KR100398088B1 - ｐＨ조절하에서 교반 및 통기 영향에 의한 영지의액체배양을 이용한 세포외 다당의 대량 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pH 조절하에서 교반 및 통기 영향에 의한 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당의 대량 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2단계로 pH를 조절하는 자 발효조(jar fermenter) 시스템에서 영지의 액체배양 시 교반 및 통기조건의 조작변수를 조절함으로써 효율적으로 균사체와 세포외 다당을 생산하며, 아울러 영지 액체배양의 동력학적 특성 및 산소이동용량계수(kla)와 이들 조작 변수와의 상관관계를 해석하고, 스케일 업(scale-up)의 조건을 검토 확립하여 영지의 세포외 다당을 대량으로 생산하는 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당 생산방법에 관한 것이다.

Description

ｐＨ 조절하에서 교반 및 통기 영향에 의한 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당의 대량 생산방법{Mass production of exo-polysaccharide from submerged cultivation of Ganoderma lucidum by agitation and aeration effect under bi-staged pH controlling system of jar fermenter}
본 발명은 pH 조절하에서 교반 및 통기 영향에 의한 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당의 대량 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2단계로 pH를 조절하는 자 발효조(jar fermenter) 시스템에서 영지의 액체배양 시 교반 및 통기조건의 조작변수를 조절함으로써 효율적으로 균사체와 세포외 다당을 생산하며, 아울러 영지 액체배양의 동력학적 특성 및 산소이동용량계수(kla)와 이들 조작 변수와의 상관관계를 해석하고, 스케일 업(scale-up)의 조건을 검토 확립하여 영지의 세포외 다당을 대량으로 생산하는 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당 생산방법에관한 것이다.
영지버섯(Ganoderma lucidum)은 다공균과 불로초속(Ganoderma sp.)에 속하는 담자균의 한 종으로, 그 자실체는 영지라 하여 옛부터 식용이나 한방 및 민간 생약의 우수 상품약으로서 널리 사용되어 왔다.
최근에 와서는 영지버섯 생리활성의 주성분인β-glucan이 항균, 항바이러스, 콜레스테롤 저하, 혈압강하, 항혈전, 인터페론 유도, 면역증강 및 항종양 작용 등의 각종 약리작용을 갖는 것으로 밝혀져 산업적인 관심이 고조되고 있다. 특히, 영지버섯의 다당류는 제암제로서의 개발이 기대되는 등, 최근에 와서 점차 각종 기능성 식품소재 및 의약품 소재로의 잠재적 가능성도 매우 높은 것으로 인식되고 있다.
또한 항상 일정한 조건에서 배양이 가능하고, 품질이 균일한 균사체를 고효율 및 대량으로 얻을 수 있으며, 또 낮은 비용으로 생산할 수 있는 액체배양법이 연구되어 왔다. 특히 낮은 세포외 다당류(항암활성β-1,3-glucan)의 생산성을 수배-수십배에 향상시켰다. 그러나 아직은 산업적 생산체제를 갖추기에 미흡한 실정으로 대량생산 공정 개발을 위한 검토의 필요성이 높은 실정이다.
대부분의 균류들은 진탕배양 시 펠렛(pellet) 또는 필라멘트(filament) 균사를 형성하며, 특히 담자균류들은 다양한 크기의 균사응집체를 형성한다. 상기 균사응집체로 인하여 벽면 생육(wall growth)이 발생하며, 이로 인해 교반 및 통기에 의한 물질전달이 어려워져 균사 생육 및 생성물의 생산도 저해된다. 그 동안 상기 문제점으로 인해 에어-리프트 발효조(air-lift fermenter)가 일부 사용하여 왔으나, 현재 산업적인 생산을 위한 대규모 에어-리프트 발효조의 이용은 미흡한 실정이다. 따라서 자 발효조에서의 배양이 불가피한데, 이 때 벽면 생육의 방지수단이 강구되어야 한다.
한편, 담자균류로부터 세포외 다당 생산을 위한 액체배양공정의 합리적 설계나 조작을 위해서는 세포외 다당류의 발효 중 균체, 기질, 통기, 교반속도 및 다당류 농도의 경시적 분포에 대한 발효동력학적 특성의 분석하기 위한 수학적 모델이 필요하다. 지금까지 단세포 미생물에서 주로 이용된 모나드(Monod) 식은 펠렛을 형성하는 균류와 같은 다세포 미생물에서는 잘 적용되지 않는다. 따라서 균류의 생육속도가 균체량의 2/3승에 비례한다는 2/3 파워(two-thirds power)모델이 가정되었으나, 담자균류인 폴리포러스 베르시컬러(Polyporus versicolor)와 느타리 버섯의 생육을 2/3 파워 모델로 해석한 캐로드와 윌크[Carroad, P. A. and Wilke, C. R., Appl. Environ. Microbiol.,33(4), 871-873(1977)]의 결과는 다소 미흡하였다. 그러므로 펠렛 형성 균류에서의 다당 발효동력학의 해석을 보다 유용하게 분석하기 위하여 웨이스와 올리스[Weiss, R. M. and Ollis, D. F., Extracellular Microbial Polysaccharides.Ⅰ. Biotechnol. Bioeng.,22, 859-873(1980)]는 미생물 균체, 다당 생산 및 기질 소비에 대한 발효과정을 설명하기 위한 동력학적 모델로서 각각 로지스틱(logistic) 모델, 뤠데킹-피렛(Luedeking-Piret) 모델 및 모디파이드 뤠데킹-피렛(modified Luedeking-Piret) 모델을 이용하였으며. 이 모델에서는 모델 변수를 용이하게 순차적으로 산출할 수 있다[Luedeking, R., and Piret, E. L., J. Biochem. Microbiol. Tech. Eng.,1,393-412(1959); Ollis, D. F., Ann. N.Y. Acad. Sci.,413, 144(1983)].
