SI9700014A

SI9700014A - Postopek za pripravo inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum s submerzno fermentacijo

Info

Publication number: SI9700014A
Application number: SI9700014A
Authority: SI
Inventors: Irena Zore; Marin Berovič; Bojana Boh; Damjan Hodžar; Franc Pohleven
Original assignee: Kemijski Inštitut, Ljubljana
Priority date: 1997-01-28
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 1998-08-31

Abstract

Postopek za pripravo inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum s submerzno fermentacijo, pri čemer z glivo Ganoderma lucidum preraščen krompirjev dekstrozni agar (PDA) s skupno površino 100 do 200 mm kvadratnih prenesemo v 500 ml erlenmajerico s 100 ml substrata, pri čemer vegetativni substrat vsebuje filtrat 300 g/l olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/l glukoze, 2% vol/vol olivnega olja ter do skupnega volumna 1 litra destilirane vode s pH 5,8, nakar v tem mediju stresamo kulturo 80 do 160 ur, pri temperaturi 20 do 30 stopinj Celzija in pri 80 do 160 obratih na minuto, in pri čemer substrat v bioreaktorju steriliziramo pri temperaturi 110 do 130 stopinj Celzija, pri tlaku 1 do 1,4*10 na 5 potenco pa v teku okoli pol ure, mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktorju pa je 200 do 400 obratov na minuto, zatem pa ohladitvi na 30 stopinj Celzija cepimo sterilni substrat s 17% vol/vol vegetativnega inokuluma, stresano kulturo staro 120 do 170 ur; gojenje micelija glive Ganoderma lucidum poteka 160 ur, pri čemer koncentracijo raztopljenega kisika zdržujemo s prezračevanjem 6 do 15 l/min in 200 do 600 obratih/minuto, maksimalna vrednost redoks potenciala med gojenjem znaša 410 do 460mV, minimalni parcialni tlak kisika 25 do 33 % vol/vol pri pH 4,10 do 4,30. Izum omogoča proizvodnjo glive tudi v industrijskem merilu.ŕ

Description

Postopek za pripravo inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum s submerzno fermentacijo

Predloženi izum se nanaša na nov originalen postopek priprave inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču bukovem žaganju in v tekočem gojišču. Izum spada v področje submerzne fermentacije glive in omogoča enostavno pripravo velike količine vcepka za nadaljno kultivacijo fruktificirane glive-gobe Ganoderma lucidum. Postopek omogoča natančno vodenje in spremljanje rasti glive v sterilnih pogojih. Tako pripravljen vcepek je primeren za inokuliranje sterilnega bukovega žaganja ali tekočega gojišča za gojenje glivine biomase s postopkom submerzne kultivacije v industrijskem merilu.

V naravi raste Ganoderma lucidum kot enoletnica na različnih drevesih. Primarno raste na listavcih (hrast, javor, brest, vrba, magnolija, akacija; na Vzhodu na slivah). V jugovzhodnih in jugozahodnih delih Amerike je najpogostejša v hrastovih gozdovih, severnovzhodnih predelih Amerike pa na javorju. Na iglavcih (jelki) se pojavlja redkeje.

Kitajci in Japonci že stoletja proglašajo Ganodermo lucidum ali Ling - Chi za izjemno sredstvo, ki vsestransko krepi zdravje. Poudarjajo predvsem, da zelo uspešno zdravi raka, poveča odpornost in pripomore k okrevanju. G. lucidum danes velja za gobo z mnogimi farmacevtsko zanimivimi učinkovinami. Danes je dokazano, da vsebuje substance z analgetičnimi (Kasara in Hikino 1987), antihepatotoksičnimi, kardiotoničnimi, hipoholesterolemskimi ( Jong in Birmingham 1992)., hipoglikemskimi (Hikino in sod.1985), hipotenzivnimi (Kabir et.al 1988, Morigiwa et al. 1986), imunomodulatornimi, protitumorski in drugimi učinki (Liu et al.1979) . Po Wilalardu 1990 lahko ta goba zdravi raka, okvare jeter, sindrom kronične utrujenosti, bolezni ožilja oz. vsako moderno bolezen. Zato jo nekateri imenujejo tudi ‘Panacea Polypore” (goba za vse bolezni). Njene zdravilne substance je možno izolirati in jih uporabiti kot farmacevtike, vendar pa je, zaradi sinergističnih učinkov njenih substanc, gobo bolj smiselno uporabljati kot nutri- ali nutracevtik (delno prečišeni in neprečiščeni micelij) (Liu et al.1979).

Ker je bila Ganoderma lucidum včasih dostopna le v naravni obliki, je bila namenjena le redkim ljudem. Danes je zaradi različnih oblik gojenja dostopna širšemu krogu ljudi. Na Kitajskem in Japonskem tržišču je na voljo v posušeni obliki (nutracevtik) in v obliki različnih produktov (nutricevtik), kot so pilule, čaji, tinkture in iz micelija narejenih sirupov. Dodajajo jo tudi kot aromo in zdravilni aditiv vinu in v

pivu. Tradicionalno predpisana dnevna doza je 3 - 5 gramov. Caj kuhajo iz svežih in posušenih gob na poseben način. V ZDA se v zadnjem času Reishi uporablja med skupinami, ki so HIV pozitivne, tudi kot imunostimulans.

Glive rodu Ganodcnna, ki spadajo med Basidiomycete (prostotrosnice), že stoletja uporabljajo v kitajski in japonski tradicionalni medicini za zdravljenje številnih bolezni, v zadnjih letih pa se zanje močno zamina tudi farmacevtska industrija, saj so bile iz njih izolirane številne fiziološko aktivne spojine: triterpenoidi, polisaharidi, proteini, aminokisline, nukleotidi, alkaloidi, steroidi, laktoni, maščobne kisline in encimi.

Najpomembnejši fiziološko aktivni triterpenoidi so ganoderske (C₃₀ triterpenoidi) in lucidenske kisline (C₂7 triterpenoidi), poleg njih pa tudi ganodermske kisline, ganoderenske kisline, ganolucidne kisline, lucidoni, ganoderali in ganoderoli.

COOH

COOH ganoderska kislina F lucidenska kislina D

12p-acetoksi-3,7,ll,15,23-pentaokso- 4,4,14a-trimetil-3,7,ll,12,155a-lanost-8-en-26-ojska kislina pentaokso-5a-hol-8-en-24-ojska kislina

V glivah Ganoderma so tudi številni polisaharidi. β-D-glukani (homoglukani in heteroglukani) in njihovi kompleksi s proteini imajo protitumorni učinek. Protitumorna aktivnost je zelo odvisna od stopnje razvejanosti polisaharida. Močno razvejani polisaharidi so veliko bolj aktivni kot nerazvejani. (Sone in sod., 1985; Sasaki in sod., 1971). Med monosaharidnimi enotami polisaharidov so poleg Dglukoze najpogostejši sladkorji D-galaktoza, D-manoza, L-fukoza, L-arabinoza, Dksiloza, D-galakturonska kislina in D-ramnoza.

Ker količina naravno rastoče glive ni zadostna za komercialno pridobivanje fiziološko aktivnih komponent, je v razvoju več metod za kultivacijo gliv na umetnih gojiščih.

Glive rodu Ganoderma uspešno gojijo na trdnih gojiščih, žaganju in kmetijskih odpadkih, kot tudi s submerzno fermentacijo v tekočem mediju. Vrste, ki jih najpogosteje gojijo s submerzno fermentacijo, so Ganoderma lucidum, Ganoderma japonicum, Ganoderma capense, Ganoderma applanatum, Ganoderma boninense in Ganoderma tsugae (Jong in sod., 1992).

Kvaliteta same glive, njen izgled, barva in oblika, lastnosti in vsebnost različnih snovi, tudi fiziološko aktivnih, so odvisni od pogojev rasti: temperatura, svetloba, vlaga, lega, koncentracija O₂, CO₂ in NH₃, vsebnost hranilnih in anorganskih snovi (Chang in sod., 1993).

