CN102796680B

CN102796680B - 一种玫瑰孢链霉菌及其利用组合前体生产达托霉素的方法

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Publication number: CN102796680B
Application number: CN201210230623.9A
Authority: CN
Inventors: 赵志全; 郭朝江; 夏燕; 王召娜
Original assignee: Lunan New Time Bio Tech Co ltd
Current assignee: Lunan New Time Bio Tech Co ltd
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2032-07-04
Also published as: CN102796680A

Abstract

本发明公开了一种链霉菌及利用该链霉菌生产达托霉素的方法。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5956，本发明在合适发酵条件下培养链霉菌CGMCC No.5956，通过加入癸酸和癸醛组合物作为前体发酵生产达托霉素。采用本发明所述链霉菌生产达托霉素的方法，目标产物达托霉素的效价高，资源利用率高、生产成本低，有利于工业化规模生产。

Description

一种玫瑰孢链霉菌及其利用组合前体生产达托霉素的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种玫瑰孢链霉菌（Streptomycesroseosporus.）及其利用组合前体生产达托霉素的方法。

背景技术

达托霉素（Daptomycin）是自链霉菌(S.reseosporus)发酵液中提取得到的一个环酯肽类物质，它不仅具有新颖的化学结构，且其药物作用模式也与任一已获准抗生素不同：它能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰阳性菌。达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已呈甲氧西林（Methicillin）、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株也具强力活性。达托霉素结构如下所示：

美国专利U.S.Pat.No.4331594和U.S.Pat.No.4800157分别首次报道利用玫瑰孢链霉菌NRRL11397和NRRL15998进行深层发酵生产达托霉素的方法。其中NRRL11397即ATCC31568;NRRL15998是NRRL11397的突变株。

达托霉素结构中含有正癸酰侧链，天然发酵产物中含有正癸酰侧链的达托霉素效价很低。专利U.S.Pat.No.4885243公开了一种采用分批补料发酵生产达托霉素的方法，该方法通过补加正癸酸来刺激合成达托霉素的侧链正癸酰，由于正癸酸在发酵温度下易凝固，该方法使用油酸甲酯作为溶剂溶解正癸酸，但油酸甲酯几乎不被生产菌利用，该方法造成严重的资源浪费，并明显增加下游提取的难度和提取成本。

Gianluca BETRETTI在专利US.20100047873A1中采用补加正癸醛来代替补加正癸酸和油酸甲酯组合物作为发酵生产达托霉素的前体，但由于补加正癸醛时容易引起发酵过程中泡沫增多，致使发酵罐利用效率不高。

国内在生产达托霉素上使用发酵法较多，但达托霉素产量较低，造成生产成本较高。本发明提供一种新的达托霉素生产菌株及利用其生产达托霉素的方法。

发明内容

在上述背景下，本发明的目的是提供一株高产达托霉素的生产菌，玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206：CGMCC NO.5956。本发明还请求保护该菌株的一种用途，即玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206：CGMCC NO.5956在发酵生产达托霉素中的用途。该菌株用于达托霉素发酵生产，具有目标产物产量高，菌株生产稳定性高的特点，适合在工业中推广使用。

本发明还有一个目的是提供一种应用该菌株生产达托霉素的方法，该方法克服了现有达托霉素生产技术的不足，用癸醛替代油酸甲酯作为溶解癸酸的溶剂，即通过补加癸酸和癸醛组合前体生产达托霉素。该方法去掉了生产过程中难以利用的有机溶剂，减少了资源浪费，减低了下游提取难度，同时在保证达托霉素产量的基础上提高了发酵罐容量，降低了生产成本。

为达到上述目的，本发明的具体实施过程如下：

本发明的发明者从山东地区的土壤中分离得到一株微生物菌株，经过分类鉴定命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces reseosporus.）NTG1206，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册的编号是CGMCC No.5956，保藏日期为2012年4月6日。经过长期的育种和改良，玫瑰孢链霉菌（Streptomycesreseosporus.）NTG1206具有较高的产达托霉素水平。

玫瑰孢链霉菌（Streptomyces reseosporus.）NTG1206菌株具有下述性质：

（1）菌落形态学特征：

玫瑰孢链霉菌NTG1206菌株在高氏一号琼脂和Bennett’s琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝，柔曲，菌落呈紫粉白色，适当延长培养，菌落颜色加深。

（2）生理与生化特性

a．培养温度：20～40℃，最适温度为30℃；

b．适宜在pH4～8范围内生长，最适生长pH为6.5；

（3）16SrDNA基因序列测定结果：

GGTGGGGGGGGGCTTTACACATGGCAGTCGAACGATGAAATCACTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGCTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGAACAAAGAGCCCGCCCC

只要获得本发明的玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206，并根据本发明提供的该菌株的特性，大量培养该菌株的方法是本技术领域技术人员所熟悉的。

适用于培养玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206的培养基是多种多样的，应理解：只要能够为该菌株提供生长和繁殖所必需的营养成分的培养基都是可用的。现有技术中用于培养其他各种玫瑰孢链霉菌的培养基都适用于本发明的玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206的培养，比如可以采用葡萄糖、糊精、牛肉膏、酵母膏、琼脂制成的培养基。

利用玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206通过添加癸酸和癸醛组合物作为前体发酵制备达托霉素的方法为：在含有可同化的碳、氮源和无机盐的液体培养基中进行深层需氧发酵条件下，将癸酸和癸醛组合前体加入培养液中，在维持具有合成达托霉素能力的微生物适宜生长条件下培养该微生物，合成达托霉素。

该链霉菌较佳的培养条件是：pH6.0～7.0，温度为25～35℃。

本发明癸酸和癸醛组合前体的配比为：保证在培养温度下呈液态的任意比例，优选地重量百分比为：癸酸：癸醛=1：0.5～10。

按配比将癸酸与癸醛混合均匀，膜过滤除菌。

发酵培养基接种培养20h～30h，菌体湿重25g/ml，开始补加组合前体，补加速率为0.1g/L·h～0.2g/L·h，之后每培养24～48h前体补加速率增加0.1g/L·h，直至发酵结束。

本发明与现有技术相比，取得了如下突出的技术效果：

1)本发明筛选到的玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206，能利用多种碳源和氮源发酵生产达托霉素，培养条件粗放，发酵工艺可实施工业化生产。

2)可以避免使用溶解前体癸酸所用的有机溶剂，这些有机溶剂难以被生产菌利用，减少了资源浪费，降低了生产成本，同时降低了下游提取难度。

3)组合前体减轻了单独使用癸酸对菌体的毒性，同时减少了单独使用癸醛引起的泡沫增多，保证了达托霉素合成效率的同时增加了生产效率。

具体实施方式

通过下面给出的实施例，可以更清楚地了解本发明的特征和进步，但本发明不受这些实施例的限制。

实施例1：

在50L发酵罐上利用玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206，补加癸酸和油酸甲酯发酵生产达托霉素。

1 配制液体发酵培养基

种子培养基(g/L)：糊精25，葡萄糖5，豆粕粉18，酵母粉5，KCl0.2，FeSO₄·7H₂O0.001，用20%NaOH调pH7.2。121℃灭菌30min。

发酵培养基(g/L)：糊精50，葡萄糖1.0，豆粕粉20，酵母粉5.0，甘蔗糖蜜7.0，Fe(NH₄)₂(SO₄)₂.6H₂O0.8，KCl0.2，消泡剂0.5。用20%NaOH调pH7.2。121℃灭菌30min。

2 发酵工艺

（1）将玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206接种于斜面培养基上，于30℃好氧培养10天，培养成熟的孢子制备成甘油管，低温保存。

（2）将步骤（1）保存的菌液接种于摇瓶种子培养基，于30℃，230rpm振荡培养30～48h。

（3）将（2）培养成熟的菌液按照发酵罐培养基体积的1～5%接种量接种于发酵培养基中（50L发酵罐，装液量35L），发酵培养条件：30℃，通气量1vvm，搅拌转速150rpm～350rpm，罐压0.05mpa。pH用氨水控制在6.5。

（4）自发酵培养30h，开始补加癸酸：油酸甲酯=1：1，补加速率为0.2g/L.h。

（5）采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母粉溶液，发酵192h达托霉素效价可以达到1530mg/L，发酵液体积33L。

（6）前体补加48h，显微镜下观察菌体形态，能看到明显的空泡和菌丝断裂。

实施例2：

在50L发酵罐上利用玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206，补加癸醛发酵生产达托霉素。

1 培养基同实施例1.

2 发酵工艺

发酵工艺中，50L发酵罐，装液量30L，其余同对比实施例1。

自发酵培养30h，开始补加癸醛，补加速率为0.15g/L.h。

采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母粉溶液。发酵192h达托霉素效价1470mg/L，发酵液体积26L。

补加前体48h，显微镜下观察菌体形态，看不到明显的空泡和菌丝断裂。

实施例3：

在50L发酵罐上利用玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206，补加癸酸和癸醛组合物发酵生产达托霉素。

1 培养基同实施例1.

2 发酵工艺

（4）自发酵培养30h，菌体湿重25g/ml，开始补加癸酸：癸醛=1：1，补加速率为0.15g/L.h。

（5）采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母粉溶液，发酵192h达托霉素效价可以达到1750mg/L，发酵液体积33L。

（6）前体补加48h，显微镜下观察菌体形态，菌丝空泡不明显和菌丝断裂少。

实施例4：

在5000L发酵罐上利用玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206，补加癸酸和癸醛组合物发酵生产达托霉素。

1 配制液体发酵培养基

二级种子培养基(g/L)：糊精25，葡萄糖5，豆粕粉18，酵母粉5，KCl0.2，FeSO₄·7H₂O0.001，用20%NaOH调pH7.2。121℃灭菌30min。

2 发酵工艺

（3）将（2）培养成熟的菌液按照二级种子罐培养基体积的1～5%接种量接种于二级种子罐培养基中（500L发酵罐，装液量300L），二级种子培养条件：30℃，通气量1vvm，搅拌转速80～110rpm，罐压0.05mpa，培养28h。

（4）将（3）培养的菌按照发酵罐培养基体积的1～5%接种量接种于发酵培养基中（5000L发酵罐，装液量3500L），发酵培养条件：25℃，通气量1vvm，搅拌转速60～120rpm，罐压0.05mpa。pH用氨水控制在6.5。

（5）自发酵培养28h，菌体湿重25g/ml，开始补加癸酸：癸醛=1：10，补加速率为0.1g/L.h，每培养24h，前体补加速率增加0.1g/L.h，直至发酵结束。

（6）采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母溶液，发酵206h达托霉素效价可以达到2300mg/L，发酵液体积3300L。

（7）前体补加48h，显微镜下观察菌体形态，菌丝生长良好，着色深，菌丝断裂少。

实施例5：

1 培养基同实施例4.

2 发酵工艺

（1）将玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus.）NTG1206接种于斜面培养基上，于25℃好氧培养10天，培养成熟的孢子制备成甘油管，低温保存。

（3）将（2）培养成熟的菌液按照二级种子罐培养基体积的1～5%接种量接种于二级种子罐培养基中（500L发酵罐，装液量350L），二级种子培养条件：25℃，通气量1vvm，搅拌转速80～110rpm，罐压0.05mpa，培养28h。

（5）自发酵培养30h，菌体湿重25g/ml，开始补加癸酸：癸醛=1：0.5，补加速率为0.2ml/L.h，每培养48h，前体补加速率增加0.1g/L.h，直至发酵结束。

（6）采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母溶液，发酵214h达托霉素效价可以达到2210mg/L，发酵液体积3300L。

实施例6：

1 培养基同实施例4.

2 发酵工艺

（3）将（2）培养的菌按照二级种子罐培养基体积的1～5%接种量接种于二级种子罐培养基中（500L发酵罐，装液量350L），二级种子培养条件：30℃，通气量1vvm，搅拌转速80～110rpm，罐压0.05mpa，培养28h。

（5）自发酵培养20h，菌体湿重25g/ml，开始补加癸酸：癸醛=1：1，补加速率为0.15ml/L.h，每培养36h，前体补加速率增加0.1g/L.h，直至发酵结束。。

（6）采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母溶液，发酵220h达托霉素效价可以达到2550mg/L，发酵液体积3300L。

实施例7：

1 配制液体发酵培养基

2 发酵工艺

（5）自发酵培养28h，菌体湿重25g/ml，开始补加癸酸：癸醛=1：20，补加速率为0.1g/L.h，再培养26h，36h，24h，26h，24h，31h，前体补加速率增加0.1g/L.h，直至发酵结束。

（6）采用岛津LC-20A液相色谱仪检测达托霉素，发酵过程中补加适量糊精和酵母溶液，发酵206h达托霉素效价可以达到2120mg/L，发酵液体积3300L。

基因序列：

Claims

1.玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus.)菌株NTG1206：CGMCC No.5956。

2.玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus.)菌株NTG1206：CGMCC No.5956在发酵生产达托霉素中的应用。

3.一种利用玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus.)CGMCC No.5956发酵生产达托霉素的方法，其特征在于在含有可同化的碳、氮源和无机盐的液体培养基中进行玫瑰孢链霉菌CGMCC No.5956深层需氧发酵，发酵过程中维持玫瑰孢链霉菌CGMCC No.5956适宜发酵条件，发酵过程中向发酵液中补加由癸酸和癸醛组成的组合前体合成达托霉素。

4.根据权利要求3所述发酵生产达托霉素的方法，其特征在于组合前体癸酸与癸醛重量配比为：在培养温度下组合前体呈液态的任意比例。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于组合前体为癸酸：癸醛重量配比为1：0.5～10。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于组合前体的补加时间为发酵开始后20～30h或菌体湿重达25g/ml后，直至发酵结束。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于组合前体的补加速率为0.1g/L·h～0.2g/L·h，每培养24～48h前体补加速率增加0.1g/L·h，直至发酵结束。