CN115516079A

CN115516079A - 用于红霉素发酵生产的发酵培养基和方法

Info

Publication number: CN115516079A
Application number: CN202180031159.8A
Authority: CN
Inventors: 童庆丰; 宋金波; L·绍尔沃什
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2022-12-23
Also published as: WO2021219465A1

Abstract

本发明涉及用于发酵生产红霉素的发酵培养基和方法。具体地，本发明涉及一种使用聚氧乙烯‑聚氧乙烯嵌段共聚物非离子表面活性剂来发酵生产红霉素的方法。更具体地，所述聚氧乙烯‑聚氧乙烯嵌段共聚物非离子表面活性剂可以单独或与其他表面活性剂组合使用。

Description

用于红霉素发酵生产的发酵培养基和方法

技术领域

本发明涉及用于红霉素发酵生产的发酵培养基和方法。更具体地，本发明涉及使用非离子表面活性剂发酵生产红霉素的方法。

发明背景

红霉素是一种大环内酯类抗生素，可用于对抗由革兰氏阳性菌和立克次氏体引起的感染。此外，红霉素是临床上用于治疗细菌感染的大环内酯类抗生素，例如阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素等，的重要原料和中间体。

作为放线菌科(尤其是糖多孢菌属)细菌产生的次生代谢产物，红霉素对于生物体生长所需的代谢活动是多余的，可以排出到培养基中。

在工业上，红霉素主要是通过发酵生产的。对红霉素发酵工艺进行改进的已有研究，集中于筛选高产菌株、优化培养基和发酵条件。由于红霉素在商业上的重要性，仍然需要新的手段和工艺来改进红霉素的生产。

非离子表面活性剂是生物系统中有效的乳化剂，对生物系统的毒性较小。据报道，一些非离子表面活性剂可用于改善微生物发酵。Hamedi等人(JUST 32(1),2006,P.41-46)研究了各种非离子表面活性剂对摇瓶发酵生产红霉素的影响。结果显示，不同的表面活性剂对生产菌株的形态和红霉素的生产表现出不同的影响。例如，Tween 20和Triton X-100导致菌丝裂解；PEG300和Tween 40对红霉素生产没有负面或正面影响，Triton X显著降低产量。而另一方面，PEG200、PEG400、PEG600、Tween60、Tween80和Tween85增加红霉素的产量，且PEG400和PEG600的效果更佳。

聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，作为一种非离子表面活性剂，已知可用于多种领域，例如工业清洁和卫生应用、食品和饮料加工、食品服务和厨房卫生、家用洗涤剂、农药制剂等。然而，这种聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物在发酵红霉素生产中使用尚未有报道。

发明概述

本发明人惊奇地发现，将非离子表面活性剂聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物添加到发酵培养基中可以提高红霉素的产量，并且在增加最终发酵培养物的红霉素滴度方面，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物远优于其他非离子表面活性剂，例如，聚乙二醇(PEG)类表面活性剂。

因此，在一个方面，本公开提供了一种通过生产菌株发酵来生产红霉素的方法，包括将聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物非离子表面活性剂添加到发酵培养基中。

在另一方面，本公开提供了聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物用于发酵生产红霉素的用途。

在再一方面，本公开提供了包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、用于生产红霉素的发酵培养基。

聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物非离子表面活性剂，可以提高发酵结束时发酵液中的红霉素滴度。相对于没有任何表面活性剂补充的对照发酵，该滴度的增加可以达到至少15％，优选至少20％，至少25％，至少30％，或至少35％。

发明详述

通过以下详细描述和本文包括的实施例，可以更容易地理解本发明。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。为了本发明的目的，以下术语定义如下。

术语“约”在与数值结合使用时，旨在涵盖如下范围内的数值，所述范围的下限比具体所述数值小5％，且所述范围的上限比所述具体所述数值大5％。

术语“和/或”在用于连接两个或多个可选项时，应理解为是指，所述可选项中的任意一者或所述可选项中的任意两者或两者以上。

如本文所用，术语“包括”或“包含”是指，涵盖所述及的元素、实体或步骤，但不排除任何其他元素、实体或步骤。在此，当使用术语“包括”或“包含”时，除非另有说明，否则也旨在涵盖由所述及的元素、实体或步骤组成的情况。

如本文所用，术语“一”或“一个”，取决于使用它的上下文，可以表示一或多个。因此，例如，提及“一个细胞”可以意味着可使用至少一个所述细胞。

如本文所用，术语“发酵培养基”是指，用于生产性生物反应器(发酵罐)中的培养基，其含有丰富的营养物质以支持生产菌株的细胞生长和繁殖以及目标产物的产生。如本文所用，术语“种子培养基”是指，用于种子培养以积累用于接种生产性生物反应器的细胞数量的培养基。

术语“工业规模发酵”(也称为大规模发酵)是指发酵罐容积大于或等于20升的发酵工艺。

如本文所用，“增加”红霉素滴度是指，在发酵结束时，例如在发酵6-7天后，与没有任何表面活性剂补充的对照发酵相比，在发酵液中产生了增加的红霉素滴度。所述增加可以表示为每毫升的微克量(μg/ml)，或表示为相对于对照的增加百分比(％)。

本文中，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物也简称为“EO-PO嵌段共聚物”。

在本文中，当提及任何EO-PO嵌段共聚物时，平均分子量是指，根据DIN 53240(1971)测量的OH值计算的平均分子量，其中所述羟值通过在吡啶中与乙酸酐反应、然后滴定游离乙酸来确定。

在本申请中，引用了各种出版物。所有这些出版物的公开内容和在这些出版物中引用的参考文献的全部内容，特此通过引用并入本申请，以便更全面地描述本发明所属的领域的状况。

发明详述

本发明涉及一种包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(即EO-PO嵌段共聚物)的发酵培养基，以及一种在发酵中添加EO-PO嵌段共聚物非离子表面活性剂来生产红霉素的方法。

下面进一步描述本发明主题的各个方面。

EO-PO嵌段共聚物

对于本发明，任何已知可用作非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物都可以用于根据本发明的发酵培养基和根据本发明的红霉素生产方法。

在一个具体实施方案中，可用作根据本发明的红霉素生产方法和发酵培养基中的非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物，可以具有如下式(I)或(II)所示的嵌段排列

其中

式(I)中的m、n和o及式(II)中的p、q和r各自表示相应单元的平均数，且

“—”表示与EO-PO嵌段共聚物的相应剩余残基的连接。

优选地，式(I)中的m和o彼此相等，式(II)中的p和r彼此相等。

在一个优选的实施方案中，可在本发明的红霉素生产方法和发酵培养基中用作非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物，可以是下式(III)表示的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(以下简称EO-PO-EO共聚物)：

HO(CH₂CH₂O)_u(CH(CH₃)CH₂O)_v(CH₂CH₂O)_wH(III)