REFERENCE

Chang, S.-T., Buswell, J. A., Chiu, S.-W. (Eds.), 1993: Mushroom biology and mushroom products; The Chinese University Press, Hong Kong, str. 71-168, str. 247274, str. 331-366

Chung, K. S., Koo, Y. J.,Yoo, J. Y., Choi, S. Y., Shin, D. H., 1991: Mycelial growth of Ganoderma lucidum and Grifola frondosa in milk whey; Han’guk Kyunhakhoechi, Vol. 19(1), str. 61-65

Hikino H., Ishiyama M., Suzuki Y., Konno C., 1989 : Mechanism of Hypoglycemic activity of Ganoderan B: Glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies, Planta Medica

55,, 423-428

Jong, S. C., Birmingham, J. M., 1992: Medicinal benefits of the mushrooms Ganoderma; Adv. Appl. Microbiol., Vol. 37, str. 101-134

Kasahara Y., Hikino H., 1987, Validity of the oriental medicines Part 122. Central actions of adenosine, a nucleotid of Ganoderma lucidum, Phytother Res.l, 173-176

Kabir,Y., Kimura, S., Tamura, T. 1988, Dietary effect of Ganoderma lucidum Mushroom on Blood Pressure and Lipid Levels in Spontaneusly Hypertensive Rats (SHR). Nutr.Sci.Vitaminol 34,, s. 433-438

Kohlmunzer, S., Wegiel, J., Sitarz, J., 1989: Polysaccharides in mycelial culture of Ganoderma applanatum (Pers.) Pat; Herba Hungarica, Vol. 28(1-2), str. 87-94

Liu G.T., Bao T.T.,Niu Χ.Υ. Li S.Z., 1979 Sof the sporesome pharmacological actions of Ganoderma lucidum and Ganoderma capense (Loyd) Teng cultivated cultivated by submerged fermentation, Chin.Med.J. , 92,496-500

Morigiwa A., Kibatake K., Fujimoto Y., Ikekawa N., 1986 Angiotensin converting enzyme-inhibiting triterpens from Ganoderma lucidum. Chem.Pharm.Bull.,34, 30253028

Ohno, N., Kuroda, T., Misono, T., 1990: The conditions for amylase production by mycelium cultivation of Ganoderma lucidum No. 15; Wayo Joshi Daigaku Kiyo, Kaseikei-hen, Vol. 30, str. 1-11

Sasaki T., Yoshiko A., Ikekawa T., Chirhara G., Fukuoka F., 1971: Antitumor polysaccharides from some Polyporaceae, Ganoderma Applanatum (Pers.) Pat and Phellinus lintenus (Berk et.Curt) Aoshima; Chem.Pharm.Bull.Vol.l9(4), str. 821-826

Sone, Y., Okuda, R., Wada, N., Kishida E., Misaki, A., 1985: Structures and antitumor activities of the polvsaccharides isolated from fruiting body and the growing culture of mycelium of Ganodrema lucidum; Agric. Biol. Chem. Vol. 49(9), str. 2641-2653

Wilard T., 1990 Reishi Mushroom-herb of spiritual potency and medicinal wonder, Sylvan Press, Issaquah, Wasington

Yoon, S., Kirn., M.-K., Hong, J.-S., Kim, M.-S., 1994: Purification and properties of polygalacturonase from Ganoderma lucidum; Korean Journal of Mycology, Vol. 22(4), str. 298-308,

Pregled patentov in znanstveno-strokovne literature s področja gojenja gliv Ganoderma s submezno fermentacijo kaže koncentracijo tovrstnih raziskav zlasti na Japonskem. Tabela 1 podaja primerjave med patenti s poudarkom na glavnih sestavinah substrata za gojenje glivne biomase.

Tabela 1:

Patent (datum)	naslov	vrsta glive	sestava substrata	pogoji
JP 62234027 A(871014)	Fermented food for hyperlipemia patients comprises Basidiomycetes and contains .beta.-D-glucan, saponin and ergosterol	Ganoderma lucidum	žitarice, stročnice	pH=2,5-5,5; T=35-45°C; 4-15 dni; air flow=0,52,0 lit/min
JP 5292917 A(931109)	New raw material for food and drink	Ganoderma lucidum, Lentinus edodes		T=15-35°C; air flow=0.1-2,0 lit/min; 0-1,000 r.p.m. stirring rate; 1-30 hr
JP 5192036 A (930803)	Culture of mushroom	Ganoderma, Lentinus, Flammulina, Pleurotus, Shirotamogit ake, Pholiota nameko, Coliolus Tramella, Auricularia		pH=3-8; T=2040°C; volume of aeration=0,1-2,0 vvm; mešanje

