的硫酸中。
检测方法：精确取标准品或发酵液1mL置于试管中，于冰水浴中加入0.2％的硫酸—蒽酮试剂4mL，加完后混合均匀浸入沸水浴中，15min后取出，用自来水冷却，室温放置20min,于620nm处测吸光值。标准品的空白用水代替鼠李糖标准品，发酵液的空白以未接种的发酵培养基代替发酵液。
1).绘制标准曲线：如图1所示。
以鼠李糖浓度为纵坐标y，吸光度为横坐标x做回归处理，得回归方程 y＝137.53x+7.8193，相关系数R＝0.9995。鼠李糖浓度在20-100mg/L时与吸光度呈现良好的线性关系。
2).发酵液中生物表面活性剂检测：
精确取标准品或发酵液1mL置于试管中，于冰水浴中加入0.2％的硫酸—蒽酮试剂4mL，加完后混合均匀浸入沸水浴中，15min后取出，用自来水冷却，室温放置20min,于620nm处测吸光值。发酵液的空白以未接种的发酵培养基代替发酵液。
鼠李糖脂产量g/L＝(137.53*A+7.8193)*3*n/1000
A:吸光度；n：样品稀释倍数。

Claims (5)

1.铜绿假单胞菌株，其特征在于，该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Am607，保藏编号为CCTCC NO:M 2020269。
2.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌株的用途，其特征在于，为用于生产鼠李糖脂。
3.一种铜绿假单胞菌株生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)菌种活化；
培养1～2天；
b)利用种子培养基制备种子液；
在23-42℃培养，培养时间20～48h，测得种子液的OD600在5～6时，接种到装有发酵培养基的发酵罐中；种子培养基包括：酵母粉1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，NaCl 5-10g/L；
c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵，通过铜绿假单胞菌株Am607在23-42℃的发酵温度发酵生产鼠李糖脂；发酵液中的底物浓度30-400g/L，调节pH至7.2；所述发酵培养基包括：
Figure FDA0003614625690000011
4.如权利要求3所述的铜绿假单胞菌株生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述发酵温度为24℃-26℃。
5.如权利要求4所述的铜绿假单胞菌株生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述发酵温度为25℃。
CN202010924375.2A 2020-09-04 2020-09-04 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法 Active CN112126598B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010924375.2A CN112126598B (zh) 2020-09-04 2020-09-04 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010924375.2A CN112126598B (zh) 2020-09-04 2020-09-04 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112126598A CN112126598A (zh) 2020-12-25
CN112126598B true CN112126598B (zh) 2022-08-05

Family

ID=73848052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010924375.2A Active CN112126598B (zh) 2020-09-04 2020-09-04 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112126598B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116890028A (zh) * 2023-07-27 2023-10-17 东北农业大学 一种稻蟹共作-微生物耦合及其修复稻田多环芳烃机制的分析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4933281A (en) * 1987-03-17 1990-06-12 The University Of Iowa Research Foundation Method for producing rhamnose
CN106987545A (zh) * 2017-05-23 2017-07-28 南京工业大学 一株鼠李糖脂高产菌及其应用
CN107557324A (zh) * 2017-10-26 2018-01-09 南京工业大学 一株铜绿假单胞菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4933281A (en) * 1987-03-17 1990-06-12 The University Of Iowa Research Foundation Method for producing rhamnose
CN106987545A (zh) * 2017-05-23 2017-07-28 南京工业大学 一株鼠李糖脂高产菌及其应用
CN107557324A (zh) * 2017-10-26 2018-01-09 南京工业大学 一株铜绿假单胞菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Karen Stefany Conceição 等.Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa grown on membranes of bacterial cellulose supplemented with corn bran water extract.《Environmental Science and Pollution Research》.2020, *
一株铜绿假单胞菌的筛选鉴定及其产鼠李糖脂条件的优化;杨佐毅 等;《环境污染与防治》;20180215;第128-132页，参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112126598A (zh) 2020-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101665778B (zh) 黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用
CN101165168B (zh) 一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法
CN105861401B (zh) 一株黄单胞菌nyw79及其用途
CN104195080A (zh) 一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用
CN1986822A (zh) 用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法
CN105506048B (zh) 一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法
CN103589765A (zh) 制备鼠李糖脂发酵液的方法
CN105018544B (zh) 具有促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖及其制法和应用
US20210340583A1 (en) Schizochytrium strain and use thereof, microbial oil containing dha at sn-2 position and preparation and use thereof
CN104130952A (zh) 一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用
CN105145676B (zh) 藻华抑制剂
CN102864188A (zh) 一种木质纤维素生产生物柴油的方法
CN105132331A (zh) 一株葡糖醋杆菌及其应用
CN111286476B (zh) 一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用
CN112126598B (zh) 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法
CN103540540B (zh) 一种海带降解菌及其制备海带汁的方法
CN106167785B (zh) 一种粪肠球菌菌株及其应用
CN104651284A (zh) 鞘氨醇单胞菌T-3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法
CN105505830B (zh) 一株产生物表面活性剂的不动杆菌株及其应用
CN105217801B (zh) 环保酵素在防治湖泊藻类水华危害方面的应用
CN101173238A (zh) 一种工业化生产鼠李糖脂发酵液的培养基配方
CN103695332B (zh) 一种柴油污染型场地微生物降解菌
US6017740A (en) Process for the production of bacterial cellulose
CN105661393A (zh) 一种生物法快速发酵蔬菜的生产方法
CN104531580A (zh) 一种高性能文莱胶菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant