CN109929890B

CN109929890B - 一种麦考酚酸的发酵工艺

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Publication number: CN109929890B
Application number: CN201910378324.1A
Authority: CN
Inventors: 熊志; 刘任民; 黄秀芳
Original assignee: GUANGDONG BLUE TREASURE PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: GUANGDONG BLUE TREASURE PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2039-05-08
Also published as: CN109929890A

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种麦考酚酸的发酵工艺。本发明提供的麦考酚酸发酵工艺为：将短密青霉菌制成甘油孢子，然后进行种子培养和发酵培养，在发酵培养时及时对发酵液中的葡萄糖和甘氨酸进行补料处理，即得。本发明提供的麦考酚酸发酵工艺在发酵培养基中加入葵花籽饼粉，不仅可以减少消沫剂的用量，还可以促进菌丝生长，促进代谢产物的生成。同时在发酵过程中采用程序补加法补入甘氨酸溶液，可以使发酵液中甘氨酸浓度维持在合适的范围内，可以持续促进代谢产物生成，避免初始培养基中浓度过高对生产菌的影响，可以有效提高短密青霉菌的发酵水平，提高麦考酚酸的产量。

Description

一种麦考酚酸的发酵工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种麦考酚酸的发酵工艺。

背景技术

麦考酚酸(Mycophenolic Acid,MPA，又名霉酚酸)为短密青霉产生的抗真菌、抗肿瘤并具免疫抑制作用的抗生素，是一种高效、选择性、非竞争性、可逆性的次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(MPDH)抑制剂，可抑制鸟嘌呤核苷酸的起始合成途径，使鸟嘌呤核苷酸耗竭，进而阻断DNA的合成。临床上常以吗替麦考酚酯(MMF)和麦考酚酸钠(MPS)的形式应用。麦考酚酸的生产方法有化学合成和生物合成两个途径，化学合成法由于步骤多、得率低而难以工业化，国际上的规模化生产均采用青霉属微生物发酵生产法制备麦考酚酸。

麦考酚酸发酵技术和其他抗生素工业化生产方式相同，由传统的固态培养基发酵转变为液态深层发酵方式。美国专利US4452891提到，短密青霉在27℃振荡条件下培养6天，麦考酚酸的产量为2.4g/L，而在27℃非振荡条件下培养14天能达到3.6g/L。Hachiro进行菌种诱变后，液体发酵水平提高到5.8g/L。高兴蓉等对发酵条件和可利用碳源进行了研究，经优化后摇瓶产量为8.565g/L，但均没有实现工业化生产。

专利文献CN200810151218.1公开了一种麦考酚酸固态发酵的方法，该固态发酵方法不适用于规模化的工业生产，也没公开可达到发酵水平。专利文献CN200910168745.8公开了一种麦考酚酸发酵过程的补糖方法，其可以提高发酵水平最高产量达10.26g/L。娄忻等以响应面分析方法优化麦考酚酸发酵培养基，但也没有工业化应用，也没有公开可达到发酵水平。

另外，由于培养基及其麦考酚酸生产菌的特性，麦考酚酸发酵生产过程通常存在产泡沫量大，容易冒罐，存在容易染菌风险，并且泡沫量高无法加大发酵罐投料量，进一步限制了放罐产量。消泡剂的加入虽然可以很好地控制发酵罐内泡沫，但会因消泡剂的使用而影响下游麦考酚酸提取纯化，造成发酵液过滤、萃取结晶等操作困难及收率低等问题。现有技术并未提供较好的解决方案。

因此，研究和开发出一种能应用于工业化生产，麦考酚酸产量高的麦考酚酸发酵工艺仍是目前亟需解决的难题。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种麦考酚酸的发酵工艺，以解决上述不足。本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺是使用液体发酵方式，是一种生产成本低、可有效实现发酵液泡沫控制并提高发酵单位的麦考酚酸发酵工艺。