JP 3127955 A (910531)	Ganoderma lucidum jelly and Droduction thereof	Ganoderma lucidum	1-5 wt./vol.% maltoze, 0,51,5 wt./vol.% corn steep liquor; lahko: anorganske soli, kaleče žitarice, riževi otrobi, vitamini	T=20-35°C; 3-12 dni; in rotary shaking incubator
JP 1121302 A(890515)	Mucilaginous polisaharidi substance and productio thereof	Ganoderma lucidum	nujno: glukoza in ekstrakt kvasa ali glutamin ali glutamimska kislina
JP 63280028 A 19881117	Antiallergic agent	Ganoderma lucidum	nujno: 0,2-10 wt./vol.% glukoze, 0,2-2 wt./vol.% kaleče pšenice
JP 62224283 A(871002)	Saponin- containing mycelium	Ganoderma	vir ogljika: žitarice, (polisaharidi); fižol (proteini)	pH=2,5-5,5; T=31-45°C; air flow=0,5-2,0 lit/min(llit medium); 4-15

				dni
JP 62096063 A(870502)	’roduction of ermented food	Ganoderma lucidum	vir ogljika:žitarice vir dušika: žižol, uprašen zeleni čaj; nujno:glukoza, MgSO₄, natrijeve soli, najbolje fosfat	pl 1=2,5-5,5; r=31-45°C; air low=0,5-2,0 it/min; 4-15 dni
JP 61234776 A(861020)	Sdethod of cultivating mycelium of Basidiomycetes	Ganoderma lucidum	vir ogljika, vodika, kisika: škrob (10-15 wt.%); vir dušika: tekoče umetno gnojilo (7-10 wt.%); amilaza (0,050,5 wt.%)	T=konstantna
JP 61130235 A (860618)	Phagocyte fuction activator	Ganoderma lucidum	0,2-10 w/v%, preferably 1-8 ν/!ν% glukoze; 0,2-2 w/v%, preferably 0,51,0 w/v% kaleče pšenice	T=25-30°C; aerated amount=0,5-3,0 v.v.m.;7-21 dni; v temi
JP 04304890 A2 (921028)	Manufacture of ganoderic acid by culture of Ganoderma liicidum	Ganoderma lucidum	vir ogljika: glukoza; vir organskega hranila: step com liquor	T=25°C; v temi
JP 1120228 A2 (890512)	Method for cultivation of Ganoderma lucidum - using new synthetic culture medium	Ganoderma lucidum	1-20 wt.% viri ogljika: monosaharidi, disaharidi ali polisaharidi, posebej glukoza, fruktoza, sukroza, maltoza, maltotrioza, celuloza, škrob, itd.;	•

			0,1-2,0 wt.% anorganske soli: MgSO₄; CaCl₂; Na₃PO₄; železov sulfat;CuSO₄; ZnSO₄; natrijev molibdat; KJ
JP 60188402 A2 (850925)	Manufacture of a new .beta. glucan	Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum, Ganoderma japonicum	škrob, kaleča pšenica, corn steep liquor, NHjNCb, MgSO₄.7H₂O, MnSO₄.4H₂O	T=30°C;6 dni; aerobni pogoji
JP 59205978 A2 (830510)	A method for moulding the mycelium of a Basidiomycete όγ producing oharmaceuticals and foods itd.	Ganoderma lucidum, Len ti n us edodes, Phoriota nameko	glukoza, ?eptoni, anorganske soli, kvasni ekstrakt, itd.	pH=5; T=2530°C; približno 1 teden
Članki
Chung et al.	Mycelial growth of Ganoderma lucidum and Grifola frondosa in milk whey		osnovni medij: mlečna sirotka; 0,8% (wt./vol.) CM- celuloza, 0,2%(NH₄) ₂SO₄	pH=5,5
Ohno et al.	The conditions for amylase production by mycelium cultivation of Ganoderma lucidum No. 15		škrob, polipeptoni, Tween 80	pH=6,0
Kohlmiizer et al.	Polisaharidis in mycelial culture of Ganoderma applanatum		10 g glukoze; 15 g ekstrakta slada; 0,5 g NH₄C1; 1,0 g L-asparagina; 0,5 g KH₂PO₄; 0,5 g	pH=5,5; T=25°C; 21 dni

			MgSO₄.7H₂O; 10 kapljic 1% FeCl₃; 1,5 mL 0,5% MnSO₄.lH₂O; 1,5 mL 0,2% ZnSO₄.7H₂O; 5mL2% CaCl₂.6H₂O; 200 mg hidrolizata kazeina; 30 mg kvasnega ekstrakta; 10 pg vitamina Bi; 10 pg vitamina B₆; destilirana voda do 1000 ml
Yoon et al.	Production of polygalacturonase from Ganoderma lucidum		10 g pektin; 10 g škroba; 2 g peptonov; 1 g fenilalnina; 2 g KH₂PO₄; 0,2 g MgSO₄.7H₂O; 0,05 g CaCl₂; lOOg tiamina; v 1000 mL destilirane vode	pH=5,5; T=30°C; 14 dni

Do-sedanja patentna literatura v smeri produkcije glivine biomase v tekoči fazi, se nanaša na gojenje vegetativnega vcepka v stresanih kulturah ( JP 3127955 A) ali submerznih bioreaktorjih (JP 62096063 A , JP 61130235 A, Chung in sod. , Kohlmunzer in sod. , Yoon in sod. ), v obliki površinske na tekočem ali kultivacije na trdnem gojišču (JP 1121302 A, JP 63280028 A, JP 62096063 A, JP 61234776 A, JP 04304890 A2, JP 1120228 A2,JP 601 884 402 A2, JP 59205978 A2, JP 1120118 A2, Ohno in sod.).

Biomasa glive Ganoderma lucidum pridelana po vseh omenjeenih referencah se uporablja v zdravstvu ( JP 601 884 402 A2, JP 59205978 A2, JP 62096063 A, JP 61130235 A ) in v prehrani (JP 62096063 A, JP 5292917 A, JP 519 2036 A ).

Opisani načini kultivacije biomase glive Ganoderma lucidum niso namenjeni industrijski proizvodnji.

Z ozirom na pregled patentne literature in vseh člankov, ki se nanašajo na submerzno gojenje biomase glive Ganoderma lucidum smo ugotovili možnost patentibilnosti našega postopka.

Predlagani izum priprave inokuluma s submerzno kultivacijo je zasnovan na uporabi optimalne količine 14 % vol/vol izhodnega vegetatativnega inokuluma ter kompleksnih naravnih sestavin, kot sta krompirjev dekstran, (vir ogljikovodikov) iz termično obdelanega krompirja ter olivno olje, vir dušika, fosforja in vitaminov. Prednost predlaganega izuma je v tem da predlagani postopek submerzne fermentacije omogoča enostavno delo v kontroliranih, sterilnih pogojih pri katerih lahko hitro proizvedemo željeno obliko biomase oziroma velike količine inokuluma za industrijsko kultivacijo. Z ozirom na patentno literaturo in članke je dobitek biomase glive Ganoderma lucidum 14,0 g/1 z ozirom na patente (10-15g/l) v samem vrhu citiranosti ( Chang in sod. 1993, patentna literatura).

Predloženi izum se nanaša na nov postopek za pripravo inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum s submerzno fermentacijo, pri katerem z glivo Ganoderma lucidum preraščen krompirjev dekstrozni agar (PDA) s skupno površino 100 do 200 mm² prenesemo v 500 ml erlenmajerico s 100 ml substrata, pri čemer vegetativni substrat vsebuje filtrat 300 g/1 olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/1 glukoze, 2 % vol/vol olivnega olja ter do skupnega volumna 1 litra destilirane vode s pH 5,8, nakar v tem mediju stresamo kulturo 80 do 160 ur, pri temperaturi 20 do 30 °C in pri 80 do 160 obratih na minuto, in pri čemer substrat v bioreaktorju steriliziramo pri temperaturi 110 do 130 °C, pri tlaku 1 do 1,4* 10⁵ Pa v teku okoli pol ure, mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktorju pa je 200 do 400 obratov na minuto, zatem po ohladitvi na 30 °C cepimo sterilni substrat s 17 % vol/vol vegetativnega inokuluma, stresano kulturo staro 120 do 170 ur; gojenje micelija glive Ganoderma lucidum poteka 160 ur, pri čemer koncentracijo raztopljenega kisika vzdržujemo s prezračevanjem 6 do 15 1/min in 200 do 600 obratih/minuto, maksimalna vrednost redoks potenciala med gojenjem znaša 410 do 460 mV, minimalni parcialni tlak kisika 25 do 33 % vol/vol pri pH 4,10 do 4,30.