한편, 교반탱크 반응기(stirred-tank reactor)를 이용한 대량생산 공정 개발을 위해서는 연속적이고 효율적인 산소의 공급이 필요하며, 이를 위해서는 교반 및 통기에 의한 물질전달이 중요하다. 또한, 산업적 생산을 위한 스케일 업(scale-up)의 연구가 필요한데, 주로 산소이동용량계수(kla)에 기준한 스케일 업의 방법이 널리 이용되고 있다.
이에, 본 발명에서는 2단계 pH 조절하에서 교반 및 통기속도에 따른 영지의 액체배양에 의한 균사체 및 세포외 다당 생산의 최적 조건을 확립하기 위하여 균사체 형태 분석 및 동력학적 특성을 조사하였다. 아울러, 2.6L, 20L 및 75L 자 발효조 시스템에서의 배양을 통하여 산소이동용량계수(kla)와 이에 따른 조작변수와의 통기 및 교반속도 등의 상관관계를 조사하여 스케일 업의 자료를 확립하였으며, 이로부터 영지의 액체배양에 의한 균사체 및 세포외 다당 생산의 산업적 응용 자료를 마련하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 2단계로 pH를 조절하는 자 발효조(jar fermenter) 시스템에서 영지의 액체배양 시 효율적인 균사체와 세포외 다당 생산을 위한 통기 및 교반의 효과를 알아보고, 이들 통기 및 교반의 조작 변수와 배양 동력학적 특성 및 산소이동용량계수(kla)와의 상관관계를 해석하여 스케일 업(scale-up)의 조건을 검토 확립함으로써 교반 및 통기에 의한 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당의 대량 생산방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
도 1은 pH 조절하에서 0.1% 폴리아크릴산 첨가유무에 따른 영지의 건조균체중량(MDW)과 세포외 다당체(EPS)의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 다른 pH 조절하에서 0.1% 폴리아크릴산 첨가구와 무첨가구로 배양된 영지의 균사 형태를 나타낸 것이다.
도 3은 2단계 pH 조절 조건(배양 6시간 후 pH를 3에서 6으로 조절)의 경우, 2.6 L 자 발효조에서 영지의 건조균체중량(MDW), 세포외 다당(EPS) 및 잔존당에 따른 교반속도를 나타낸 것이다.
도 4는 2단계 pH 조절 조건의 경우, 2.6 L 자 발효조에서 영지의 건조균체중량(MDW), 세포외 다당(EPS) 및 잔존당에 따른 통기속도를 나타낸 것이다.
도 5는 2단계 pH 조절 조건의 경우, 2.6 L 자 발효조에서 교반과 통기속도에 따른 영지의 거칠기 정도(roughness)를 나타낸 것이다.
도 6은 2단계 pH 조절 조건의 경우, 2.6 L 자 발효조에서 교반과 통기속도에따른 영지의 펠렛 크기를 나타낸 것이다.
도 7은 20 L 자 발효조에서 교반과 통기속도에 따른 영지의 용존 산소량을 나타낸 것이다.
도 8은 2.6 L, 20 L 및 75 L 자 발효조에서 통기 및 교반속도에 따른 산소이동용량계수(kla)값의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 산소이동용량계수(kla)와 N3×Di2와의 관계를 나타낸 것이다.
도 10은 2.6 L 발효조에서의 최적조건인 400rpm 및 1 vvm에서 배양 경과에 따른 균사 형태의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 2단계 pH 조절하의 자 발효조(jar fermenter) 시스템에서 영지의 액체배양 시 교반 및 통기속도에 따른 동력학적 특성과 산소이동용량계수(kla)값을 해석함으로써 스케일 업(scale-up)의 조건을 확립하여 세포외 다당 생산을 최대화시키는 것을 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 2단계로 pH를 조절하는 자 발효조(jar fermenter) 시스템에서 영지의 액체배양 시 교반 및 통기조건의 조작변수를 조절함으로써 효율적으로 균사체와 세포외 다당을 생산하며, 아울러 영지 액체배양의 동력학적 특성 및 산소이동용량계수(kla)와 이들 조작 변수와의 상관관계를 해석하고, 스케일 업(scale-up)의 조건을 검토 확립하여 영지의 세포외 다당을 대량으로 생산하는 영지의 액체배양을 이용한 세포외 다당 생산방법에 관한 것이다. 상기에서 언급한 2단계로 pH를 조절하는 것은 강산성(일반적으로 pH 3 ∼ 4) 조건에서 6 ∼ 48 시간 배양한 후 약산성(일반적으로 pH 5 ∼ 6) 조건에서 배양함을 의미한다.본 발명에서는 벽면 생육의 방지수단으로 비교적 뛰어난 폴리아크릴산과 소디움 폴리아크릴레이트을 선택하여 플라스크 배양을 수행한 결과, 0.1% 폴리아크릴산 첨가구에서 균체량 및 다당 생성이 가장 우수하였다. 자 발효조에서 회분배양 시 0.1% 폴리아크릴산의 첨가구와 무첨가구를 비교한 결과, 0.1% 폴리아크릴산 첨가구는 무첨가구에 비해 현저하게 벽면 생육을 방지하였다.
특히, 본 발명에서 다당 생성량에 미치는 통기 및 교반의 효과를 조사한 결과, 일정 통기속도(1 vvm)하에서 교반속도(100 ∼ 600 rpm)를 달리한 경우는 400 rpm에서 다당의 최대값(15.43 g/L)을 얻었으며, 일정 교반속도(400 rpm)에서 통기속도(0.5 ∼ 2.0 vvm)를 달리하면 1 vvm에서 최대값(15.54 g/L)을 얻게 된다.
일반적으로 균류는 액상배지에서 생육하는 경우, 필라멘트 형태, 펠렛 형태 및 이들의 혼합형으로 존재한다. 이러한 균사 형태는 유체의 특성, 물질전달, 영양분의 소비, 배지의 교반 및 발효열의 제거 등에 영향을 미치는데, 균사 형태에영향을 미치는 요인으로는 전단응력, 접종원의 농도, 배지의 구성성분, pH 및 용존산소의 농도 등이 있다. 균류를 산업적으로 이용할 때 요구되는 형태는 균에 따라 다르나 리조퍼스 아르히저스(Rhizopus arrhizus)를 이용한 푸마르산의 생산, 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger)를 이용한 효소의 생산 및 페니실리엄 크라이소게넘(Penicillium chrysogenum)을 이용한 항생제의 생산 시는 펠렛 형태보다 필라멘트 형태에서의 생산성이 더 높은 것으로 알려지고 있다. 즉, 균사 형태는 발효산물과 밀접한 관련을 가지는 것으로 볼 수 있으며, 결국 균사 형태를 조절함으로써 발효 생산성을 향상시킬 수 있음을 예측할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 발효생산성을 향상시킬 수 있는 균사 형태를 규명하고, 이를 얻기 위한 최적의 통기 및 교반속도 조건을 확립하여 생산성을 높이고 자 하였다. 즉, 균사 형태에 미치는 통기 및 교반의 효과를 조사한 결과, 교반 및 통기속도의 증가에 의해 균사 형태는 표면이 거친(rough) 펠렛 형태로부터 매끄러운(smooth) 펠렛의 형태로 변화하고, 거칠기 정도(roughness)에 의하여 정량화가 가능하였다. 본 발명에서 교반속도가 100 rpm인 경우, 거칠기 정도는 60%이상이나 500 rpm에서는 20%이하로 교반속도의 증가로 거칠기 정도가 감소하고, 실험한 통기속도 범위에서 거칠기 정도는 20%이하로 통기속도의 증가에 따라서도 감소하는 경향을 보인다.
한편, 균사 크기는 100 ∼ 200 rpm에서는 증가하고, 300 ∼ 500 rpm에서는 다시 감소하여 0.3 ∼ 0.5 mm의 일정크기를 유지한다. 그러나, 통기속도는 균사 크기에 큰 영향을 주지 않고 0.3 ∼ 0.55 mm 범위이다. 대체로 다당 생성은거칠기 정도 및 균사 크기와 유의적인 상관관계를 보이고, 대체로 거칠기 정도가 약 17% 및 0.3 ∼ 0.5 mm의 균사 크기를 유지할 때 다당 생산성이 높음을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 교반 및 통기에 의한 용존산소의 농도변화를 살펴본 결과, pH가 조절되지 않는 조건에서는 배양 7일 후 용존산소가 제한되지만, 2단계 pH 조절(강산성 조건에서 일정시간 배양 후 약산성 조건으로 조절)에서는 배양 2 ∼ 4일에 용존산소의 급격한 감소를 보이나 용존산소의 제한은 일어나지 않고, 다시 증가하는 경향을 보이며, 교반속도가 증가할수록 감소 폭과 깊이는 증가하는 경향을 볼 수 있다. 다당 생성은 대수증식기 이후의 용존산소 농도가 40 ∼ 80% 일 때 가장 높으며, 이 보다 낮거나 높은 경우는 다당 생성은 저해된다.
그리고, 본 발명에서 영지의 세포외 다당 발효 중 동력학적 특성을 교반 및 통기에 의한 함수로서 조사한 결과, 영지의 균사체 증식은 로지스틱 모델과 잘 일치하고, 다당 생산 및 기질 소비는 뤠데킹-피렛 및 모디파이드 뤠데킹-피렛 모델로 잘 설명된다. 교반 및 통기속도의 따른 다당 생산은 증식연동형과 비증식 연동형이 함께 존재하는 혼합형의 발효양식이며, 기질은 증식 연동형으로 소비된다.
따라서, 본 발명은 이상에서 설명한 결과에 따라 교반 및 통기에 따른 산소이동용량계수(kla)와의 관계를 중회귀분석하면, 이들 사이의 관계는 다음 수학식 1로 표현할 수 있다.
kla = 0.555 × Vs0.423 20.332
kla : 산소이동용량계수
Vs : 통기속도
N : 교반속도
Di : 임펠러(impeller) 지름
또한, 본 발명에서는 영지 액체배양 시 자 발효조 시스템에서의 스케일 업 조건을 확립한 바, 2.6-L, 20-L 및 75-L 발효조를 이용하여 최대의 다당 생산을 할 수 있으며, 이에 따른 산소이동용량계수(kla)의 범위는 85.4 ±26.70 h-1이었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 전배양
본 발명에 사용한 균주는 영지(Ganoderma lucidum)ASI 7004이다. P.D.A.(potato dextrose agar) 평판배지에서 30 ℃로 7 일간 배양한 후 4 ℃에서 보존하였고, 3개월마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
종균배양에 사용한 배지는 가노데르마 마플라나텀(Ganoderma applanatum)에 대해 보고된 진탕배양용 배지이며, 본 배양의 배지는 영지의 액체배양에 의한 세포외 다당 생산의 최적배지[포도당 50 g/ℓ, 효모추출액 5 g/ℓ, KH2PO40.5 g/ℓ, (NH4)2HPO41 g/ℓ, pH 6]를 사용하였다. 배지는 121 ℃에서 15 분간 가압 살균 후 사용하고, 살균 시 염의 침전을 방지하기 위하여 탄소원, 질소원, 무기염류는 각각 분리 살균한 후 혼합하여 사용하였다. pH는 필요시 1N NaOH 또는 1N HCl로 조절하였다.
P.D.A. 평판배지에서 생육한 균사체를 직경 5 mm의 스테인레스 스틸 파이프(stainless steel pipe)로 균사 디스크(mycelium disk)를 만든 다음, 상기 디스크 4 ∼ 5개를 50 ㎖의 배지가 첨가된 250 ㎖ 삼각 플라스크에 접종하였다. 30 ℃에서 7 일간 배양한 다음, 다시 종균용 배지 50 ㎖를 함유한 250 ㎖의 삼각 플라스크에 5%(v/v)의 전배양액을 접종하고, 30 ℃에서 100 rpm으로 5 일간 진탕배양하였다. 이때 전배양액은 균질기[동양(주), model 0820]로 30초 동안 균질화시켜 본 배양의 접종용으로 사용하고, 매 실험마다 새로이 배양하여 사용하였다.
제조예 2: 발효조 배양
균사체 생육으로 인한 월 성장을 방지하기 위하여 중합체인 폴리아크릴산[와코 케미칼 사]을 0.1%(w/v) 첨가하여 균사 생육, 형태변화 및 세포외 다당 생성량의 변화를 조사하였다.
2.6 L의 자 발효조(Marubishi, MD-250)에서 전배양액을 5%(v/v)로 접종하여 온도 30 ℃, 3가지의 pH 조건(초기 pH 6.0, 일정 pH 6.0 및 배양 6 시간 후 pH를 3에서 6으로 조정), 배지액량 1.5 L, 통기속도 0.5 ∼ 2.0 vvm 및 교반속도 100 ∼ 600 rpm의 배양 조건으로 실시하였다. pH는 필요시 1N HCl 또는 1N NaOH를 사용하여 조절하였고, 통기로 인하여 발생한 거품은 안티폼 289[시그마 사]를 사용하여 제거하였다.
20 L의 자 발효조(Bioengineering, L1523)로 접종비를 5%(v/v)로 하여 온도 30 ℃, pH(초기 pH 6.0 또는 pH shift)의 조건, 배지액량 12 L, 통기속도 1.0 vvm 및 교반속도 200 ∼ 600 rpm의 배양 조건으로 실시하였다.
75 L의 자 발효조(Bioengineering, LP351)를 사용하여 전배양액을 5%(v/v)로 접종하여, 온도 30 ℃, pH(pH shift) 조건, 배지액량 50 L, 통기속도 0.3 ∼ 1.0 vvm 및 교반속도 100 ∼ 300 rpm의 배양 조건에서 실시하였다.
실시예1. 균사체, 다당 생성과 균사 형태에 미치는 폴리아크릴산의 첨가 영향
균체량은 원심분리[10,000×g, 15 분]하고 침전된 균사체를 여과지[No. 2, 와트만]로 여과한 다음, 증류수로 2 ∼ 3회에 걸쳐 수세하였고, 70 ℃에서 24 시간 건조한 후, 건조장치에서 항량이 될 때까지 방치하면서 건조중량(mycelial dry weight, MDW)을 측정하여 정량하였다.
또한, 세포외 다당은 원심분리[10,000×g, 15 분]하여 균사체를 제거한 후 얻어진 배양 여액에 2배량의 아세톤을 가하여 침전물로 얻었으며, 이를 70℃에서 24 시간 건조한 다음 중량을 측정하여 조다당(crude exo-polysaccharide, EPS)로 정량하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, 초기 pH 6일 때 폴리아크릴산 무첨가구의 균체량은 배양 4일 후 거의 일정하나, 첨가구는 배양말기까지 계속 증가하여 균체량 5.84 g/L의 최대값을 얻었다. 또한 pH 조절 조건에서는 균체량이 다소 감소하지만 폴리아크릴산 첨가구가 무첨가구보다 다소 높은 균체량을 나타내어 폴리아크릴산의 첨가는 pH의 변화에 영향을 받지 않음을 알 수 있었다. 또한 다당 생성도 폴리아크릴산을 첨가한 경우에 약 1.1 ∼ 1.3배의 다소 높은 값을 나타내어 보다 좋은 효과(positive effect)를 나타내고, pH의 변화에도 영향을 받지 않으며, 자료로는 나타내지 않았지만 기질의 소비에서도 다소 높거나 비슷한 결과를 나타내었다.
폴리아크릴산의 첨가시 균사 형태의 변화를 조사한 결과, 폴리아크릴산첨가구는 무첨가구와 큰 차이를 보이지 않으며, 단지 pH 변화의 차이만을 보였다. 2단계 pH로 배양한 경우에는 pH가 조절되지 않는 조건이 pH 조절 조건보다 더 많은 양의 다당을 생성하였다. 특히, 영지의 경우는 폴리아크릴산 첨가로 거의 형태 변화를 보이지 않는 특징을 나타내었다.(도 2)
따라서 폴리아크릴산의 첨가는 월 성장의 방지수단으로 사용하며, 대수기를 연장시켜 균체량 및 다당 생성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 균사체 및 다당 생성에 미치는 교반 및 통기속도의 영향
2.6 L 발효조에서 교반속도에 따른 균사 및 다당 생성에 미치는 영향을 조사한 결과는 도 3과 같다. 통기량을 1 vvm으로 고정한 후 교반속도에 따른 균사체 생육은 100 ∼ 400 rpm까지는 교반속도의 증가에 따라 증가하다 배양 4 일 후감소하였다. 그러나, 500 ∼ 600 rpm에서는 계속 증가하고, 500 rpm에서 4.35 g/L의 최대 균체량을 얻었다. 반면, 다당 생산은 100 ∼ 400 rpm까지는 교반속도가 증가할수록 증가하며, 400 rpm에서 15.43 g/L의 최대값을 얻었다. 그러나 높은 교반속도인 500 ∼ 600 rpm에서는 다당 생성이 오히려 감소하며, 600 rpm에서는 최대 다당 생산량이 6.81 g/L로 가장 낮았다.
그러므로 높은 교반속도는 균체 생육에는 좋으나 다당 생성을 저해하는 것으로 생각된다. 이로부터 다당 생성의 최적 교반 조건은 400 rpm으로 선정하였다.
교반속도를 400 rpm으로 고정한 후 통기속도의 변화에 따른 균사 생육 및 다당 생성을 조사하여 도 4에 나타내었다. 통기속도가 0.5 vvm에서 2.0 vvm으로 증가할수록 균체량은 증가하며, 0.5 vvm에서 1.5 vvm까지는 균사체량이 4 일 후 급격히 감소하고, 2.0 vvm에서는 6일째 최대의 균체량인 4.95 g/L를 얻으며, 배양말기에도 유지되었다.
교반속도와 마찬가지로 높은 통기속도인 2.0 vvm에서는 균체량의 증가를 보이나 다당 생성은 감소하였다. 즉, 세포외 다당 생성은 균사체의 경우와는 달리 1 vvm에서 최대값 15.54 g/L를 얻으며, 통기속도가 낮은 0.5 vvm과 높은 2.0 vvm에서는 이 보다 다소 낮은 값이 얻어졌다.
따라서, 세포외 다당 생성에 최적인 통기조건은 400 rpm에서 1 vvm인 것으로 판단하였다.
실시예 3. 기질 소비에 미치는 교반 및 통기 효과
배양액중의 잔존당의 농도는 DNS(dinitrosalicylic acid) 법을 이용하여 575 nm에서 흡광도를 구한 후, 각각 표준곡선으로부터 환산하여 구하였다.
교반에 의한 기질 소비를 보면(도 3), 500 rpm의 경우는 배양 후 32 g/L, 그리고 600 rpm에서는 15 g/L이 소비되었다. 반면, 100 ∼ 400 rpm일 때의 기질의 소비는 500 rpm과 600 rpm의 중간값 범위이었다. 다당 생성이 다소 높았던 300 및 400 rpm에서의 기질 소비량은 약 25 ∼ 27 g/L로, 교반속도가 높은 500 rpm이상에서는 기질이 균체의 증식에 이용되는 반면, 100 ∼ 400 rpm에서는 다당 생성에 이용되는 것으로 생각되었다.
한편, 통기에 의한 기질 소비는 큰 차이를 보이지 않으나(도 4), 높은 통기속도일 때는 균체량이 높고, 이때 기질 소비도 28 g/L로 다소 높았다.
기질 소비에 대한 교반 및 통기의 효과는 비슷하지만, 통기속도보다는 교반속도에 의한 기질의 변화가 더 큰 것으로 나타나며, 이는 통기보다는 교반에 의한 물질전달의 효과가 더 크기 때문이라고 생각되었다. 또한 잔존 기질량은 약 20 g/L이상으로 매우 높아 과잉의 탄소원 기질하에서 다당 생산이 이루어지는 것으로 생각되었다.
실시예 4. 균사 형태에 미치는 교반 및 통기속도의 영향
균사체 형태는 화상 분석 시스템[Optimas 사, 미국]으로 분석하였다. 즉, CCD 카메라[Panasonic, wv-CP410] 또는 현미경[Olympus, CHS-213E], PCI 비디오 프레임 그래버[Flashpoint Ver. 3.11, Integral Tech, Inc] 및 PC로 구성되고, 구성된 장치를 사용하여 이미지 소프트웨어[Optimas 6.1, Optimas 사]로 분석하였다. 이미지 소프트웨어를 이용하여 면적, 길이, 직경 등 각종 형태변수를 구하였으며, 거칠기 정도는 펠렛 면적을 이용하여 다음 수학식 2로부터 계산하였다.
거칠기 정도(%) = (전체 펠렛면적 - 코어 펠렛면적) / 전체 펠렛면적 ×100
교반 및 통기속도에 따른 균사 형태는 표면이 거친 펠렛으로부터 매끄러운 펠렛 형태로 변하므로 균사 형태의 정량화 지표로서 균사의 거칠기 정도와 코어(core) 크기를 조사하여 이들의 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
비교적 낮은 교반속도인 100 ∼ 200 rpm에서는 거칠기 정도가 크며, 배양 경과 시 증가하다 6 일 후 다소 감소하였다. 반면, 교반속도가 300 rpm일 때는 배양 5 일 후 감소하고 400 및 500 rpm에서는 각각 배양 4 일과 3 일 후 감소하였다. 거칠기 정도는 낮은 100 rpm에서 최대로 60%이상이며, 높은 500 rpm에서는 20%이하로 낮았다. 통기속도가 0.5 vvm ∼ 2.0 vvm으로 증가할수록 거칠기 정도도 감소하며 대체로 20%이하였다.
따라서, 펠렛 형태의 변화는 교반속도가 통기속도에 비해 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 100 ∼ 500 rpm으로 교반속도가 증가함에 따라 펠렛의 거칠기 정도는 감소하였다. 하지만 교반속도가 600 rpm이상에서는 메카니칼 작용에 의한 전단효과(shear effect)로 균사 형태는 필라멘트 형태를 나타내었다.
또한, 균사 크기는 100 rpm에서 0.38 ∼ 0.51mm, 200 rpm에서 0.62 ∼ 0.88 mm로 교반속도의 증가에 따라 증가하고, 300 ∼ 500 rpm에서는 0.3 ∼ 0.5 mm정도로 일정하였다. 반면, 낮은 통기속도인 0.5 vvm에서는 균사 크기가 0.5 ∼ 0.66 mm 정도이며, 1.0 ∼ 2.0 vvm에서는 0.3 ∼ 0.55 mm 정도로 일정하였다.
따라서, 교반 및 통기속도에 따른 다당 생성과 비교해 볼 때 펠렛 형태는 다소 거친 형태로, 크기는 0.3 ∼ 0.5 mm 정도로 유지할 때 높은 다당 생성을 보임을 알 수 있었다. 결국, 균사 형태는 다당 생성과 밀접한 상관성을 갖는 매우 중요한 인자임이 확인되며, 적정의 통기 및 교반 조건의 최적화가 필요함을 알 수 있었다.
실시예 5. 용존 산소에 미치는 교반 및 통기속도의 영향
교반 및 통기에 따른 용존 산소의 변화는 도 7에 나타내었다. 2단계 pH 조절에서 교반속도가 200 ∼ 600 rpm으로 증가함에 따라 용존 산소농도도 증가하였다. 200 rpm에서 배양 2 ∼ 3 일 후의 용존 산소농도는 10%정도로 떨어졌고, 3 일 후 증가하기 시작하여 5 일째 최고 75%를 나타내었다. 또 6 일 후에는 다시 감소하고, 배양말기에는 54.8%이었다. 반면, 400 rpm일 때의 용존 산소농도는 배양 4 일째 37.6%까지 감소하고, 5 일째는 72.7%로 증가하여 배양말기까지 계속 유지되었다. 한편, 600 rpm으로 교반속도를 증가시킬 때는 용존 산소농도가 4 일째 78%까지 감소하나, 6 일 후 다시 증가하여 82%수준에서 배양말기까지 유지되었다.
각 교반속도에서 용존 산소 농도가 가장 낮을 때는 균체의 왕성한 생육으로 균체에 대한 산소이동용량계수(kla)값이 낮아지는데, 교반속도가 높아지면 산소이동용량계수(kla)값도 커져 용존 산소가 증가한다고 생각된다. 또한, 배양말기에는 일정수준으로 용존 산소의 농도가 유지되는데, 이는 더 이상의 균체량의 증가가 없기 때문이라고 볼 수 있다.
하지만, pH를 조절하지 않은 조건의 용존 산소농도는 배양 7 일째까지 계속 감소하여 거의 0에 이르고, 배양말기에는 다소 증가하였다. 2단계로 pH를 조절하면, 배양 4 일 후에는 용존 산소농도의 차이가 매우 크게 나타났다. 이는 균체량의 증가와 배양액의 점도가 증가하기 때문인 것으로 보인다. 2단계 pH 조절은 pH를 조절하지 않은 조건에 비해 배양 중의 점도 증가가 거의 없었다.
한편, 용존 산소농도의 변화에 따른 균체량 및 다당 생성을 보면, 2단계 pH 조절은 용존 산소농도가 높을수록 균체량은 증가하지만, 다당 생성은 용존 산소의 농도가 80%이상 일 때 감소함을 보였다. 반면, pH를 조절하지 않은 조건은 균체량은 증가하지만 다당 생성은 감소함을 보였다.
따라서, 영지의 다당 생성에는 충분한 산소의 공급이 필요하며, 용존 산소의 제한이나 높은 농도에서는 다당 생성을 저해하는 것으로 판단되었다.
실시예 6. 교반 및 통기 효과의 배양 동력학적 해석
교반 및 통기속도는 기질 소비, 균체량 및 다당 생산에 큰 영향을 미치므로 이들의 상관관계를 보다 명확히 살펴보기 위해 배양 동력학적 특성을 조사하였다.따라서 담자균류 배양의 동력학적 모델로서 로지스틱 모델, 모나드 모델 및 2/3 파워 모델을 비교하였다.
모나드 모델은 실제자료보다 대수기 중 더 낮은 균체량을 나타내고, 반대로 잔존 기질은 더 낮았다. 배양 6 일 후 기질의 완전소비가 예측되며, 또 더 높은 다당 생성이 예측되어 실험자료를 나타내는 데는 부적합하였다. 2/3 파워 모델도 더 낮은 잔존 기질과 높은 다당 생성이 예측되어 실험결과와는 차이가 있었다. 반면, 로지스틱 모델은 실험자료와 유사하여 본 균주의 동력학적 모델로서 로지스틱 모델이 적합한 것으로 나타났다(R2≥0.95이상). 따라서 이들 모델을 이용하여 기질소비, 균체량 및 다당 생성에 대한 동력학 변수들을 산출하고, 교반 및 통기속도에 따른 이들의 변화를 설명하면 다음과 같다.
비증식 속도는 1.84 ∼ 1.05 day-1로 교반속도의 증가에 따라 감소하였다. 그러나 균체증식 및 다당 생성은 교반속도의 증가에 따라 균체증식은 500 rpm까지, 다당 생성은 400 rpm까지 증가하다 감소하며, 각각 4.35 g/L 및 15.43 g/L를 얻었다. 한편, 생성물인 다당은 교반속도가 500 rpm 까지 증가할수록 생성물의 증식연동형 생성물계수 m값은 증가하고, 600 rpm에서는 다소 감소하였다. 비증식연동형 생성물계수 n값은 교반속도의 증가에 따라 감소하나, 다당의 생성은 증식연동형 및 비증식연동형 기작의 혼합형임을 알 수 있다. 또 기질소비의 경우는 교반속도가 증가할수록 증식연동형 기질소비계수α값은 증가하는 반면, 비증식연동형 기질소비계수β값은 거의 일정하게 유지되었다. 교반속도의 증가에 따른증식연동의 기질소비계수α값은 균체증식과 비슷한 결과를 나타내었다.
따라서, 균체증식에는 증식연동의 기작이, 다당 생성에는 비증식연동의 기작이 큰 영향을 미치는 것으로 생각되었다.
통기속도에 따른 영향을 보면, 최대의 균체량은 4.95 g/L로 2 vvm에서 얻어졌고, 통기속도가 증가할수록 균체의 증식도 증가하였다. 그러나 다당 생성에서는 1 vvm에서 최대량 15.43 g/L를 얻었다. 비증식속도도 교반속도와 마찬가지로 통기속도가 증가할수록 감소하며, 교반속도의 경향과 비슷한 값을 나타내었다. 반면, 교반속도와는 달리 증식연동형 기질소비계수α값은 통기속도의 증가에 따라 증가하고, 비증식연동의 기질소비계수β값은 감소하여, 통기속도가 높을수록 증식연동의 기질 이용성이 양호함을 알 수 있었다. 아울러 증식연동의 생성물 계수 m값은 증가하지만 비증식연동의 생성물 계수 n값은 통기속도의 증가에 따라 감소하였다.
실시예 7. 조작변수와 산소이동용량계수(kla)의 해석
스케일 업의 중요 기준이 되는 산소이동용량계수(kla)값을 2.6, 20 및 75 L 발효조에서 교반 및 통기속도를 달리하여 측정하였으며, 그 결과는 다음 표 1 및 도 8과 같다.
각 발효조에서 통기속도 및 교반속도의 증가에 따라 산소이동용량계수(kla)값도 직선적으로 증가하며, 발효조 용량이 커질수록 산소이동용량계수(kla)값도 커져서 큰 용량일수록 물질전달 효과가 양호한 결과를 나타내었다. 그러나 각 발효조에서 대응하는 통기 및 교반에 대한 산소이동용량계수(kla)값의 직선관계로부터 구한 기울기값은 교반속도의 쪽이 더욱 커서 산소이동용량계수(kla)값은 통기속도의 변화보다는 교반속도의 변화에 더욱 민감함을 알 수 있었다.
이들 관계를 보다 정량적으로 조사하기 위하여 통기속도(Vs), 교반속도(N) 및 임펠러 지름(Di)을 독립변수로 하고, 산소이동용량계수(kla)값을 종속변수로 하여 2차 회귀 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
이들의 상관관계는 다음 수학식 1로 나타낼 수 있었다.
kla = 0.555 × Vs0.42× (N3×Di2)0.33
상기 수학식 1로부터 산소이동용량계수(kla)값은 통기속도보다는 교반 및 임펠러 지름, 즉 임펠러 팁 속도(impeller tip speed)의 영향이 큼을 알 수 있으며, 도 8의 결과와 잘 일치하였다.
실시예 8. 스케일 업에 따른 균사체 및 다당 생성 변화
액체배양에 의한 균류의 발효공정 수행 시 가장 큰 문제점의 하나는 낮은 산소전달이다. 실제로 배양 중에는 균체 생육으로 인하여 산소이동용량계수(kla)값은 감소하기 때문에 2.6 L 발효조에서의 최적 통기 및 교반속도인 400 rpm 및 1 vvm일 때의 산소이동용량계수(kla)를 기준으로 20 L 및 75 L 발효조에 적용하였다.
2.6 L 발효조에서 400 rpm, 1 vvm일 때의 산소이동용량계수(kla)값은 64 h-1이었으며, 이때 균사 생육은 4 일째 최대값 3.66 g/L를 나타내고, 다당은 7 일째 15.43 g/L의 최대값을 나타내었다. 기질 소비는 균체의 증식이 끝난 후에도 계속 감소하므로 다당 생성에 이용되는 것으로 생각된다. 또한, 2.6 L 발효조에서와 비슷한 68.93 h-1의 산소이동용량계수(kla)값을 나타낸 20 L의 200 rpm, 1 vvm 조건에서는 균체량은 4 일째 3.853 g/L로 최대값을, 그리고 다당 생성은 배양 5일째 13.93 g/L로 최대값을 보였다. 배양 5 일 후 더 이상의 균체 증식은 없으며, 기질은 서서히 감소되는 반면, 다당의 분해가 다소 빠르게 진행되는데, 2.6 L 발효조에 비해 균체의 감소량이 거의 없기 때문에 분해된 다당을 기질로 이용하는 것으로 생각된다.
75 L 발효조를 이용하여 각각 67 h-1및 72 h-1의 산소이동용량계수(kla)값을 나타낸 100 rpm, 1.0 vvm과 200 rpm, 0.5 vvm에서의 배양 결과는 다음과 같다. 100 rpm의 경우 균체량은 2 일째 2.89 g/L이고, 다당 생성은 4 일째 14.64 g/L의 최대값을 나타내었다. 반면, 200 rpm의 경우 균체량은 3.75 g/L를 나타나고, 다당 생성량은 5 일째 14.88 g/L이며, 비슷한 산소이동용량계수(kla)값을 가질 때 교반속도는 통기속도에 비해 균체량 및 다당 생성에 더 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
2.6 L 발효조에서 최적 조건일 때의 산소이동용량계수와 비슷한 수준의 값으로 20 L 및 75 L로 스케일 업하였을 때 균체량은 20 L 발효조의 경우는 다소 증가하나, 다당 생성량은 약 1.5 g/L 감소하였다. 반면, 75 L 발효조에서 100 rpm일 때는 균체량이 다소 감소하나 200 rpm일 때는 증가하였다. 또 이 때 다당 생성량은 각각 14.64 및 14.88 g/L로 2.6 L 발효조의 결과에 비해 0.6 ∼ 0.8 g/L 정도 감소하였다. 이것은 통기에 의한 전단의 영향으로 균사 형태가 변하기 때문이라 생각된다.
따라서, 비슷한 산소이동용량계수(kla)값은 발효조 용량에 상관없이 균체량 및 다당 생성량도 서로 비슷한 값을 보여서 스케일 업 조건으로 적당하다고 판단되었다.
다음 표 2는 2.6 L, 20 L 및 75 L의 규모로 스케일 업했을 때, 통기 및 교반에 의한 산소이동용량계수(kla)와 균체량, 다당 생성량과 수율 등의 계수들을 나타낸 결과이다.
산소이동용량계수(kla)값이 64 ∼ 72 h-1일 때 비교적 다당 생성이 우수한 결과를 나타내며, 20 L 발효조의 다소 높은 조건인 400 rpm, 1 vvm 및 75 L 발효조의 300 rpm, 0.3 vvm에서의 산소이동용량계수(kla)값인 124 ∼ 131 h-1에서도 좋은 결과를 나타내었다.
실시예 9. 스케일 업에 따른 균사 형태의 변화
2.6 L 발효조에서의 최적 조건인 400 rpm 및 1 vvm 조건하에서 배양 경과에 따른 균사 형태의 변화를 도 10에 나타내었다. 균사 형태는 전배양과정 중 거친 펠렛 형태를 유지하나 균사 크기는 배양 4 일까지 증가하다가 그 이후 감소하여 비슷한 크기를 유지하였다.
20 L 발효조에서 200 rpm, 1 vvm 조건하의 배양경과에 따른 균사 형태의 변화는 400 rpm, 1 vvm 조건하의 2.6 L 발효조에서와 매우 유사하게 거친 펠렛으로 진행되었다. 그러나 400 rpm, 1 vvm의 통기교반 조건하에서는 배양말기에 표면이 거친 펠렛으로부터 매끄러운 펠렛의 형태로 변하고, 전단의 영향을 받음을 알 수 있었다. 또 75 L 발효조에서도 2.6 및 20 L 발효조의 산소이동용량계수(kla)와 비슷한 값을 나타내는 통기 교반 조건인 100 rpm, 1 vvm 또는 200 rpm, 0.5 vvm에서 균사 형태의 배양 경시변화를 조사하였으며, 그 결과는 2.6 및 20 L 발효조에서와는 달리, 배양 3일 및 5일 후 거친 펠렛의 분열로 매우 작은 펠렛이나 필라멘트를 생성하여 진행되었는데, 100 rpm, 1 vvm의 경우가 200rpm, 0.5 vvm의 경우보다 더 심하였다. 특히, 300 rpm, 0.3 vvm에서의 균사 형태 변화를 설명하면, 교반속도는 높지만 통기속도는 낮은 조건에서 표면이 거친 펠렛 형태를 유지하여 교반보다는 통기에 의한 전단 효과가 거친 펠렛의 분열에 더 큰 영향을 미치는 것으로 판단하였다.
한편, 서로 비슷한 균사 형태의 경시변화를 나타낸 각 발효조에서의 통기 교반 조건에서는 산소이동용량계수(kla)값도 비슷하므로 산소이동용량계수(kla)와 균사 형태가 밀접한 관련을 갖는 것으로 생각되었다. 또한, 이때 다당 생성량도 가장 높으므로 산소이동용량계수(kla)값을 각 발효조에서 비슷하게 하는 조작 조건을 구함으로써 최대의 다당을 생성할 수 있을 것으로 판단되었다. 최대의 다당 생성이 예측되는 산소이동용량계수(kla)값의 범위는 85.4 ±26.70 h-1이었다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 영지의 액체배양 시 pH를 2단계로 조절하면서 통기 및 교반 효과를 알아보고, 이들 통기 및 교반의 조작변수와 동력학적 특성 및 산소이동용량계수(kla)와의 상관관계를 해석하여 스케일 업의 조건을 확립함으로써 효율적으로 세포 외 다당을 대량 생산할 수 있다.

Claims (7)

  1. 자 발효조(jar fermenter) 시스템을 이용하고, 강산성(pH 3 ∼ 4) 조건으로 6 ∼ 48 시간 배양한 후 약산성(pH 5 ∼ 6) 조건에서 배양하는 2단계 pH 조절하에서, 100 ∼ 700 rpm의 교반속도 및 0.3 ∼ 2 vvm의 통기속도로 영지를 액체배양하는 것을 특징으로 하는 세포외 다당의 대량 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 액체배양에 폴리아크릴산을 0.1%(w/v) 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포외 다당의 대량 생산방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기의 액체배양에서 용존 산소농도가 40 ∼ 80%인 것을 특징으로 하는 세포외 다당의 대량 생산방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 액체배양에서 영지의 균사 형태의 거칠기 정도(roughness)가 약 17%이고, 균사 크기가 0.3 ∼ 0.5 mm로 유지되는 것을 특징으로 하는 세포외 다당의 대량 생산방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 액체배양에서 산소이동용량계수(kla)가 85.4 ±26.70 h-1으로 스케일 업되는 것을 특징으로 하는 세포외 다당의 대량 생산방법.
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