CN107653285A - 一种利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基及其发酵方法，其培养基包括用淀粉、玉米浆、硫酸铵、轻质碳酸钙、硫酸锌、硫酸镁和适量消沫剂组成的种子培养基及用淀粉、玉米浆、硫酸铵、碳酸钙、硫酸镁、硫酸锌和适量消沫剂组成的发酵培养基。本发明通过对种子及发酵培养基的配方结构改变，补料的配方结构及控制方式改变，引入几种微量元素，改变了菌体的代谢途径，从而由三级发酵缩短为二级发酵，节约发酵时间；同时降低了发酵原材料成本，稀化了发酵培养基，改善了发酵过程中的供氧，降低了供氧的能源消耗，通过本发明的工艺实施，红霉素发酵水平有了较明显的提高，产品中红霉素E降低明显。

Description

一种利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基及其发酵方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基及其发酵方法。

背景技术

红霉素(erythromycin，Er)是一类大环内酯类抗生素，主要包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)和红霉素E(ErE)等组分，其中以红霉素A的抗菌活力最强，B、C、E抗菌活力较低。红霉素发酵是采用一种放线菌作为产生菌种，经过复壮、分离、孢子培养制备成斜面孢子备用，然后将斜面孢子接入种子罐进行种子扩大培养，最后接入发酵培养基，通过控制培养温度、pH、基质浓度等控制菌体的初级、次级代谢，使菌体合成红霉素的过程。

现有技术中，红霉素发酵多采用三级发酵模式，红霉素种子、发酵、补料培养基中含有大量的固体迟效有机氮源，包括黄豆饼粉、酵母粉等，固含量大于6%，这些迟效有机氮源在常规发酵中非常重要，直接影响到发酵水平。但黄豆饼粉等迟效有机氮源的使用增加了发酵液的粘度，影响了供氧，且在发酵后期存在利用不彻底的现象，迟效碳源如油脂类物质的补入也存在利用不彻底的现象，并造成菌体耗氧量增大，所以迟效碳氮源的使用不仅造成原材料浪费，而且在发酵液放罐时大量的残留碳源给后续提取造成困难。

综上，大量黄豆饼粉等迟效有机氮源的使用，造成红霉素发酵水平不高，发酵水平提高难度大，发酵工艺改变空间小，工艺突破难度大。而且红霉素发酵补料中通常是利用豆油、菜子油、棉籽油等天然植物油脂作为发酵过程菌体利用的主要碳源物质，植物油脂在被菌体分解过程中存在着油脂分解不彻底的现象，利用速度慢，分解利用滞后，造成发酵液中残留油脂较多，从而影响发酵液的过滤速度及产品质量，发酵单位偏低，并加大原材料的消耗量，发酵成本较高。

目前，我国已成为生物发酵行业的第一大国，发酵行业的环保问题、粮食类原材料的消耗问题亟待解决，进一步提高其工业发酵水平、节能降耗、减少排放是当前提高该产品的国际竞争力的迫切需求。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种通过减少发酵过程中迟效有机氮源的使用和降低补料系统中迟效碳源油脂的使用，改变发酵培养基的组成结构，从而有效提高发酵水平，降低原材料消耗，降低发酵成本，提高发酵水平，改善发酵液组分的利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基。

本发明的另一目的是提供利用红色链霉菌发酵生产红霉素的发酵方法。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于

所述种子培养基组成为：淀粉1～3%，玉米浆2～4%，硫酸铵0.15～0.55%，轻质碳酸钙0.3～0.8%，硫酸锌0.01～0.03%，硫酸镁0.1～0.3%，适量消沫剂，其余为水，以重量百分比计；

所述发酵培养基组成为：淀粉2.0～4.0%，玉米浆2.0～4.0%，硫酸铵0.1～0.4%，碳酸钙0.7～1.0%，硫酸镁0.05～0.3%，硫酸锌0.01～0.05%，适量消沫剂，其余为水，按重量体积比计。

一种利用上述培养基发酵生产红霉素的发酵方法，其特征在于采用由种子培养和发酵培养构成的二级发酵模式发酵生产红霉素。

所述种子培养条件为：培养温度33～35℃，通气量1：0.7～1.0v/v/min，培养时间40～50hr。

所述发酵培养条件为：培养温度32～36℃，溶氧大于30%，培养时间160～180hr。

在所述发酵培养过程中进行补料，包括补氨、补糖和补正丙醇，

其中补氨：当发酵液中氨基氮含量降至30%以下时开始通入氨水，控制发酵液中氨基氮含量15～30%，氨水质量浓度为10～15%；

补糖：当发酵液中总糖降至1.5%以下时开始补入葡萄糖溶液，控制发酵液中总糖0.5～1.5%，葡萄糖溶液质量浓度为20～30%；

补正丙醇是指在发酵20hr后补入质量浓度为30～35%的正丙醇，控制发酵液中正丙醇含量0.01～0.05%。

本发明通过对种子及发酵培养基的配方结构改变，补料的配方结构及控制方式改变，引入几种微量元素，改变了菌体的代谢途径，从而由原工艺的三级发酵缩短为二级发酵，节约发酵时间20～30hr；同时本发明的种子及发酵培养基中去除了黄豆饼粉及豆油的使用，补料过程不补植物油，从而降低了发酵原材料成本，稀化了发酵培养基，改善了发酵过程中的供氧，降低了供氧的能源消耗，通过本发明的工艺实施，红霉素发酵水平有了较明显的提高，产品中红霉素E降低明显。

本发明同现有技术相比，具有以下技术优势：

1）现有技术采用二级发酵，发酵时间缩短了20～30hr。

2）本发明的种子及发酵培养基配方中没有迟效有机氮源黄豆饼粉，没有迟效碳源豆油，增加几种微量元素，培养基稀化，有效增加供氧，降低原材料成本约20%以上。代谢过程中减少迟效碳氮源的残留，减少有机物的排放约15%以上。培养基稀化，减少油脂利用，供氧能力提高，耗氧水平降低，降低供氧通气能耗10%以上。

3）采用本发明的培养基及补料工艺进行红霉素发酵，发酵代谢稳定，发酵时间可以控制在165～180小时，发酵效价提高10%以上，红霉素E降低25%以上。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例中的斜面孢子是按常规方法将红霉素链霉菌接到灭菌好的斜面培养基中培养7～9天，得到红霉素斜面孢子。

实施例1

1.种子培养：

种子培养基组成：淀粉1.2%，玉米浆2.0%，硫酸铵0.15%，轻质碳酸钙0.35%，硫酸锌0.01%，硫酸镁0.1%，适量消沫剂，其余为水，以重量百分比计。灭菌备用。

将斜面孢子接种于灭菌好的种子培养基中培养，培养温度33℃，通气量1：0.7v/v/min，搅拌，培养41hr得种子液。

2.发酵培养：

将过程1所得的种子液按25%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度32～34℃，通气，搅拌，控制发酵过程溶氧30%以上，培养过程中监测氨基氮和总糖：当发酵液中氨基氮含量降至30%以下时通氨，控制氨基氮含量20～25%，总糖降至1.5%以下时开始补糖，控制总糖0.5～0.8%；发酵20hr后补入30～35%的正丙醇，培养至165～170hr停止发酵，得含有红霉素的发酵液。

其中发酵培养基组成：淀粉2.0%，玉米浆2.2%，硫酸铵0.18%，碳酸钙0.72%，硫酸镁0.1%，硫酸锌0.01%，适量消沫剂，其余为水，按重量体积比计。

正丙醇浓度30%，其补入量以始终控制发酵液中丙醇含量0.04～0.06%为宜。

检测指标：放罐红霉素效价8820u/ml，红霉素E效价458u/ml。

实施例2

1.种子培养：

种子培养基组成：淀粉2.0%，玉米浆3.0%，硫酸铵0.35%，轻质碳酸钙0.62%，硫酸锌0.02%，硫酸镁0.2%，适量消沫剂，其余为水，以重量百分比计。灭菌备用。

将斜面孢子接种于灭菌好的一级种子培养基中培养，培养温度34℃，通气量1：0.8v/v/min，搅拌，培养45hr得种子液。

2.发酵培养：

将过程1所得的种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度34～35℃，通气，搅拌，控制发酵过程溶氧30%以上，培养过程中监测氨基氮和总糖：当发酵液中氨基氮降至30%以下时通氨，控制氨基氮含量25～30%，总糖降至1.5%以下时开始补糖，控制总糖1.0～1.3%；发酵20hr后补入30～35%的正丙醇，培养至170～175hr时停止发酵，得含有红霉素的发酵液。

其中发酵培养基组成：淀粉3.0%，玉米浆3.0%，硫酸铵0.3%，碳酸钙0.85%，硫酸锌0.03%，硫酸镁0.2%，适量消沫剂，其余为水，按重量体积比计。

正丙醇浓度30%，其补入量以始终控制发酵液中丙醇含量0.04～0.06%为宜。

检测指标：放罐红霉素效价8879u/ml，红霉素E效价472u/ml。

实施例3

1.种子培养：

种子培养基组成：淀粉3%，玉米浆4%，硫酸铵0.55%，轻质碳酸钙0.8%，硫酸锌0.03%，硫酸镁0.3%，适量消沫剂，其余为水，以重量百分比计。灭菌备用。

将斜面孢子接种于灭菌好的一级种子培养基中培养，培养温度35℃，通气量1：1.0v/v/min，搅拌，培养50hr得种子液。

2.发酵培养：

将过程1所得的种子液按15%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度34～35℃，通气，搅拌，控制发酵过程溶氧30%以上，培养过程中监测氨基氮和总糖：当发酵液中氨基氮含量降至30%以下时通氨，控制氨基氮含量20～25%，总糖降至1.5%以下时开始补糖，控制总糖0.5～0.8%；发酵20hr后补入30～35%的正丙醇，培养至175～180hr得含有红霉素的发酵液。

其中发酵培养基组成：淀粉4.0%，玉米浆4.0%，硫酸铵0.4%，碳酸钙1.0%，硫酸镁0.3%，硫酸锌0.05%，其余为水，适量消沫剂，按重量体积比计。

正丙醇浓度35%，其补入量以始终控制发酵液中丙醇含量0.05～0.07%为宜。

检测指标：放罐红霉素效价8938u/ml，红霉素E效价439u/ml。

对比实施例

1.一级种子培养：

将斜面孢子接种于灭菌好的一级种子培养基中培养，培养温度35～36℃，通气量1：1.2～1.5v/v/min，搅拌，培养50～60hr得一级种子液。

一级种子培养基组成：淀粉2%，糊精1.0%，黄豆饼粉2.5%，硫酸铵0.4%，玉米浆0.4%，氯化钠0.4%，碳酸钙1.0%，豆油0.2%，其余为水；在122～124℃，保压30分钟。

2.二级种子培养：

将一级种子液按接种量15%接种于灭菌好的二级种子培养基中培养，培养温度34～35℃，通气量1：1.2～1.5v/v/min，搅拌，培养26～28hr得二级种子液。

二级种子培养基组成：淀粉3.0%，糊精1.0%，黄豆饼粉3.0%，硫酸铵0.2%，玉米浆0.5%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.8%，豆油0.2%，其余为水；在122～124℃，保压30分钟。

3.发酵培养：

将二级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度32～34℃，通气量1：1.1～1.4v/v/min，搅拌，发酵过程溶氧30%以上，培养20hr开始补入糖、植物油、正丙醇，经160～170hr培养得含有红霉素的发酵液。

发酵培养基组成：淀粉3.5%，糊精1.5%，黄豆饼粉3.5%，硫酸铵0.2%，玉米浆0.4%，氯化钠0.3%，碳酸钙0.7%，豆油0.2%，其余为水；在122～124℃，保压30分钟。

过程补料：

葡萄糖40%，发酵过程中需要补入发酵液体积的30～40%,流加补入，控制pH6.8～7.0。

正丙醇浓度40%，其补入量以始终控制发酵液中丙醇含量0.03～0.06%为宜。

植物油的补入量以控制发酵液中残油0.06～0.08%为宜。

检测指标：放罐效价8165u/ml,红霉素E效价632u/ml。

Claims (5)

1.一种利用红色链霉菌发酵生产红霉素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于

所述种子培养基组成为：淀粉1～3%，玉米浆2～4%，硫酸铵0.15～0.55%，轻质碳酸钙0.3～0.8%，硫酸锌0.01～0.03%，硫酸镁0.1～0.3%，适量消沫剂，其余为水，以重量百分比计；

所述发酵培养基组成为：淀粉2.0～4.0%，玉米浆2.0～4.0%，硫酸铵0.1～0.4%，碳酸钙0.7～1.0%，硫酸镁0.05～0.3%，硫酸锌0.01～0.05%，适量消沫剂，其余为水，按重量体积比计。

2.一种按照权利要求1所述培养基发酵生产红霉素的发酵方法，其特征在于采用由种子培养和发酵培养构成的二级发酵模式发酵生产红霉素。

3.按照权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述种子培养条件为：培养温度33～35℃，通气量1：0.7～1.0v/v/min，培养时间40～50hr。

4.按照权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为：培养温度32～36℃，溶氧大于30%，培养时间160～180hr。

5.按照权利要求2或4所述的发酵方法，其特征在于，在所述发酵培养过程中进行补料，包括补氨、补糖和补正丙醇，

其中补氨：当发酵液中氨基氮含量降至30%以下时开始通入氨水，控制发酵液中氨基氮含量15～30%，氨水质量浓度为10～15%；

补糖：当发酵液中总糖降至1.5%以下时开始补入葡萄糖溶液，控制发酵液中总糖0.5～1.5%，葡萄糖溶液质量浓度为20～30%；

补正丙醇是指在发酵20hr后补入质量浓度为30～35%的正丙醇，控制发酵液中正丙醇含量0.01～0.05%。