Postopek prednostno izvedemo tako, da kot glivo Ganoderma lucidum uporabimo glivo Ganoderma lucidum MZKI G 97, Mikrobiološka zbirka Kemijskega inštituta v Ljubljani. Postopek je izvedljiv tudi v industrijskem merilu, kar je velika prednost.

Priprava vcepka

Postopek v smislu izuma izvedemo tako da iz agarne plošče s plutovrtom sterilno izrežemo in prenesemo štiri do osem, prednostno šest izrezanih valjev s premerom 1 cm in višino 0,5 cm z glivo Ganoderma lucidum {Gal 1, mikrobna zbirka Katedre za zaščito lesa , Biotehniška fakulteta v Ljubljani) preraščenega krompirjevega dekstroznega agarja (PDA) s skupno površino 100 do 200 mm^ prednostno 170 mm^, v 500 ml erlenmajerico z 100 ml substrata.

Vegetativni substrat vsebuje filtrat 300 g/1 olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/1 glukoze, 2 % vol/vol olivnega olja ter do skupnega volumna 1 1 destilirane vode pri pH 5,8.

V tem mediju stresamo kulturo od 80 do 160 prednostno 120 ur pri temperaturi 20 do 30°C prednostno 25°C (298 K) in pri 80 do 160 prednostno 100 obratih/min. Substrat v bioreaktorju steriliziramo pri temperaturi od 110 do 130 °C, prednostno 121°C in tlaku od 1 do 1.4* 10^ Pa, prednostno 1.2 *10^ Pa, 0.5 ure. Mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktorju je od 200 do 400 obratov/minuto, prednostno 300 obratov/minuto.

Po ohladitvi na 30°C cepimo sterilni substrat s 17 % vol/vol količino vegetativnega inokuluma, stresano kulturo staro od 120 do 170 ur, prednostno 144 ur.

Kultivacija micelija glive Ganoderme lucidum v laboratorijskem bioreaktorju poteka 160 ur. Koncentracijo raztopljenega kisika vzdržujemo s prezračevanjem od 6-10 do 6-15 litrov/minuto, prednostno 6-13 litrov/minuto in obrati N od 200 do 600 obratov/minuto , prednostno od 300-450 obratov/minuto.

Maksimalna vrednost redoks potenciala med kultivacijo znaša od 410 do 460 mV, prednostno 420 mV, minimalni parcialni tlak kisika od 25 do 33 prednostno 16 % vol/vol pri pH od 4.10 do 4,30 prednostno 4,20.

Kultivacija glivine biomase po tem postopku traja 160 ur, količina nastale suhe biomase ob koncu kultivacije pa znaša 14.0 g/1.

Opisani izum predlagamo v treh izvedenih primerih.

V vseh navedenih primerih je znašal volumen inokuluma 14, 17 in 20 volumskih % (vol/vol). Koncentracijo raztopljenega kisika smo vzdrževali s prezračevanjem od 6-10 do 6-15 litrov/minuto, prednostno 6-13 litrov/minuto in obrati N od 200 do 600 obratov/minuto , prednostno od 300-450 obratov/minuto.

Prvi primer

En liter krompirjevega gojišča vsebuje filtrat 300 g/1 olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/1 glukoze, 2 % vol/vol olivnega olja in do skupnega volumna 1 1 destilirane vode pri pH 5,8.

Pripravimo ga tako, da 300 g/1 na kocke narezanega olupljenega krompirja vremo v 500 ml destilirane vode, dokler ni popolnoma kuhan. Dobljeno zmes prefiltriramo skozi gazo ali vato. Dobljenemu filtratu pred sterilizacijo gojišča dodamo 20 g/1 glukoze, ter 2 % vol/vol olivnega olja, šele nato z destilirano vodo dopolnimo volumen do enega litra ter naravnamo pH na 5,8.

Substrat v bioreaktorju steriliziramo pri temperaturi od 110 do 130 °C, prednostno 121°C in tlaku od 1 do 1.4*10^ Pa, prednostno 1.2 *10^ Pa, 0.5 ure. Mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktorju je od 200 do 400 obratov/minuto, prednostno 300 obratov/minuto.