本发明提供了一种麦考酚酸的发酵工艺，包括以下步骤：

S1将接种短密青霉菌的菌株斜面于28℃培养9～10天，加入30％甘油10ml，洗下孢子，摇匀，取7ml置甘油油管中，得甘油孢子；

S2吸取步骤S1制得的甘油孢子放置种子培养基中，在30℃的条件下振荡培养48～72h，得种子菌；

S3将步骤S2得到的种子菌按10％的接种量接入发酵培养基中，在30℃的条件下培养38h，然后降到25℃继续培养160～240h，并及时对发酵液中的葡萄糖和甘氨酸进行补料处理，即得。

进一步地，所述步骤S2中的种子培养基由以下成分组成：

葡萄糖85～95g/L、酵母粉10～30g/L、蛋白胨15～20g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1～4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2～0.6g/L、GPE消沫剂1.4～2.0g/L，调节pH至4.0～5.0。

进一步地，所述步骤S2中的种子培养基由以下成分组成：

葡萄糖90g/L、酵母粉20g/L、蛋白胨17g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、GPE消沫剂1.8g/L，调节pH至4.0～5.0。

进一步地，所述步骤S3中的发酵培养基由以下成分组成：

葡萄糖200～300g/L、甘氨酸4～6g/L、蛋氨酸1～3g/L、蛋白胨4～6g/L、啤酒酵母4～6g/L、葵花籽饼粉10～20g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1～3g/L、MgSO₄·7H₂O0.2～0.6g/L、ZnSO₄·7H₂O 2～4g/L、CuSO₄·7H₂O 0.2～0.6g/L、GPE消沫剂0.4～0.6g/L，调节pH至4.0～5.0。

进一步地，所述步骤S3中的发酵培养基由以下成分组成：

葡萄糖250g/L、甘氨酸5g/L、蛋氨酸1g/L、蛋白胨5g/L、啤酒酵母5g/L、葵花籽饼粉15g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 3g/L、CuSO₄·7H₂O 0.5g/L、GPE消沫剂0.5g/L，调节pH至4.0～5.0。

进一步地，所述步骤S3中葡萄糖的补料处理为：在培养过程，根据需要取样检测发酵液中的葡萄糖，并补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在28～32g/L。

进一步地，所述步骤S3中甘氨酸的补料处理为：培养至70～73h开始，补入200g/L-230g/L无菌甘氨酸溶液，具体补入程序为：

培养至70～73h时，补入比例为1.6g/L；培养至90h时，补入比例为3g/L；培养至102～106h时，补入比例为5g/L；培养至122～126h时，补入比例为5g/L；培养至140～144h时，补入比例为3g/L；培养至156h时，补入比例为1.6g/L。

进一步地，所述补料处理时：培养至150h时，检查最近一次生化参数测定中的pH结果，如果pH高于6.0或液面过高，则156h继续补入甘氨酸溶液，否则不再补甘氨酸溶液。

进一步地，所述补料处理时：放罐前24小时不补入甘氨酸溶液。

进一步地，所述补料处理时：所述补入量的计算公式为：

V(L)＝W(L)×d(g/L)÷C(g/L)

其中：V为甘氨酸溶液的补入数量(L)，W为发酵液体积(L)；d为补入比例(g/L)；C为甘氨酸溶液浓度。

本发明采用的短密青霉菌来源于加拿大奥贝泰克发酵有限公司，所述葵花籽饼粉为榨油副产物打磨成的粉末。本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺在工业化实际大生产中，例如：发酵罐体积达到为20吨，可以按照常规的操作进行二次扩大种子量以达到满足20吨罐的接种量。

本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺中在配制发酵培养基时加入了葵花籽饼粉，其在发酵培养基的体系中可以减少发酵培养基中消沫剂的用量而维持很好的消泡效果，同时，其还可以提高短密青霉菌发酵水平，从而提高麦考酚酸的产量。其原因可能是：该葵花籽饼粉含量有丰富的营养物质，可以为短密青霉菌提供生长所不可缺少的营养物质，从而促进短密青霉菌的发酵水平，提高麦考酚酸的产量；另外，葵花籽饼粉在发酵培养基中的可以起到消泡的作用，与GPE消沫剂相互作用协同起增强消泡的作用，因而可以减少消泡剂的使用，从而降低了消泡剂对下游提炼生成的影响。