在一个优选的实施方案中，可在本发明的红霉素生产方法和发酵培养基中用作非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物，可以是下式(IV)表示的聚氧丙烯-聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(以下简称PO-EO-PO)：

HO(CH(CH₃)CH₂O)_x(CH₂CH₂O)_y(CH(CH₃)CH₂O)_zH(IV)

其中，式(III)中的u、v和w及式(IV)中的x、y和z各自表示相应单元的平均数。优选地，式(III)中的u和w彼此相等，式(IV)中的x和z彼此相等。

可在本发明的红霉素生产方法和发酵培养基中用作非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物，可以包含总计至少5％重量，例如6％重量、7％重量、8％重量，9％重量或10％重量或更多的氧乙烯单元。此外，EO-PO嵌段共聚物可包含总计95％重量或更少，例如90％重量、85％重量、84％重量、83％重量、82％重量、81％重量或80％重量或更少的氧乙烯单元。特别地，EO-PO嵌段共聚物包含总计5至95％重量，优选5至90％重量，更优选5至85％重量的氧乙烯单元。

可在本发明的红霉素生产方法和发酵培养基中用作非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物，优选具有至少500g/mol，例如1,000g/mol、1,500g/mol、1,600g/mol、1,700g/mol、1,800g/mol、1,900g/mol或2,000g/mol或更高的平均分子量。此外，EO-PO嵌段共聚物优选具有不大于15,000g/mol，例如14,000g/mol、13,000g/mol、12,000g/mol、11,000g/mol、10,000g/mol、9,000g/mol或更低的平均分子量。特别地，EO-PO嵌段共聚物的平均分子量为500-15,000g/mol，优选1,000-15,000g/mol，更优选1,500-15,000g/mol，最优选1,500-10,000g/mol。

在本发明中，可以在接种时，或者优选地在发酵过程期间，将EO-PO嵌段共聚物添加到发酵培养基中，来提高红霉素的产生。在一个实施方案中，因此，EO-PO嵌段共聚物包含在基础发酵培养基中，或在另一个实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵的生长阶段或生产阶段添加到发酵液中。例如，EO-PO嵌段共聚物可以在发酵的早期阶段、或在发酵的中间或后期阶段添加到发酵液中。在一些实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵的第二天或第三天后添加。在一些实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵3-80小时之间添加，或优选在发酵5-75小时之间添加。在一个优选的实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵8-10小时之间添加。在一个优选的实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵10小时后，或优选15小时后，或更优选20或24小时后添加。在另一个优选的实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵24-72小时之间添加，例如，EO-PO嵌段共聚物可以在约28、30、35、38、40、45、50、55、60、65、68、或70小时添加。在另一个优选的实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵50-70小时之间添加。在另一个更优选的实施方案中，EO-PO嵌段共聚物在发酵35-50小时之间添加。

可在本发明的红霉素生产方法和发酵培养基中用作非离子表面活性剂的EO-PO嵌段共聚物，可以用本领域公知的任何方法制备，或者可以是商业可得的EO-PO嵌段共聚物类型的非离子表面活性剂。合适的商业可得EO-PO嵌段共聚物类型的非离子表面活性剂，包括但不限于，可从BASF获得的

PE系列，例如

PE 3100、

PE 3500、

PE 4300、

PE 6100、

PE 6120、

PE 6200、

PE6400、

PE 6800、

PE 7400、

PE 8100、

PE 9200、

PE9400、

PE 10100、

PE 10300、

PE 10400、

PE 10500；和

RPE系列，例如

RPE 1720、

RPE 1740、

RPE 2035、

RPE 2520、

RPE 2525、

RPE 3110。

优选地，EO-PO嵌段共聚物以适于提高红霉素产量，尤其是在发酵结束时增加发酵液中红霉素滴度的量，用于在发酵培养基中。优选地，EO-PO嵌段共聚物以约0.1g/L至100g/L，更优选约1g/L至50g/L，例如约1g/L至25g/L的量添加到发酵培养基中。在一些优选的实施方案中，EO-PO嵌段共聚物以约1g/L至10g/L的量，特别是以约2g/L-8g/L的量添加到发酵培养基中。例如，EO-PO嵌段共聚物可以以约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L的量，添加到发酵培养基中。

在本发明中，EO-PO嵌段共聚物可以是添加到发酵中的唯一表面活性剂，或可以与其他表面活性剂，例如其他非离子表面活性剂组合使用。所述其他表面活性剂可以选自(可从BASF获得的)：聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，例如

系列(例如

40、60、80和85)；PEG，例如PEG 200、PEG 400、PEG 600、PEG 1000和PEG 2000；乙氧基化大豆油；异十三烷醇烷氧基化物；和动物脂肪醇烷氧基化物。优选地，PEG，例如PEG 400、PEG 600、PEG 1000和PEG 2000，与EO-PO嵌段共聚物组合使用。

发酵培养基

培养微生物通常需要在含有细胞生长和目标产品生产所需的各种营养源的培养基中培养细胞，所述营养源包括例如碳源、氮源和其他营养物质，例如氨基酸、微量元素、矿物质等。适用于发酵的营养成分是本领域熟知的(参见，例如，Peter F Stanbury等人，发酵技术原理，第三版，2017，ELSEVIER SCIENCE&TECHNOLOGY，ISBN：978-08-099953-1)。给定细胞类型的培养条件也可以在科学文献中找到和/或自细胞来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。

在一方面，本发明提供了一种用于生产红霉素的发酵培养基。在一些实施方案中，所述培养基是用于培养红霉素生产微生物，例如糖多孢菌属细菌，或更具体地红色糖多孢菌细胞，的培养基。在一些实施方案中，发酵培养基包含添加到其中的根据本发明的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在一些实施方案中，发酵培养基还包含红霉素生产微生物。

可用于本发明的发酵培养基可以是化学成分确定的培养基或复合培养基。在一些实施方案中，根据本发明的发酵培养基包含碳源、氮源和盐离子，以及任选的一种或多种选自油、微量元素、pH调节剂和消泡剂的其他组分。在一些优选的实施方案中，发酵培养基包含植物油，更优选大豆油或精炼棉籽油。在一些优选实施方案中，发酵培养基包含微量元素，优选选自Co、Cu、Mo、Mn、Zn、Fe、硼酸盐中的至少一种，更优选CuCl₂、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、CoCl₂、Na₂B₄O₇、FeCl₃中的一种或多种。

碳源

可用于发酵的碳源包括各种糖类和含糖物质、脂类、有机酸、醇类、烃类，以及蛋白质的水解产物或氨基酸。在本发明中，可以使用适合支持生产微生物细胞的生长和繁殖和/或目的代谢物生产的任何碳源。

可以提及的合适碳源的实例有：复合碳源，例如糖蜜、玉米浆、蔗糖、糊精、淀粉、淀粉水解物和纤维素水解物，以及它们的组合；和化学成分明确的碳源，例如碳水化合物、有机酸和醇，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、甘油、肌醇、甘露醇和山梨糖醇，以及它们的组合。

不同碳源的微生物利用速度和效率可以不同。在本发明中，快速碳源、慢速碳源或其组合均可使用。快速碳源涉及可以被生产菌株快速利用的碳源，如葡萄糖和其他单糖以及甘油。慢速碳源涉及需要微生物产生酶进行分解的碳源。此类慢速碳源包括例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜和其他二糖以及寡糖和多糖，例如糊精和淀粉。在工业规模发酵中，可以使用快速碳源(如葡萄糖)、慢速碳源(如淀粉)或它们的组合，用于生产红霉素。参见，例如，Fan Daidi等，The improvement of Fermentation Technical Parameters for theErythromycin Production,Chinese Journal of Biotechnology,Vol.15,No.1,January,1999。快速碳源有利于微生物的生长。微生物对慢速碳源的利用速度尽管低于快速碳源，但有利于产品的合成。通过调整培养基中快速碳源和慢速碳源的比例，可以改善红霉素的生物合成。例如，在一些实施方案中，可以在发酵的早期阶段使用更多的快速碳源。在另一个实施方案中，可以在发酵的后期使用更多的慢速碳源。

在一些实施方案中，根据本发明的发酵培养基包含糖和含糖物质作为碳源。在一些实施方案中，根据本发明的发酵培养基包含选自以下的碳源：单糖(例如葡萄糖)、二糖(例如糖蜜、蔗糖、麦芽糖)、寡糖(例如糊精)、多糖(例如淀粉)或其组合。在一个优选的实施方案中，发酵培养基包含选自葡萄糖、蔗糖、糊精、淀粉及其组合的碳源。在另一个优选的实施方案中，发酵培养基包含快速碳源如葡萄糖和慢速碳源如淀粉或糊精的组合。

在一些优选的实施方案中，一种或多种以下碳源以如下浓度(g/l)存在于发酵培养基中：淀粉0.2-55g/l((C₆H₁₀O₅)n,C:44.4％)、葡萄糖1-25g/l(C₆H₁₂O₆,C:40％)、蔗糖10-50g/l(C₁₂H₂₂O₁₁,C:42.1％)和玉米糊精0.1-40g/l(C₁₈H₃₂O₁₆,C:42.9％)。

在一些实施方案中，可以在分批补料发酵过程中，将碳源如葡萄糖浆或糊精糖浆加入发酵液中，来提高红霉素产量。

氮源

可用于发酵的氮源包括无机氮源和有机氮源。根据微生物对氮源的利用速度，氮源也可以分为快速氮源和慢速氮源。快速氮源涉及可以被微生物直接利用的氮源成分，如氨基氮(如氨基酸)或铵态氮(如铵盐)。这种氮源可有利于微生物的生长。慢速氮源涉及不能被细菌直接利用、需要微生物产生酶进行分解后才能被微生物利用的氮源成分，如豆粉和花生粉。这种慢速氮源可有利于目标产物的生物合成。

在本发明中，可以使用无机氮源、有机氮源或其组合。在本发明中，可以使用快速氮源、慢速氮源或其组合。

合适氮源的示例性例子包括，含蛋白质物质，例如植物蛋白、大豆粉、玉米粉、豌豆粉、玉米蛋白粉、棉籽粉、花生粉、马铃薯粉、酪蛋白、明胶、乳清、酵母蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、细菌-胰蛋白胨、细菌-蛋白胨、氨基酸及其组合；无机氮源，例如氨、铵、铵盐(例如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、乙酸铵)、尿素、硝酸、硝酸盐或它们的组合；以及各种氨基酸。

在一个优选的实施方案中，发酵培养基包含选自氨基氮和/或铵态氮的快速氮源，或选自蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、豆粉、花生粉和/或棉籽粉或其组合的慢速氮源。

在另一个优选的实施方案中，发酵培养基包含一种或多种选自以下的氮源：硫酸铵、蛋白胨、玉米浆、酵母提取物、豆粉、棉籽粉、花生粉、玉米蛋白粉和氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸)。优选地，发酵培养基包含豆粉、花生粉、玉米浆和蛋白胨中的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，一种或多种以下氮源以如下浓度(g/l)存在于发酵培养基中：蛋白胨3-45g/l(例如，总氮：12.7％；氨基氮：3.7％)，玉米浆0.05-10g/l(例如，蛋白质≥42％)，酵母浸粉5-20g/l(例如，总氮：10.0％-12.5％；氨基氮：5.1％)，黄豆粉0.5-40g/l(例如，蛋白质≥42％)，棉籽粉10-20g/l(例如，蛋白质≥50％)，玉米蛋白粉1-25g/l(例如，蛋白质20％-70％)，花生粉3-25g/l(例如，蛋白质≥50％)，丙氨酸0.5-2g/l(C₃H₇NO₂，C：40.4％；N：15.7％)，精氨酸0.5-2g/l(C₆H₁₄N₄O₂，C：41.3％；N：32.2％)，丝氨酸0.5-2g/l(C₃H₇NO₃，C：34.3％；N：13.3％)，半胱氨酸0.5-2g/l(C₃H₇NO₂S，C：29.8％；N：11.6％)，缬氨酸1-3g/l(C₅H₁₁NO₂，C：51.3％；N：12.0％)，苏氨酸1-3g/l(C₄H₉NO₃，C：40.3％，N：11.8％)，甲硫氨酸1-3g/l(C₅H₁₁O₂NS，C：40.3％；N：9.4％)，异亮氨酸1-3g/l(C₆H₁₃NO₂，C：55.0％；N：10.7％)，天冬氨酸1-3g/l(C₄H₇NO₄，C：36.1％；N：10.5％)。

在一些实施方案中，在发酵期间可以将诸如硫酸铵的氮源添加到发酵液中，以提高红霉素产量。

油

放线菌类细菌可以使用脂质作为碳源。在发酵过程中，添加豆油等脂质具有消泡和补充碳源的作用，并可以为红霉素的合成提供前体。参见，例如，J.Hamedi,Enhancing oferythromycin production by Saccharopolyspora erythraea with common anduncommon oils,J Ind Microbiol Biotechnol(2004)31:447-456。

根据本发明可以使用的油类物质可以是各种植物油，例如选自向日葵油、阿月浑子籽油、棉籽油、瓜子油、西瓜子油、猪油、玉米油、橄榄油、大豆油、榛子油、油菜籽油、芝麻油、鲨鱼油、红花油、椰子油、核桃油、黑樱桃核仁油和葡萄籽油。大豆油和精炼棉籽油是优选的油。

在一些优选的实施方案中，发酵培养基可以含有0.06-6g/l(例如4或5g/l)的大豆油或4-10g/l(例如5或6g/l)的精炼棉籽油。

可以在发酵开始时将油添加到发酵培养基中，或者在发酵过程中，例如在发酵的中期和/或后期阶段将油加入发酵液中。

微量元素

一些微量元素已被证明可促进生产菌株的增殖和/或红霉素生物合成相关酶的活性(如参与碳水化合物代谢、TCA和红霉素生物合成的酶，诸如甘油醛3-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、甲基丙二酰辅酶A异构酶和甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶)。

因此，在一些实施方案中，可以添加微量元素来增加红霉素发酵滴度。可以使用的微量元素包括但不限于，钼离子；锌离子；锰离子；镁离子；和钴离子。

在一些优选的实施方案中，发酵培养基包含至少一种选自Co、Cu、Mo、Mn、Zn、Fe、硼酸盐的微量元素。微量元素可以以盐的形式存在于培养基中。所述盐可以是例如碱金属盐、碱土金属盐、氯盐、铵盐、磷酸盐和硫酸盐。

在一些优选的实施方案中，发酵培养基包含氯化钴、氯化铜、钼酸铵、四硼酸钠、氯化锰、氯化锌和氯化铁中的一种或多种。在一些优选的实施方案中，发酵培养基包含一种或多种以下盐：CuCl₂；(NH₄₎₆Mo₇O₂₄；CoCl₂；Na₂B₄O₇；FeCl₃，例如CuCl₂和(NH₄₎₆Mo₇O₂₄的组合；或CoCl₂,Na₂B₄O₇和FeCl₃的组合。

在一些优选的实施方案中，一种或多种以下盐以如下浓度(g/l)存在于发酵培养基中：氯化钴0.001-0.1g/l、氯化铜0.0001-0.001g/l、钼酸铵0.00025-0.1g/l，四硼酸钠0.001-0.006g/l，氯化锰0.001-0.1g/l，氯化锌0.01-0.5g/l，氯化铁0.001-0.007g/l。

盐离子

本发明的发酵培养基含有盐离子。可用于生产的无机盐可根据所使用的培养基而变化。此外，可以使用有机盐，例如甜菜碱和氯化胆碱。

可用于本发明的盐离子包括但不限于，硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸三钠、氯化钾、甜菜碱和氯化胆碱。

这些盐离子可以以下浓度存在于培养基中：硫酸铵0.02-5g/l、硫酸镁0.2-2g/l、氯化钠0.02-5g/l、磷酸氢二钾0.8-2g/l、磷酸二氢钾0.25-2g/l，柠檬酸三钠1-4g/l，氯化钾0.1-1.5g/l，甜菜碱0.1-3g/l，氯化胆碱0.3-1g/l。

在一个实施方案中，培养基可以含有一种或多种选自NaCl,K₂HPO₄,KH₂PO₄和MgSO₄的盐离子。

其他培养基成分

可包含在根据本发明的发酵培养基中的其他组分包括但不限于，pH调节剂、消泡剂、和前体。在一些实施方案中，发酵培养基含有pH调节剂，例如CaCO₃，如0.03-8g/l。在一些实施方案中，发酵培养基含有消泡剂。在一些实施方案中，用于红霉素生物合成的前体正丙醇可以在发酵过程中，例如在培养1天后加入到发酵液中。

红霉素生产菌株

可用于本发明的微生物菌株可以是能够在其细胞中产生红霉素的任何天然和基因工程微生物，例如糖多孢菌属、链霉菌属、放线菌属或大肠杆菌(参见例如US20180016585A1)。

可用于本发明的一些微生物可以包括放线杆菌纲(Actinobacteria)菌株，例如假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)，更特别的，糖多孢菌属(Saccharopolyspora)菌株，例如抗微生物糖多孢菌(Saccharopolyspora antimicrobia)、洞穴糖多孢菌(Saccharopolyspora cavernae)、宿雾糖多孢菌(Saccharopolyspora cebuensis)、Saccharopolyspora dendranthemae、沙漠糖多孢菌(Saccharopolyspora deserti)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、黄色糖多孢菌(Saccharopolyspora flava)、Saccharopolyspora ghardaiensis、嘉兰糖多孢菌(Saccharopolyspora gloriosae)、格氏糖多孢菌(Saccharopolyspora gregorii)、嗜盐糖多孢菌(Saccharopolysporahalophila)、耐盐糖多孢菌(Saccharopolyspora halotolerans)、披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)、哈图沙糖多孢菌(Saccharopolyspora hattusasensis)、大麦糖多孢菌(Saccharopolyspora hordei)、印度糖多孢菌(Saccharopolysporaindica)、江西糖多孢菌(Saccharopolyspora jiangxiensis)、盐湖糖多孢菌(Saccharopolyspora lacisalsi)、博他仑糖多孢菌(Saccharopolysporaphatthalungensis)、七角井糖多孢菌(Saccharopolyspora qijiaojingensis)、直杆糖多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)、浅粉色糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)、山东糖多孢菌(Saccharopolyspora shandongensis)、刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)、针脊孢糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosporotrichia)、海绵糖多孢菌(Saccharopolyspora spongiae)、亚热带糖多孢菌(Saccharopolyspora subtropica)、塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)、嗜热糖多孢菌(Saccharopolysporathermophila)、雷公藤糖多孢菌(Saccharopolyspora tripterygii)。

红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)(又名Streptomyceserythraeus，Actinomyces erythreus)用于红霉素的工业化生产。多种糖多孢菌菌株可用于该目的，包括红糖多孢菌菌株ATCC 11635、DSM 40517、JCM 4748、NBRC 13426、NCIMB8594、NRRL 2338。这些菌株在本发明的范围内。在一个优选的实施方案中，本方法中使用的生产菌株是糖多孢菌细胞，优选红色糖多孢菌细胞。

用于红霉素生产的基因工程菌株和突变菌株也是本领域已知的。例如，已经报道，甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)基因mutB的极性敲除，改善红色糖多孢菌(S.erythraea)基于碳水化合物和基于油的红霉素发酵生产。此外，通过复制mmCoA变位酶(MCM)操纵子对甲基丙二酰辅酶A代谢物节点的工程化可以导致红霉素产量增加50％。参见，例如，Xiang Zou等人,Fermentation optimization and industrialization of recombinantSaccharopolyspora erythraea strains for improved erythromycin a production,Biotechnology and Bioprocess Engineering,2010年12月，第15卷，第6期，第959-968页。

已经使用多种方法来改进红霉素生产微生物。目前对红色糖多孢菌中负责红霉素生物合成的基因的理解以及用于基因失活的技术，允许对该通路进行定向操作。参见例如，WO2018226893A2，描述了一种在糖多孢菌属细菌中进行基因组工程化的方法。

本发明涵盖各种红霉素生产微生物、以及通过基因工程、诱变、菌株选择或其他方法产生的变体和突变体。在一些实施方案中，优选地，在根据本发明的方法中使用遗传修饰的或突变的红色糖多孢菌菌株。

发酵工艺

本领域熟知的发酵方法可以根据本发明用于发酵生产菌株。

一般来说，发酵过程包括种子培养和发酵罐发酵。种子培养物用于建立足够数量的细胞用于生产生物反应器的接种。为此目的，可以使用种子培养链(seed train)，其中通过多个规模的培养系统(例如T型烧瓶、滚瓶或摇瓶、小型生物反应器系统和随后的较大型生物反应器)，培养生产菌株的细胞。从种子培养链的最大规模培养系统，向生产生物反应器接种，以生产目标产品。

因此，在一些实施方案中，根据本发明的发酵过程以多个阶段进行，例如两个或三个阶段。例如，在第一阶段，可以通过使用诸如生长在孢子形成培养基上的孢子接种来生长相对较小量的种子培养物；在第二阶段，该初级种子培养物可用于接种第二种子培养基(或在两阶段工艺中，接种发酵培养基)。第二阶段种子培养可以在2L或15L种子罐中进行。在第三阶段，将第二种子培养物接种到发酵罐中的发酵培养基中用于红霉素生产。在发酵过程中，优选地，溶解氧不低于45％。可以控制初级培养基中的营养成分和无机盐的量，以防止孢子生长过快。第二培养基可以含有丰富的营养物质，并且类似于发酵培养基，以促进菌株对发酵的适应。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的发酵过程包括一个以上(例如，两个或三个)种子生长阶段以扩大微生物的数量，以便可以用作发酵阶段的接种物。然而，正如本领域所熟知的，所使用的种子培养物的数量取决于例如发酵步骤的大小和体积。为了开始发酵阶段，可以使用部分或全部种子培养物，接种发酵培养基。

发酵可以以分批工艺进行。在分批工艺中，除了在发酵液中通气和添加本发明的表面活性剂和/或酸或碱pH调节剂外，在整个发酵过程中不向发酵液添加其他营养物质(底物)。

发酵可以以补料分批工艺进行。在此工艺过程中，除了添加本发明的表面活性剂之外，还可以向发酵液添加营养物，例如碳源(例如葡萄糖、糊精)、氮源(例如硫酸铵)、油类(例如大豆油)、和/或正丙醇。

发酵可以以连续工艺进行。连续发酵是一种开放系统，其中将确定的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基用于加工。连续发酵允许调节影响细胞生长和/或产物浓度的一种或多种因素。

可以在锥形瓶或实验室以及各种容量的工业发酵罐中进行发酵。在一个优选的实施方案中，发酵是工业规模的。发酵中的培养基可以是20L至300m³，例如20L至1000L，或1m³至300m³。优选地，发酵具有至少20升，优选至少50升，更优选至少300升，进一步优选至少1000升的培养基。在一些实施方案中，发酵具有至少5m³、10m³、25m³、50m³、100m³、200m³或高达300m³的培养基。

可以根据本领域已知的标准条件，应用发酵时间、pH、温度、溶解氧或其他特定发酵条件。但优选地，调节发酵条件以获得目标产物的最大产率。

优选地，发酵期间发酵液的温度为大约25℃至40℃，优选大约28℃至35℃，更优选大约34℃。优选地，发酵期间发酵液的pH控制在pH 6.0至7.5，例如pH 6.3至7.5，优选pH6.5至7.3，更优选6.7至7.3。优选地，发酵期间的发酵罐压力控制在0.02至0.08MPa，优选0.03至0.05MPa。优选地，在发酵过程的稳定期发酵液中的生物量浓度控制在20至50g/L细胞干重。

优选地，发酵在搅拌和通气下进行。通气比可以表示为空气体积/培养体积/分钟(vvm,m³/(m³*min))。在一个优选实施方案中，发酵过程中，通气比控制在0.5-3vvm(优选2.0-3.0vvm)，搅拌速率控制在120-350rpm(优选180-300rpm)。

在一些实施方案中，发酵时间可为50-200小时，优选100-200小时，例如约130-170小时。

在一个优选的实施方案中，发酵包括在预先灭菌的液体培养基中，在有氧条件下，在28至37℃(优选约34℃)的温度，培养生产微生物3至9天(优选6-7天)，期间pH值控制在pH6.3至7.5的范围内。进一步优选地，发酵在发酵罐压力0.02至0.08MPa(优选0.03至0.05MPa)下、使用通气比0.5至3vvm(优选2.0至3.0vvm)和搅拌速率120至350rpm(优选180-300rpm)进行。

可以通过从发酵中取出样品并使用任何已知方法例如比色法、色谱法测定来监测红霉素的生产。例如，可以以市售的红霉素作为标准品，使用化学测定法或生物测定法，来确定在摇瓶或生物反应器培养物中产生的红霉素滴度。在一个例子中，基于红霉素与磷酸反应并监测485nm处的吸光度，通过比色法，定量测定发酵液中存在的总红霉素。关于所述比色法的更多细节，参见例如张宇等人，发酵液中红霉素的含量测定，中国酿造，2011，第5期。

发酵可以持续直至获得最大产量，例如持续6-7天。之后，可以使用本领域的任何常规方法，从发酵液中回收、从粗产物溶液中浓缩和纯化得到产物红霉素。

本发明在以下实施例中进一步举例说明，这些实施例不旨在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。

实施例

以下实施例仅用于举例说明本发明。对本领域技术人员来说显而易见的，许多可能的变化也落入本发明的范围内。

除非另有说明，否则在以下实验中应用的设备、方法、化学品和生物化学品为在基因工程和微生物发酵生产化学化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品。

材料和方法

化学品:(均可自BASF商购获得)

PEG-1:平均分子量为400的聚乙二醇；

PEG-2:平均分子量为600的聚乙二醇；

PEG-3:平均分子量为1000的聚乙二醇；

PEG-4:平均分子量为2000的聚乙二醇；

EO-PO共聚物-1：平均分子量为6500，EO单元为50％重量的EO-PO-EO嵌段共聚物；

EO-PO共聚物-2：平均分子量为3500，EO单元为10％重量的EO-PO-EO嵌段共聚物；

EO-PO共聚物-3：平均分子量为8000，EO单元为80％重量的EO-PO-EO嵌段共聚物，；

EO-PO共聚物-4：平均分子量为2900，EO单元为40％重量的EO-PO-EO嵌段共聚物；

EO-PO共聚物-5：平均分子量为2150，EO单元为20％重量的PO-EO-PO嵌段共聚物；

EO-PO共聚物-6：平均分子量为2650，EO单元为40％重量的PO-EO-PO嵌段共聚物；

EO-PO共聚物-7：平均分子量为3100，EO单元为20％重量的PO-EO-PO嵌段共聚物；

EO-PO共聚物-8：平均分子量为3500，EO单元为10％重量的PO-EO-PO嵌段共聚物；

表面活性剂1：乙氧基化(10EO)大豆油；

表面活性剂2：C₁₃-Oxo醇+8EO

表面活性剂3：乙氧基化(11EO)脂肪醇(C₁₆-C₁₈)

红霉素生产菌株

红色糖多孢菌用于实施例中的红霉素生产。

发酵液中红霉素滴度的测定方法

发酵液中红霉素滴度采用比色法测定。简而言之，将0.8ml稀释的发酵液(估计滴度为300-700ug/ml)移液到10ml比色管中。加入4ml 10mol/L磷酸溶液，混合均匀。将混合物放入80℃水浴中3min，然后在水浴中冷却。加入10mol/L磷酸溶液至10ml，混合均匀后，用分光光度计在485nm处测定该混合溶液的吸光度。取0.8mL相同稀释发酵液但未经80℃水浴处理作为对照。分光光度计根据对照进行校准。使用浓度为100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、500ug/ml和800ug/ml的红霉素标准样品，绘制红霉素滴度的标准曲线(485nm吸光度vs.ug/ml浓度)。参照标准曲线确定发酵液的红霉素滴度(y＝0.00070x-0.00539，R²＝0.00702)。

初步筛选实验

为研究不同种类和浓度的表面活性剂对红霉素生产的影响，通过摇瓶发酵试验和5L发酵罐发酵试验，筛选适合红霉素生产的表面活性剂。

用于测定的培养基

平板培养基含有(％)：淀粉，10；NaCl，3；玉米糖浆，13；(NH₄)₂SO₄,3；CaCO₃,3；琼脂，20。灭菌前将pH调节至7.0。

摇瓶种子培养基含有(g/l)：淀粉，40；胰蛋白胨，20；NaCl，4；糊精，20；葡萄糖，10；KH₂PO₄,0.2；MgSO₄.7H₂O,0.25；CaCO₃,6。在灭菌前，将pH值调节至7.0。

发酵培养基含有(g/l)：葡萄糖，22；K₂HPO₄,1.2782；KH₂PO₄,0.6391；MgSO₄·7H₂O,1；丙氨酸，0.686；精氨酸，0.5472；半胱氨酸，0.6251；丝氨酸，0.587；柠檬酸三钠，2.2841；微量元素，10mL/L。灭菌前将pH调节至7.0。

培养条件和培养方法

平板培养

将储存在甘油管中的菌株在平板灭菌培养基上于34℃培养10天。

摇瓶种子培养

在装有50ml摇瓶种子培养基的500ml摇瓶中，接种在1cm²平板培养基上生长的孢子，并在34℃、220rpm下培养48h。

摇瓶发酵

将1ml培养的摇瓶种子培养物转移到装有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在220rpm和34℃下培养144h。

5L发酵罐发酵

收获并汇集6瓶种子培养物，然后转移到含有2.8L发酵培养基的5L发酵罐中。发酵温度控制在34℃左右。通过控制搅拌速率和通气量，使发酵液中的溶解氧保持在40％以上。

摇瓶试验

选择下表A中所示的表面活性剂用于500ml摇瓶发酵。在发酵的第二天，将5g/L的表面活性剂加入到培养液中。发酵5天后，测定发酵液中的红霉素滴度。没有任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。结果如表A所示。

表A.用于表面活性剂筛选的摇瓶测定试验中的红霉素滴度

表面活性剂补充	表面活性剂剂量(g/L)	滴度(μg/ml)
			无表面活性剂添加	5	260.0
EO-PO共聚物-1	5	312.1
			EO-PO共聚物-7	5	312.1
EO-PO共聚物-8	5	308.8
			表面活性剂2	5	101.2
PEG-1	5	305.3
			PEG-3	5	262.9

在500ml摇瓶发酵试验中以不同浓度测试了EO-PO共聚物(EO-PO共聚物-7)。在发酵的第二天，将三种浓度(1g/L、5g/L和20g/L)的EO-PO嵌段共聚物加入到发酵液中。发酵5天后，测定发酵液中的红霉素滴度。没有任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。结果如表B所示。

表B.不同剂量EO-PO共聚物7在摇瓶测定试验中的红霉素滴度

表面活性剂补充	表面活性剂剂量(g/L)	滴度(μg/ml)
			无表面活性剂添加	-	260.0
EO-PO共聚物-7	1	305.2
			EO-PO共聚物-7	5	312.1
EO-PO共聚物-7	20	305.9

上述摇瓶测定试验结果表明，可以在相对较宽的剂量范围内添加EO-PO共聚物，以提高红霉素滴度。

5L发酵罐发酵试验

选择下表C中所示的表面活性剂用于5L发酵罐发酵。在发酵约24小时后，在发酵的第二天，将5g/L的表面活性剂加入到发酵液中。发酵156小时后，测定发酵液中的红霉素滴度。没有任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。结果如表C所示。

表C.用于表面活性剂筛选的5L发酵罐发酵试验中的红霉素滴度

基于上述初步筛选试验，在5L或50L发酵中进一步研究本发明的EO-PO嵌段共聚物表面活性剂，以验证它们对红霉素生产的影响。

实施例1

在孢子形成培养基平板上生长红色糖多孢菌的孢子。然后，将1cm²培养基上的孢子接种到装有50ml种子培养基的500ml Erlenmeyer瓶中，并在34℃和220rpm下培养48小时。种子培养基组成为(g/l)：淀粉，40；蛋白胨，20；NaCl，4；糊精，20；葡萄糖，10；KH₂PO₄,0.2；MgSO₄·7H₂O,0.25；CaCO₃,3。在培养基灭菌前将pH调节至7.0。

将10％(v/v)的种子培养物接种到含有2.5L基础发酵培养基的5L发酵罐中。基础发酵培养基的组成为(g/l)：淀粉，50；酵母提取物，5；NaCl，2；(NH₄)₂SO₄,2；CaCO₃,5；黄豆饼粉，35；豆油，4；消泡剂，0.3。在培养基灭菌前将pH调节至7.0。

发酵在pH 6.7-7.5，通气比3.0vvm，发酵罐压力0.05MPa，发酵温度34℃，搅拌速率250rpm进行。在发酵过程中，稳定期的生物量浓度控制在40-50g菌体干重。在发酵54小时，将5g/L灭菌的表面活性剂加入发酵罐中。未添加任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。发酵液在156小时从发酵罐中放出。放罐时发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比如表1所示。

表1.发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比

如表1所示，加入本发明的表面活性剂增加红霉素滴度。而且，EO-PO共聚物引起的滴度增加(29％至36％)约为基于PEG的表面活性剂引起的滴度增加(9.1％至13％)的2至3倍。

实施例2

将10％(v/v)的种子培养物接种到含有2.5L基础发酵培养基的5L发酵罐中。基础发酵培养基的组成为(g/l)：淀粉，50；玉米糊精，20；棉籽饼粉，15；黄豆饼粉，35；KH₂PO₄,1.5；K₂HPO₄,0.6；MgSO₄·7H₂O,1.5；CaCO₃,4；CuCl₂.2H₂O,0.00030；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O,0.00030；；豆油,5；消泡剂,0.3。在培养基灭菌之前将pH调节至7.0。

发酵条件为pH 6.7-7.5，通气比2.0vvm，发酵罐压力0.03MPa，发酵温度34℃，搅拌速率180rpm。在发酵过程中，稳定期的生物量浓度控制在20-50g菌体干重。在发酵64小时，将5g/L灭菌的表面活性剂加入发酵罐中。未添加任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。发酵液在156小时从发酵罐中放出。放罐时发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比如表2所示。

表2.发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比

如表2所示，采用不同的发酵培养基，本发明的表面活性剂仍导致了增加的红霉素滴度，且优于常规的PEG表面活性剂。

实施例3

采用20L发酵罐培养种子，培养温度34℃，通气比0.8vvm，罐压0.04MPa，搅拌速率200rpm。种子培养基的组成为(g/l)：淀粉，40；蛋白胨，20；NaCl，4；糊精，20；葡萄糖，10；KH₂PO₄,0.2；MgSO₄·7H₂O,0.25；CaCO₃,3。在培养基灭菌前将pH调节至7.0。

将10％(v/v)的种子培养物接种到含有25L基础发酵培养基的50L发酵罐中。基础发酵培养基的组成为(g/l)：淀粉，50；蛋白胨，45；玉米蛋白粉，15；花生饼粉，10；NaCl，2；(NH₄)₂SO₄,1.5；CaCO₃,5；；精炼棉籽油，5。培养基灭菌前将pH调至7.0。

发酵使用pH 6.7-7.3，通气比3.0vvm，发酵罐压0.04MPa，发酵温度34℃，搅拌速率250rpm。在发酵过程中，稳定期的生物量浓度控制在40-50g菌体干重。在发酵8小时，将5g/L灭菌的表面活性剂加入发酵罐中。没有任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。发酵液在156小时从发酵罐中放出。放罐时发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比如表3所示。

表3.发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比

如表3所示，随着工艺放大，本发明的表面活性剂仍导致了红霉素滴度增加，并且优于常规的基于PEG的表面活性剂。

实施例4

采用20L发酵罐培养种子，培养温度34℃，通气比0.8vvm，发酵罐压0.04MPa，搅拌速率200rpm。种子培养基的组成为(g/l)：淀粉，40；蛋白胨，20；NaCl，4；糊精，20；葡萄糖，10；KH₂PO₄,0.2；MgSO₄.7H₂O,0.25；CaCO₃,3。在培养基灭菌前将pH调节至7.0。

将10％(v/v)的种子培养物接种到含有25L基础发酵培养基的50L发酵罐中。基础发酵培养基的组成为(g/l)：葡萄糖，20；玉米糊精，25；蛋白胨，40；玉米浆，6；缬氨酸，1.23；苏氨酸，1.38；甲硫氨酸，1.37；异亮氨酸，1.53；K₂HPO₄，1.73；KH₂PO₄，0.94；MgSO₄·7H₂O，2；CoCl₂·6H₂O，0.008；Na₂B₄O₇·10H₂O，0.07；FeCl₃·6H₂O，0.007；甜菜碱，1.5；精炼棉籽油，5；消泡剂，0.3。在培养基灭菌之前将pH调节至7.0。

发酵使用pH 6.7-7.3，通气比2.5vvm，发酵罐压0.03MPa，发酵温度34℃，搅拌速率250rpm。在发酵过程中，稳定期的生物量浓度控制在20-40g菌体干重。在发酵45小时，将5g/L灭菌的表面活性剂加入发酵罐中。没有任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。发酵液在156小时从发酵罐中放出。放罐时发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比如表4所示。

表4.发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比

如表4所示，采用与实施例3相同的工艺放大，但采用不同的发酵培养基和不同的表面活性剂进料时间，本发明的表面活性剂再次导致了红霉素滴度增加。

实施例5

采用三阶段发酵工艺生产红霉素。

采用2L发酵罐进行培养一级种子，培养温度34℃，通气比0.8vvm，罐压0.04MPa，搅拌速率200rpm。一级种子培养基的组成为(g/l)：淀粉，40；蛋白胨，20；NaCl，4；糊精，20；葡萄糖，10；KH₂PO₄,0.2；MgSO₄·7H₂O,0.25；CaCO₃,3。在培养基灭菌前将pH调节至7.0。

将一级种子培养物全部倒入20L发酵罐中，其中装有10L二级种子培养基用于种子扩大培养，发酵温度34℃，通气比1.0vvm，罐压0.05MPa，搅拌速率200rpm。二级种子培养基的组成为(g/l)：玉米粉，28；K₂HPO₄,0.4；NaCl,0.9；玉米蛋白粉，18；花生饼粉，15；葡萄糖，6；CaCO3,2；玉米浆，7；消泡剂，0.3。在培养基灭菌之前将pH调节至7.0。

将10％(v/v)的二级种子培养物接种到含有25L基础发酵培养基的50L发酵罐中，进行三级发酵培养。基础发酵培养基的组成为(g/l)：淀粉，30；酵母提取物，5；糊精，40；黄豆饼粉，30；KH₂PO₄,5；(NH₄)₂SO₄,2；CaCO₃,6；；氯化胆碱，0.6；豆油，5。在培养基灭菌前将pH调节至7.0。

发酵使用pH 6.7-7.3，通气比2.8vvm，发酵罐压0.05MPa，发酵温度34℃，搅拌速率300rpm。在发酵过程中，稳定期的生物量浓度控制在40-50g/L菌体干重。在发酵38小时，将5g/L灭菌的表面活性剂加入发酵罐中。没有任何表面活性剂补充剂的发酵用作对照。发酵液在156小时从发酵罐中放出。放罐时发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比如表5所示。

表5.发酵液中红霉素的滴度和相对于对照的增加百分比

如表5所示，采用三阶段工艺，本发明的表面活性剂导致红霉素滴度显著增加。

Claims

1.一种通过生产菌株发酵用于生产红霉素的方法，包括将聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物非离子表面活性剂添加到发酵培养基中。

2.前述权利要求的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物包含总计5至95％重量，优选5至90％重量，更优选5至85％重量的氧乙烯单元。

3.前述权利要求的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的平均分子量为500至15,000g/mol，优选1,000至15,000g/mol，更优选1,500至15,000g/mol，最优选1,500至10,000g/mol。

4.前述权利要求的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物具有如式(I)或(II)所示的嵌段排列

-(CH₂CH₂O)_m(CH(CH₃)CH₂O)_n(CH₂CH₂O)_o- (I)

-(CH(CH₃)CH₂O)_p(CH₂CH₂O)_q(CH(CH₃)CH₂O)_r- (II)

其中

式(I)中的m、n和o及式(II)中的p、q和r各自表示相应单元的平均数，优选式(I)中的m和o彼此相等，式(II)中的p和r彼此相等，

“—”表示与EO-PO嵌段共聚物的相应剩余残基的连接。

5.前述权利要求的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物由式(III)或(IV)表示

HO(CH₂CH₂O)_u(CH(CH₃)CH₂O)_v(CH₂CH₂O)_wH (III)

HO(CH(CH₃)CH₂O)_x(CH₂CH₂O)_y(CH(CH₃)CH₂O)_zH (IV)

其中式(III)中的u、v和w及式(IV)中的x、y和z各自表示相应单元的平均数，优选式(III)中的u和w彼此相等，式(IV)中的x和z彼此相等。

6.前述权利要求的方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物用作发酵中的唯一表面活性剂，或与其他表面活性剂例如非离子表面活性剂组合使用。

7.前述权利要求的方法，其中在发酵的3至80小时，优选5至75小时，更优选24至72小时，例如约28、30、35、38、40、45、50、60、65、68、或70小时，添加聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

8.前述权利要求的方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的添加量为0.1g/L至100g/L，优选1g/L至50g/L，更优选1g/L至25g/L，更优选1g/L至10g/L，最优选2g/L至8g/L。

9.前述权利要求的方法，其中所述发酵在pH 6.0至7.5，例如pH 6.3至7.5下进行。

10.前述权利要求的方法，其中所述发酵在约25℃至40℃，优选约28-35℃，更优选约34℃的发酵温度下进行。

11.前述权利要求的方法，其中所述发酵使用0.5-3vvm、优选2.0-3.0vvm的通气比和120-350rpm、优选180-300rpm的搅拌速率进行。

12.前述权利要求的方法，其中发酵罐压力控制在0.02-0.08MPa，优选0.03-0.05MPa。

13.根据前述权利要求所述的方法，其中，在发酵过程中稳定期的发酵液中生物量浓度被控制在20至50g/L细胞干重。

14.前述权利要求的方法，其中所述发酵培养基包含碳源、氮源和盐离子，以及任选地一种或多种选自油、微量元素、pH调节剂和消泡剂的其他组分。

15.前述权利要求的方法，其中所述发酵培养基包含植物油，更优选大豆油或精炼棉籽油。

16.前述权利要求的方法，其中所述发酵培养基包含微量元素，优选至少一种选自Co、Cu、Mo、Mn、Zn、Fe、硼酸盐的微量元素，更优选地，CuCl₂,(NH₄)₆Mo₇O₂₄,CoCl₂,Na₂B₄O₇和FeCl₃中的一种或多种。

17.前述权利要求的方法，其中所述发酵培养基包含碳源，其中所述碳源包含糖和含糖物质；优选地，所述发酵培养基包含选自单糖、二糖、寡糖、多糖及其组合的碳源；更优选地，发酵培养基包含选自葡萄糖、蔗糖、糊精、淀粉及其组合的碳源，或者发酵培养基包含快速碳源如葡萄糖和慢速碳源例如淀粉或糊精的组合。

18.前述权利要求的方法，其中所述发酵培养基包含快速氮源、慢速氮源、或快速和慢速氮源的组合；优选地，发酵培养基包含一种或多种选自以下的氮源：植物蛋白、豆粉、玉米粉、豌豆粉、玉米蛋白、棉籽粉、花生粉、马铃薯粉、酪蛋白、明胶、乳清、酵母蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、细菌胰蛋白胨、细菌蛋白胨、氨基酸、氨、铵、铵盐、尿素、硝酸、硝酸盐及其组合；更优选地，发酵培养基包含选自硫酸铵、蛋白胨、玉米浆、酵母提取物、豆粉、棉籽粉、花生粉、玉米蛋白粉和氨基酸中的一种或多种氮源，再更优选，发酵培养基包含豆粉、花生粉、玉米浆、蛋白胨中的一种或几种。

19.前述权利要求的方法，其中所述发酵包括一个以上(例如，两个或三个)种子生长阶段。

20.前述权利要求的方法，其中所述发酵是工业规模发酵。

21.前述权利要求的方法，其中所述生产菌株是糖多孢菌细胞，优选地，红色糖多孢菌细胞。

22.前述权利要求的方法，其中相对于没有任何表面活性剂补充剂的对照发酵，发酵液中的红霉素滴度增加，优选地，增加量为至少15％、优选地至少20％、至少25％，至少30％，或至少35％。

23.聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，优选如权利要求2至5中任一项所定义的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，在发酵生产红霉素中的用途。

24.一种用于生产红霉素的发酵培养基，其包含如权利要求2至5中任一项所定义的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

25.根据权利要求24所述的发酵培养基，其中所述发酵培养基是化学成分确定的发酵培养基或复合发酵培养基。

26.前述权利要求24和25的发酵培养基，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的存在量为0.1g/L至100g/L，优选1g/L至50g/L，更优选1g/L至25g/L，更优选1g/L至10g/L，最优选2g/L至8g/L。

27.前述权利要求24至26的发酵培养基，其中所述发酵培养基具有pH 6.0至7.5的pH，例如pH 6.3至7.5。

28.前述权利要求24至27所述的发酵培养基，其中所述发酵培养基包含碳源、氮源和盐离子，以及任选地选自油、微量元素、pH调节剂和消泡剂中的一种或多种其他成分。

29.前述权利要求24至28的发酵培养基，其中所述发酵培养基包含植物油，更优选大豆油或精炼棉籽油。

30.如前述权利要求24至29所述的发酵培养基，其中所述发酵培养基包含微量元素，优选至少一种选自Co、Cu、Mo、Mn、Zn、Fe、硼酸盐的微量元素，更优选地，CuCl₂,(NH₄)₆Mo₇O₂₄,CoCl₂,Na₂B₄O₇和FeCl₃中的一种或多种。

31.前述权利要求24至30的发酵培养基，其中所述发酵培养基包含碳源，其中所述碳源包含糖和含糖物质；优选地，所述发酵培养基包含选自单糖、二糖、寡糖、多糖及其组合的碳源；更优选地，发酵培养基包含选自葡萄糖、蔗糖、糊精、淀粉及其组合的碳源，或者发酵培养基包含快速碳源如葡萄糖和慢速碳源例如淀粉或糊精的组合。

32.前述权利要求24至31的发酵培养基，其中所述发酵培养基包含快速氮源、慢速氮源、或快速和慢速氮源的组合；优选地，发酵培养基包含一种或多种选自以下的氮源：植物蛋白、豆粉、玉米粉、豌豆粉、玉米蛋白、棉籽粉、花生粉、马铃薯粉、酪蛋白、明胶、乳清、酵母蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、细菌胰蛋白胨、细菌蛋白胨、氨基酸、氨、铵、铵盐、尿素、硝酸、硝酸盐及其组合；更优选地，发酵培养基包含选自硫酸铵、蛋白胨、玉米浆、酵母提取物、豆粉、棉籽粉、花生粉、玉米蛋白粉和氨基酸中的一种或多种氮源；再更优选，发酵培养基包含豆粉、花生粉、玉米浆、蛋白胨中的一种或几种。

33.前述权利要求24至32的发酵培养基，其中所述发酵培养基包含红霉素生产菌株，例如糖多孢菌细胞，优选红色糖多孢菌细胞。