Kultivacija micelija glive Ganoderme lucidum v laboratorijskem bioreaktorju poteka 160 ur. Koncentracijo raztopljenega kisika smo vzdržujemo s prezračevanjem od 6-10 do 6-15 litrov/minuto, prednostno 6-13 litrov/minuto in obrati N od 200 do 600 obratov/minuto , prednostno od 300-450 obratov/minuto.

Po 30-ih urah kultivacije preidejo mikrobni skupki v sferične pelete, pH se zelo hitro zniža na 4,35 in se ustali. Rast je pri tem primeru tudi najhitrejša. Maksimalna vrednost redoks potenciala med kultivacijo je od 420 do 435, prednostno 425 mV, minimalni parcialni tlak kisika pa od 20 do 40, prednostno 35 % vol/vol nasičenja. Kisik se porablja počasi in enakomerno.

Kultivacija glivine biomase po tem postopku traja 160 ur, količina nastale suhe biomase ob koncu kultivacije pa znaša 5.8 g/1.

Drugi primer

En liter krompirjevega gojišča vsebuje filtrat 300 g/1 olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/1 glukoze, 1000 ml destilirane vode in 2 % vol/vol olivnega olja pri pH 5,8.

Pripravimo ga tako, da 300 g/1 na kocke narezanega olupljenega krompirja vremo v 500 ml destilirane vode, dokler ni popolnoma kuhan. Dobljeno zmes prefiltriramo skozi gazo ali vato. Dobljenemu filtratu pred sterilizacijo gojišča dodamo 20 g/1 glukoze, ter 2 % vol/vol olivnega olja in šele nato z destilirano vodo dopolnimo volumen do enega litra ter naravnamo pH na 5,8.

Substrat v bioreaktorju steriliziramo pri temperaturi od 110 do 130 °C, prednostno 121°C in tlaku od 1 do 1.4* 10^ Pa, prednostno 1.2 *10^ Pa, 0.5 ure. Mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktorju je od 200 do 400 obratov/minuto, prednostno 300 obratov/minuto.

Po ohladitvi na 30°C cepimo sterilni substrat s 20 % vol/vol količino vegetativnega inokuluma, stresano kulturo staro od 120 do 170 ur, prednostno 144 ur.

Kultivacija micelija glive Ganoderme lucidum v laboratorijskem bioreaktorju je potekala 160 ur. Koncentracijo raztopljenega kisika smo vzdrževali s prezračevanjem od 6-10 do 6-15 litrov/minuto, prednostno 6 - 13 litrov/minuto in obrati N od 200 do 600 obratov/minuto , prednostno od 300-450 obratov/minuto.

Drugi primer smo izvedli z 20 % vol/vol vcepeka. Pri tej kultivaciji se mikrobni skupki pojavijo že po 19 uri, vendar pa se ti šele po zelo dolgem času, po 89-ih urah diferencirajo v sferične pelete. Pri tem primeru je porast biomase zelo majhen.

Maksimalna vrednost redoks potenciala med kultivacijo je znašala 317mV, minimalni parcialni tlak kisika 7 % vol/vol in pH 4.30.

Pri drugi fermentaciji je 20 % vol/vol, količina inokuluma prevelika za količino hranil, ki so zastopani v gojišču. Intenzivno se porablja kisik in je v fazi, ko se pojavi intenzivnejša rast, na najnižjem nivoju od 7 do 30 , prednostno 15 % vol/vol nasičenja. pH je v tem območju je med 4,4 - 4,5. Slaba rast je posledica hitre porabe hranil in ob tem prenizkega nasičenja kisika v gojišču.

Kultivacija glivine biomase po tem postopku traja 160 ur, količina nastale suhe biomase ob koncu kultivacije pa znaša 6.5 g/1.

Tretji primer

Kultivacija micelija glive Ganoderme lucidum v laboratorijskem bioreaktorju poteka 160 ur. Koncentracijo raztopljenega kisika smo vzdrževali s prezračevanjem od 6-10 do 6-15 litrov/minuto, prednostno 6-13 litrov/minuto in obrati N od 200 do 600 obratov/minuto , prednostno od 300-450 obratov/minuto.