进一步地，本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺中采用变温发酵法，发酵接种后，前期培养温度为30℃，当溶解氧≤40％或培养时间达到38h止，之后在25℃继续培养。该分段温度前期30℃可以很好的促进菌丝的生长，当降低至25℃时，可以促进短密青霉菌代谢产物的生成，而且由30℃变温至25℃培养更有利于菌丝的繁殖和抑制泡沫的生成，可以进一步的提高麦考酚酸的产量，同时还可以减少消沫剂的用量。

进一步地，本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺中还采用程序补加法补入甘氨酸溶液，其可以使发酵液中甘氨酸浓度维持在合适的范围内，可以持续促进代谢产物的生成，避免初始培养基中浓度过高对生产菌的影响。同时通过甘氨酸溶液的补入，可以调节发酵罐中料液体积，保持发酵生产体积的稳定性。

与现有技术相比，本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺在发酵培养基中加入葵花籽饼粉，不仅可以减少消沫剂的用量，还可以促进菌丝生长，促进代谢产物的生成。同时在发酵过程中采用程序补加法补入甘氨酸溶液可以使发酵液中甘氨酸浓度维持在合适的范围内，可以持续促进代谢产物生成，避免初始培养基中浓度过高对生产菌的影响，可以有效的提高短密青霉菌的发酵水平，提高麦考酚酸的产量。

具体实施方式：

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或生产厂商推荐的条件进行。本发明培养基使用的成分为常规培养基成分，均为市售产品。

实施例1、一种麦考酚酸的发酵工艺

S1将接种短密青霉菌的菌株斜面于28℃培养9天，加入30％甘油10ml，洗下孢子，摇匀，取7ml置甘油油管中，得甘油孢子；

S2吸取步骤S1制得的甘油孢子放置种子培养基中培养，所述种子培养基以50L种子罐按以下配方配制种子培养基23L：葡萄糖85g/L、酵母粉15g/L、蛋白胨15g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、GPE消沫剂1.4g/L，调节pH4.2，在30℃，空气流量为0.5m³/h，培养罐压力为0.03Mpa，搅拌转速为400rpm的条件下培养50h，得种子菌；

S3将步骤S2得到的种子菌按10％的接种量接入发酵培养基中培养，以500L发酵罐按以下配方配制发酵培养基250L：葡萄糖230g/L、甘氨酸4g/L、蛋氨酸1g/L、蛋白胨4g/L、啤酒酵母4g/L、葵花籽饼粉10g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 2g/L、CuSO₄·7H₂O 0.4g/L、GPE消沫剂0.4g/L，调节pH4.4，在搅拌转速120rpm，空气流量40m³/h，罐压0.05Mpa，在30℃的条件下下培养至38h，接着降温至25℃继续培养，培养至70h开始补入浓度为230g/L的甘氨酸溶液，各周期补入比例如下：70h：1.6g/L；90h：3g/L；104h：5g/L；122h：5g/L；140h：3g/L；培养过程通过补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在30g/L，发酵180h后结束，即得。

实施例2、一种麦考酚酸的发酵工艺

S1将接种短密青霉菌的菌株斜面于28℃培养10天，加入30％甘油10ml，洗下孢子，摇匀，取7ml置甘油油管中，得甘油孢子；

S2吸取步骤S1制得的甘油孢子放置种子培养基中培养，所述种子培养基以50L种子罐按以下配方配制种子培养基23L：葡萄糖90g/L、酵母粉20g/L、蛋白胨17g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、GPE消沫剂1.8g/L，调节pH4.2，在30℃，空气流量约为0.5m³/h，培养罐压力为0.03Mpa，搅拌转速为400rpm的条件下培养50h，得种子菌；