Tretji primer smo izvedli z 17 % vol/vol vcepeka. Pri tej kultivaciji se mikrobni skupki pojavijo že po 19 uri, vendar pa se ti šele po zelo dolgem času, po 89-ih urah diferencirajo v sferične pelete. Poraba hranil in kisika je v tem primeru najbolj racionalna. Pri tem primeru je porast biomase najvišji.

Maksimalna vrednost redoks potenciala med kultivacijo je znašala od 410 do 440 prednostno 435 mV, minimalno nasičenje kisika od 10 do 25, prednostno 16 % vol/vol pri pH 4,20.

Claims

1. Postopek za pripravo inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum s submerzno fermentacijo, označen s tem, da z glivo Ganoderma lucidum preraščen krompiqev dekstrozni agar (PDA) s skupno površino 100 do 200 mm^{2 3 4} prenesemo v 500 ml erlenmajerico s 100 ml substrata, pri čemer vegetativni substrat vsebuje filtrat 300 g/l olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/l glukoze, 2 % vol/vol olivnega olja ter do skupnega volumna 1 litra destilirane vode s pH 5,8, nakar v tem mediju stresamo kulturo 80 do 160 ur, pri temperaturi 20 do 30 °C in pri 80 do 160 obratih na minuto, in pri čemer substrat v bioreaktoiju steriliziramo pri temperaturi 110 do 130 °C, pri tlaku 1 do 1,4*10⁵ Pa v teku okoli pol ure, mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktorju pa je 200 do 400 obratov na minuto, zatem po ohladitvi na 30 °C cepimo sterilni substrat s 17 % vol/vol vegetativnega inokuluma, stresano kulturo staro 120 do 170 ur; gojenje micelija glive Ganoderma lucidum poteka 160 ur, pri čemer koncentracijo raztopljenega kisika vzdržujemo s prezračevanjem 6 do 15 l/min in 200 do 600 obratih/minuto, maksimalna vrednost redoks potenciala med gojenjem znaša 410 do 460 mV, minimalni parcialni tlak kisika 25 do 33 % vol/vol pri pH 4,10 do 4,30.

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da kot glivo Ganoderma lucidum uporabimo glivo Ganoderma lucidum MZKIG 97, Mikrobiološka zbirka Kemijskega inštituta v Ljubljani.

3. Postopek po zahtevku 1 in 2, označen s tem, da poteka v industrijskem merilu.

4. Postopek po zahtevku 1 in 2, označen s tem, da gojenje micelija glive poteka v laboratorijskem biorekatorju.

Za:

IZVLEČEK

Postopek za pripravo inokuluma za gojenje glive Ganoderma lucidum s submerzno fermentacijo, pri čemer z glivo Ganoderma lucidum preraščen krompirjev dekstrozni agar (PDA) s skupno površino 100 do 200 mm² prenesemo v 500 ml erlenmajerico s 100 ml substrata, pri čemer vegetativni substrat vsebuje filtrat 300 g/1 olupljenega prekuhanega krompirja, 20 g/1 glukoze, 2 % vol/vol olivnega olja ter do skupnega volumna 1 litra destilirane vode s pH 5,8, nakar v tem mediju stresamo kulturo 80 do 160 ur, pri temperaturi 20 do 30 °C in pri 80 do 160 obratih na minuto, in pri čemer substrat v bioreaktoiju steriliziramo pri temperaturi 110 do 130 °C, pri tlaku 1 do 1,4*10⁵ Pa v teku okoli pol ure, mešanje substrata med sterilizacijo v bioreaktoiju pa je 200 do 400 obratov na minuto, zatem po ohladitvi na 30 °C cepimo sterilni substrat s 17 % vol/vol vegetativnega inokuluma, stresano kulturo staro 120 do 170 ur; gojenje micelija glive Ganoderma lucidum poteka 160 ur, pri čemer koncentracijo raztopljenega kisika vzdržujemo s prezračevanjem 6 do 15 l/min in 200 do 600 obratih/minuto, maksimalna vrednost redoks potenciala med gojenjem znaša 410 do 460 mV, minimalni parcialni tlak kisika 25 do 33 % vol/vol pri pH 4,10 do 4,30.

Izum omogoča proizvodnjo glive tudi v industrijskem merilu.