S3将步骤S2得到的种子菌按10％的接种量接入发酵培养基中培养，以500L发酵罐按以下配方配制发酵培养基250L：葡萄糖250g/L、甘氨酸5g/L、蛋氨酸1g/L、蛋白胨5g/L、啤酒酵母5g/L、葵花籽饼粉15g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 3g/L、CuSO₄·7H₂O 0.5g/L、GPE消沫剂0.5g/L，调节pH4.4，在搅拌转速120rpm，空气流量40m³/h，罐压0.05Mpa，在30℃的条件下培养至38h，接着降温至25℃继续培养，培养至70h开始补入浓度为230g/L的甘氨酸溶液，各周期补入比例如下：70h：1.6g/L；90h：3g/L；104h：5g/L；122h：5g/L；140h：3g/L；培养过程通过补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在30g/L，发酵180h后结束，即得。

实施例3、一种麦考酚酸的发酵工艺

S2吸取步骤S1制得的甘油孢子放置种子培养基中培养，所述种子培养基以50L种子罐按以下配方配制种子培养基23L：葡萄糖95g/L、酵母粉25g/L、蛋白胨18g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.6g/L、GPE消沫剂1.8g/L，调节pH4.2，在30℃，空气流量约为0.5m³/h，培养罐压力为0.03Mpa，搅拌转速为400rpm的条件下培养50h，得种子菌；

S3将步骤S2得到的种子菌按10％的接种量接入发酵培养基中培养，以500L发酵罐按以下配方配制发酵培养基250L：葡萄糖280g/L、甘氨酸6g/L、蛋氨酸3g/L、蛋白胨6g/L、啤酒酵母6g/L、葵花籽饼粉20g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.6g/L、ZnSO₄·7H₂O 4g/L、CuSO₄·7H₂O 0.6g/L、GPE消沫剂0.6g/L，调节pH4.4，在搅拌转速120rpm，空气流量40m³/h，罐压0.05Mpa，在30℃的条件下培养至38h，接着降温至25℃继续培养，培养至70h开始补入浓度为230g/L的甘氨酸溶液，各周期补入比例如下：70h：1.6g/L；90h：3g/L；104h：5g/L；122h：5g/L；140h：3g/L；培养过程通过补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在30g/L，发酵180h后结束，即得。

实施例4、一种麦考酚酸的发酵工艺

S2吸取步骤S1制得的甘油孢子放置种子培养基中培养，同实施例2配制25L一级种子液培养基，在30℃，空气流量约为0.5m³/h，培养罐压力为0.03Mpa，搅拌转速为400rpm的条件下培养60h；

同实施例2配制1250L二级种子液培养基，在30℃，空气流量约为50m³/h，培养罐压力为0.03Mpa，搅拌转速为400rpm的条件下培养52h，得种子菌；

S3将步骤S2得到的种子菌接入发酵培养基中培养，以20000L发酵罐按以下配方配制发酵培养基15000L：葡萄糖250g/L、甘氨酸5g/L、蛋氨酸1g/L、蛋白胨5g/L、啤酒酵母5g/L、葵花籽饼粉15g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 3g/L、CuSO₄·7H₂O 0.5g/L、GPE消沫剂0.5g/L，调节pH4.8，在搅拌转速60rpm、空气流量150m³/h，罐压0.03Mpa，在30℃的条件下培养至38h，接着降温至25℃继续培养，培养至70h开始补入浓度为200g/L的甘氨酸溶液，各周期补入比例如下：72h：1.6g/L；90h：3g/L；102h：5g/L；124h：5g/L；144h：3g/L；156h：1.6g/L；培养过程通过补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在30g/L，培养至200h后结束发酵，即得。

对比例1、一种麦考酚酸的发酵工艺

所述麦考酚酸的发酵工艺的区别在于：所述步骤S2中发酵培养基为：以500L发酵罐按以下配方配制发酵培养基250L：葡萄糖250g/L、甘氨酸5g/L、蛋氨酸1g/L、蛋白胨5g/L、啤酒酵母5g/L、亚油酸15g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 3g/L、CuSO₄·7H₂O 0.5g/L、GPE消沫剂0.5g/L，调节pH4.4，其余步骤如实施例2。

对比例2、一种麦考酚酸的发酵工艺

所述麦考酚酸的发酵工艺的区别在于：所述步骤S3中的发酵条件为：在28℃的条件下培养，培养至70h开始补入浓度为230g/L的甘氨酸溶液，其余步骤如实施例2。

对比例3、一种麦考酚酸的发酵工艺

所述麦考酚酸的发酵工艺的区别在于：所述步骤S3中的发酵培养的补料处理为：培养至70h补入浓度为230g/L的甘氨酸溶液，培养过程通过补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在30g/L，其余步骤如实施例2。

试验例一、麦考酚酸的含量检测试验

1、试验材料：

实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2和对比例3的麦考酚酸的发酵工艺。

2、试验方法：

对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2和对比例3的麦考酚酸的发酵工艺发酵后采用HPLC法对麦考酚酸的含量进行检测。

3、试验结果：

试验结果如表1所示。

表1麦考酚酸的含量检测试验

	麦考酚酸含量(mg/L)
		实施例1	13505
实施例2	13890
		实施例3	13467
实施例4	14603
		对比例1	10984
对比例2	11320
		对比例3	78219

由表1可知，本发明提供的麦考酚酸的发酵工艺得到的麦考酚酸含量大于13467mg/L，而将亚油酸替换葵花籽饼粉的对比例1，其麦考酚酸含量有所降低，可能是亚油酸的消泡能力较低，导致发酵培养基中含有较多的气泡，影响短密青霉菌的发酵水平，而对比例2和对比例3发酵得到的麦考酚酸含量较低，说明变温发酵和科学的及时补料有利于提高麦考酚酸的产量。

Claims

1.一种麦考酚酸的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S3将步骤S2得到的种子菌按10％的接种量接入发酵培养基中，在30℃的条件下培养38h，然后降到25℃继续培养160～240h，并及时对发酵液中的葡萄糖和甘氨酸进行补料处理，即得；

所述步骤S3中葡萄糖的补料处理为：在培养过程，根据需要取样检测发酵液中的葡萄糖，并补入体积浓度为80％的无菌葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度维持在28～32g/L；

所述步骤S3中甘氨酸的补料处理为：培养至70～73h开始，补入200g/L-230g/L无菌甘氨酸溶液，具体补入程序为：培养至70～73h时，补入比例为1.6g/L；培养至90h时，补入比例为3g/L；培养至102～106h时，补入比例为5g/L；培养至122～126h时，补入比例为5g/L；培养至140～144h时，补入比例为3g/L；培养至156h时，补入比例为1.6g/L；

所述补料处理时：培养至150h时，检查最近一次生化参数测定中的pH结果，如果pH高于6.0或液面过高，则156h继续补入甘氨酸溶液，否则不再补甘氨酸溶液；

所述补料处理时：放罐前24小时不补入甘氨酸溶液。

2.如权利要求1所述的麦考酚酸的发酵工艺，其特征在于，所述步骤S2中的种子培养基由以下成分组成：

3.如权利要求2所述的麦考酚酸的发酵工艺，其特征在于，所述步骤S2中的种子培养基由以下成分组成：

4.如权利要求1所述的麦考酚酸的发酵工艺，其特征在于，所述步骤S3中的发酵培养基由以下成分组成：

葡萄糖200～300g/L、甘氨酸4～6g/L、蛋氨酸1～3g/L、蛋白胨4～6g/L、啤酒酵母4～6g/L、葵花籽饼粉10～20g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1～3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2～0.6g/L、ZnSO₄·7H₂O 2～4g/L、CuSO₄·7H₂O 0.2～0.6g/L、GPE消沫剂0.4～0.6g/L，调节pH至4.0～5.0。

5.如权利要求4所述的麦考酚酸的发酵工艺，其特征在于，所述步骤S3中的发酵培养基由以下成分组成：

葡萄糖250g/L、甘氨酸5g/L、蛋氨酸1g/L、蛋白胨5g/L、啤酒酵母5g/L、葵花籽饼粉15g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 3g/L、CuSO₄·7H₂O0.5g/L、GPE消沫剂0.5g/L，调节pH至4.0～5.0。

6.如权利要求1所述的麦考酚酸的发酵工艺，其特征在于，所述补料处理时：所述补入量的计算公式为：

V(L)＝W(L)×d(g/L)÷C(g/L)